本發(fā)明涉及肝癌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種肝癌早期檢測(cè)試劑盒的制備方法。

背景技術(shù)：

原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，位居腫瘤死亡的第二位，我國(guó)每年約有13萬(wàn)人死于肝癌，占全球新發(fā)肝癌人數(shù)的一半以上。大多數(shù)肝癌患者就診時(shí)已屆中、晚期，錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)，早期診斷和早期治療是防治肝瘤和降低死亡率的最有效辦法。目前肝癌的早期診斷主要依靠影像學(xué)檢查與腫瘤標(biāo)志物的測(cè)定，腫瘤標(biāo)志物的測(cè)定具有敏感性、特異性高，痛苦少等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到重視。

腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)主要是通過(guò)免疫學(xué)的方法。在免疫學(xué)分析與檢測(cè)中，由于生物大分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，直接檢測(cè)較困難，所以通常在免疫檢測(cè)體系中引入熒光探針技術(shù)，即用熒光素等小分子標(biāo)記生物大分子，利用適當(dāng)?shù)膬x器檢測(cè)熒光標(biāo)記物的信號(hào)，達(dá)到檢測(cè)的目的。傳統(tǒng)的熒光探針包括異硫氰酸熒光素(fitc)、熒光素、羅丹明(rodam)等。很多生物樣品(如血清)其本身熒光位于400～600nm，而傳統(tǒng)熒光探針的熒光發(fā)射波長(zhǎng)處于可見(jiàn)光區(qū)，二者重疊區(qū)域較大，造成自然本底熒光干擾，影響檢測(cè)的敏感性，而且傳統(tǒng)熒光探針存在非特異性吸附，嚴(yán)重阻礙免疫熒光技術(shù)的發(fā)展。且傳統(tǒng)的藻膽蛋白熒光探針的制備多采用化學(xué)交聯(lián)技術(shù)?；瘜W(xué)交聯(lián)是指在熱、光、高能輻射、超聲波、機(jī)械力、交聯(lián)劑等作用下，利用化學(xué)鍵將大分子鏈連結(jié)起來(lái)，形成體形或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)高分子的過(guò)程。如果采用化學(xué)交聯(lián)技術(shù)將藻膽蛋白和酶標(biāo)記，則反應(yīng)后酶的活性可能會(huì)降低，而且化學(xué)交聯(lián)的前期準(zhǔn)備工作較復(fù)雜，需要單獨(dú)純化各種交聯(lián)原材料，交聯(lián)副產(chǎn)物較多。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于此，有必要提供一種靈敏度高、副產(chǎn)物少的的肝癌早期檢測(cè)試劑盒的制備方法。

一種肝癌早期檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

將肝癌表面抗原用pbst溶液配制成濃度為0.1-100ng/ml的肝癌表面抗原溶液，置于4-6℃?zhèn)溆茫?/p>

將抗所述肝癌表面抗原的單克隆抗體用pbst溶液配制成濃度為5-10μg/ml抗肝癌表面抗原的單克隆抗體溶液，置于4-6℃?zhèn)溆茫?/p>

將熒光酶標(biāo)板用所述抗肝癌表面抗原的單克隆抗體溶液在4-6℃包被16-20小時(shí)，棄去溶液；

將所述熒光酶標(biāo)板用pbst溶液沖洗；

將所述熒光酶標(biāo)板采用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的脫脂牛奶或小牛血清白蛋白的pbst溶液在4-6℃進(jìn)行非結(jié)合位點(diǎn)的封閉；

將所述熒光酶標(biāo)板用pbst溶液沖洗；

在所述熒光酶標(biāo)板中，每孔中加入所述肝癌表面抗原溶液，于20-24℃孵育1-2小時(shí)；

將所述熒光酶標(biāo)板用pbst溶液沖洗；

在所述熒光酶標(biāo)板中，每孔中加入生物素化的抗肝癌表面抗原的單克隆抗體的pbst溶液，于20-24℃孵育1-2小時(shí)；

將所述熒光酶標(biāo)板用pbst溶液沖洗；

在所述熒光酶標(biāo)板中，每孔加入重組藻藍(lán)蛋白亞基的pbst溶液，于20-24℃孵育1-2小時(shí)；

將所述熒光酶標(biāo)板用pbst溶液沖洗，得到所述肝癌早期檢測(cè)試劑盒。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述pbst溶液包含有20mmkh2po4、100mmna2hpo4·12h2o、1.37mnacl、27mmkcl和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05％的吐溫20，ph為7.4。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述肝癌表面抗原為afp或cea。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述熒光酶標(biāo)板為96孔板或48孔板。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述重組藻藍(lán)蛋白亞基包括藻膽蛋白蛋白亞基、色基、麥芽糖結(jié)合蛋白、鏈霉親和素核心蛋白。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，將熒光酶標(biāo)板用所述抗肝癌表面抗原的單克隆抗體溶液在4-6℃包被16-20小時(shí)，棄去溶液的步驟中，所述抗肝癌表面抗原的單克隆抗體溶液的用量為200-250μl。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，在所述熒光酶標(biāo)板中，每孔中加入所述肝癌表面抗原溶液，于20-24℃孵育1-2小時(shí)的步驟中，所述肝癌表面抗原溶液的用量為100μl。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述生物素化的抗所述肝癌表面抗原的單克隆抗體溶液的終濃度為5-10μg/ml，用量為100μl。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述重組藻藍(lán)蛋白亞基的pbst溶液的終濃度為30-50μg/ml，用量為100μl。

上述采用重組藻藍(lán)蛋白亞基制備肝癌早期檢測(cè)試劑盒的制備方法，與常規(guī)的酶法檢測(cè)試劑盒相比，減少了加入化學(xué)底物顯色的步驟，具有操作步驟相對(duì)簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)；減少了捕獲抗體和檢測(cè)抗體的不必要標(biāo)記，降低了反應(yīng)成本；由于標(biāo)記檢測(cè)抗體重組藻藍(lán)蛋白的定向標(biāo)記，減少了反應(yīng)中可能存在的副產(chǎn)物少，具有檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性好，數(shù)值穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)。且由于重組藻藍(lán)蛋白亞基熒光量子效率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，因此，制備得到的肝癌早期檢測(cè)試劑盒穩(wěn)定性好，熒光性能好，靈敏度高。

附圖說(shuō)明

圖1為使用雙功能鏈霉抗生物素蛋白-藻膽蛋白的肝癌早期檢測(cè)試劑盒的制備流程圖；

圖2為圖1為使用雙功能鏈霉抗生物素蛋白-藻膽蛋白的肝癌早期檢測(cè)試劑盒的原理示意圖；

圖3為制備的重組藻藍(lán)蛋白亞基sa-pca-pcb的吸收和鋅染色光譜圖；

圖4為使用制備的檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)肝癌表面抗原的抗原濃度與熒光值線性對(duì)照?qǐng)D。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)例僅以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

請(qǐng)參考圖1和圖2，一實(shí)施方式的肝癌早期檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

s10、將肝癌表面抗原用pbst溶液配制成濃度為0.1-100ng/ml的肝癌表面抗原溶液，置于4-6℃?zhèn)溆谩?/p>

其中，肝癌表面抗原可以為癌胚抗原(afp)或甲胎蛋白(cea)。

其中，pbst溶液包含有20mmkh2po4、100mmna2hpo4·12h2o、1.37mnacl、27mmkcl、和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05％(v/v)的吐溫20，ph為7.4。

s20、將抗肝癌表面抗原的單克隆抗體用pbst溶液配制成濃度為5-10μg/ml抗肝癌表面抗原的單克隆抗體溶液，置于-4-6℃?zhèn)溆谩?/p>

當(dāng)肝癌表面抗原為afp時(shí)，抗肝癌表面抗原的單克隆抗體即為抗afp的單克隆抗體。當(dāng)肝癌表面抗原為cea時(shí)，抗肝癌表面抗原的單克隆抗體即為抗cea的單克隆抗體。

可以理解，步驟s10和步驟s20可以同時(shí)進(jìn)行，也可以先進(jìn)行s10，制備肝癌表面抗原溶液后，再進(jìn)行步驟s20制備抗肝癌表面抗原的單克隆抗體溶液。

s30、將熒光酶標(biāo)板(elisa板)用抗肝癌表面抗原的單克隆抗體溶液在4-6℃包被16-20小時(shí)，棄去溶液。

熒光酶標(biāo)板板可以為常規(guī)的不含熒光素的96孔板或48孔板。

抗肝癌表面抗原的單克隆抗體溶液的終濃度為5-10μg/ml，用量為200-250μl。

s40、將elisa板用pbst溶液沖洗。

將elisa板用pbst溶液沖洗時(shí)，溫和沖洗3-5次，每次5-6分鐘。

s50、將elisa板采用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％(m/v)的脫脂牛奶或小牛血清白蛋白的pbst溶液在4-6℃進(jìn)行非結(jié)合位點(diǎn)的封閉。

s50中，封閉的操作為過(guò)夜封閉。

s60、將elisa板用pbst溶液沖洗。

將elisa板用pbst溶液沖洗時(shí)，溫和沖洗3-5次，每次5-6分鐘。

s70、在elisa板中，每孔中加入肝癌表面抗原的溶液，于20-24℃孵育1-2小時(shí)。

肝癌表面抗原的溶液采用s10制備。肝癌表面抗原的溶液的終濃度為0.1-100ng/ml，用量為100μl。

s80、將elisa板用pbst溶液沖洗。

將elisa板用pbst溶液沖洗時(shí)，溫和沖洗3-5次，每次5-6分鐘。

s90、在elisa板中，每孔中加入生物素化的抗肝癌表面抗原的單克隆抗體的pbst溶液，于20-24℃孵育1-2小時(shí)。

生物素化的抗肝癌表面抗原的單克隆抗體的pbst溶液的終濃度為5-10μg/ml，用量為100μl。

s100、將elisa板用pbst溶液沖洗。

將elisa板用pbst溶液沖洗時(shí)，溫和沖洗3-5次，每次5-6分鐘。

s110、在elisa板中，每孔加入重組藻藍(lán)蛋白亞基的pbst溶液，于20-24℃孵育1-2小時(shí)。

重組藻藍(lán)蛋白亞基的pbst溶液的終濃度為30-50μg/ml，用量為100μl。

重組藻藍(lán)蛋白亞基包括藻膽蛋白蛋白亞基、色基、麥芽糖結(jié)合蛋白、鏈霉親和素核心蛋白。

在其中一個(gè)實(shí)施方式中，重組藻藍(lán)蛋白亞基采用如下方法制備，具體如下：

(1)用基因工程的方法，將麥芽糖結(jié)合蛋白基因(mbp)或其同源基因或其他類型的蛋白標(biāo)簽基因、藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白亞基基因(cpca)或其同源或類似基因、核心鏈霉親和素基因(sa)或其同源或其他標(biāo)簽基因、藻藍(lán)蛋白裂合異構(gòu)酶e和f編碼基因(cpce和cpcf)或其同源基因克隆至同一啟動(dòng)子下；將血紅素加氧酶1基因(hox1)或同源基因、藻藍(lán)素鐵氧還蛋白還原酶基因(pcya)或其同源基因置于另一啟動(dòng)子下，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pmac；

(2)將步驟(1)的表達(dá)質(zhì)粒pmac轉(zhuǎn)入相應(yīng)的宿主菌，得到工程菌株bmac；利用常規(guī)的發(fā)酵工程方法培養(yǎng)，利用優(yōu)化的誘導(dǎo)條件進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，采用優(yōu)化的制備方法進(jìn)行融合蛋白的純化制備；

步驟(2)的誘導(dǎo)條件為，誘導(dǎo)劑為iptg、乳糖、半乳糖中的一種或兩種以上，誘導(dǎo)劑的終濃度為0.1～5.5mmol/l，誘導(dǎo)溫度為18～25℃，誘導(dǎo)時(shí)間為8～24h；

步驟(2)的蛋白純化制備方法為，冰浴超聲破碎、硫酸銨分級(jí)沉淀，蛋白親和層析柱純化。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，重組藻藍(lán)蛋白亞基采用如下的方法制備，具體如下：

(1)用基因工程的方法，將藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白亞基基因(cpca)或其同源或類似基因與核心鏈霉親和素基因(sa)或其同源或其他標(biāo)簽基因利用蛋白linker連接，與藻藍(lán)蛋白裂合異構(gòu)酶e和f編碼基因(cpce和cpcf)或其同源基因克隆至同一啟動(dòng)子下；將血紅素加氧酶1基因(hox1)或其同源基因、藻藍(lán)素鐵氧還蛋白還原酶基因(pcya)或其同源基因置于另一啟動(dòng)子下，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pac；

(2)將步驟(1)的表達(dá)質(zhì)粒pac轉(zhuǎn)入相應(yīng)的宿主菌，得到工程菌株bac；利用常規(guī)的發(fā)酵工程方法培養(yǎng)，利用優(yōu)化的誘導(dǎo)條件進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，采用優(yōu)化的制備方法進(jìn)行融合蛋白的純化制備；

步驟(2)的誘導(dǎo)條件為，誘導(dǎo)劑為iptg、乳糖、半乳糖中的一種或兩種以上，誘導(dǎo)劑的終濃度為0.1～5.5mmol/l，誘導(dǎo)溫度為18～25℃，誘導(dǎo)時(shí)間為8～24h；

步驟(2)的蛋白純化制備方法為，冰浴超聲破碎、硫酸銨分級(jí)沉淀，蛋白親和層析柱純化。

制備的重組藻藍(lán)蛋白亞基經(jīng)sds-page分析顯示分子量約為35kda，通過(guò)zn²⁺染色，證明蛋白質(zhì)含有色基(圖3所示)。熒光分析顯示具有藻藍(lán)蛋白所特有的624nm吸收峰和646nm發(fā)射峰(圖4所示)。

s120、將熒光酶標(biāo)板用pbst溶液沖洗，得到肝癌早期檢測(cè)試劑盒。

因重組藻藍(lán)蛋白亞基在624nm處有較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，將制備得到的肝癌早期檢測(cè)試劑盒在624nm處檢測(cè)熒光值。

如圖4所示，利用重組藻藍(lán)蛋白制備的肝癌檢測(cè)試劑盒，其在afp和cea終濃度為0-50ngng/ml的范圍內(nèi)具有很好的線性關(guān)系。

來(lái)自海洋藻類的藻膽蛋白及其眾多的共價(jià)偶聯(lián)物是新一代性能優(yōu)良的熒光探針，有很高的摩爾消光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率，其紅橙色的特征熒光能避開(kāi)很多生物環(huán)境的自然本底熒光干擾，檢測(cè)靈敏度優(yōu)于傳統(tǒng)熒光探針。藻膽蛋白熒光探針克服了傳統(tǒng)熒光標(biāo)記物合成中產(chǎn)生有害物質(zhì)和長(zhǎng)時(shí)間保存后結(jié)合蛋白質(zhì)能力減弱或者消失等缺點(diǎn)。重組藻藍(lán)蛋白亞基，具有熒光量子效率高、穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，且共價(jià)融合親和素標(biāo)簽，可替代系列化學(xué)染料，在免疫學(xué)、診斷用熒光標(biāo)記、生物醫(yī)學(xué)研究等方面具有廣泛應(yīng)用。此外，藻膽蛋白無(wú)毒性、環(huán)境友好、易與蛋白質(zhì)等生物分子交聯(lián)，具有良好市場(chǎng)前景。

上述肝癌早期檢測(cè)試劑盒的制備方法，采用的蛋白質(zhì)工程方法取代了繁瑣、低效的化學(xué)交聯(lián)，降低了反應(yīng)成本，而且不需要單獨(dú)純化各種原材料蛋白。利用基因工程方法，通過(guò)大規(guī)模發(fā)酵，可以較低成本制備藻膽蛋白的單一亞基或多聚體，再通過(guò)蛋白質(zhì)工程技術(shù)，進(jìn)一步提高其穩(wěn)定性，改善熒光特性。

上述采用重組藻藍(lán)蛋白亞基制備肝癌早期檢測(cè)試劑盒的制備方法，簡(jiǎn)單易操作，降低了反應(yīng)成本，且制備得到的肝癌早期檢測(cè)試劑盒，穩(wěn)定性好，熒光性能好，靈敏度高。

下面為具體實(shí)施例部分。

實(shí)施例1

將肝癌表面抗原afp用pbst溶液配制成濃度為0.1ng/ml的肝癌表面抗原afp溶液，置于4℃?zhèn)溆?。其中，pbst溶液包含有20mmkh2po4、100mmna2hpo4·12h2o、1.37mnacl、27mmkcl、0.05％(v/v)吐溫20，ph為7.4。

將抗afp的單克隆抗體用pbst溶液配制成濃度為10μg/ml抗afp的單克隆抗體溶液，置于-4℃?zhèn)溆谩?/p>

將96孔板用200μl的終濃度為10μg/ml的抗afp的單克隆抗體溶液在4℃包被20小時(shí)，棄去溶液。

將96孔板用pbst溶液溫和沖洗3次，每次6分鐘。

將96孔板采用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％(m/v)的脫脂牛奶的pbst溶液在4℃進(jìn)行非結(jié)合位點(diǎn)的過(guò)夜封閉。

將96孔板用pbst溶液溫和沖洗3次，每次6分鐘。

在96孔板中，每孔中加入100μl的終濃度為0.1ng/ml的肝癌表面抗原afp溶液，于20℃孵育2小時(shí)。

將96孔板用pbst溶液溫和沖洗3次，每次6分鐘。

在96孔板中，每孔中加入100μl終濃度為100ng/ml的生物素化的抗肝癌表面抗原afp的單克隆抗體的pbst溶液，于20℃孵育2小時(shí)。

將96孔板用pbst溶液溫和沖洗3次，每次6分鐘。

在96孔板中，每孔加入100μl的終濃度為30μg/ml的重組藻藍(lán)蛋白亞基溶液，于20℃孵育2小時(shí)。

將96孔板用pbst溶液沖洗，得到肝癌早期檢測(cè)試劑盒。

將得到的肝癌早期檢測(cè)試劑盒用熒光酶標(biāo)儀(biotekelx800tm、fluoroskanascent等)，檢測(cè)624nm熒光值，定量檢測(cè)肝癌表面抗原afp。其檢測(cè)限度為1.01ng/ml。重復(fù)性較好。

實(shí)施例2

將肝癌表面抗原cea用pbst溶液配制成濃度為100ng/ml的肝癌表面抗原cea溶液，置于6℃?zhèn)溆?。其中，pbst溶液包含有20mmkh2po4、100mmna2hpo4·12h2o、1.37mnacl、27mmkcl、0.05％(v/v)吐溫20，ph為7.4。

將抗cea的單克隆抗體用pbst溶液配制成濃度為5μg/ml抗cea的單克隆抗體溶液，置于-4℃?zhèn)溆谩?/p>

將96孔板用250μl的終濃度為5μg/ml的抗cea的單克隆抗體溶液在4℃包被20小時(shí)，棄去溶液。

將96孔板用pbst溶液溫和沖洗5次，每次5分鐘。

將96孔板采用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％(m/v)的小牛血清白蛋白的pbst溶液在4℃進(jìn)行非結(jié)合位點(diǎn)的過(guò)夜封閉。

將96孔板用pbst溶液溫和沖洗5次，每次5分鐘。

在96孔板中，每孔中加入100μl的終濃度為100ng/ml的肝癌表面抗原cea的pbst溶液，于24℃孵育1小時(shí)。

將96孔板用pbst溶液溫和沖洗5次，每次5分鐘。

在96孔板中，每孔中加入100μl的終濃度為10μg/ml的生物素化的抗肝癌表面抗原cea的單克隆抗體的pbst溶液，于24℃孵育1小時(shí)。

將96孔板用pbst溶液溫和沖洗5次，每次5分鐘。

在96孔板中，每孔加入100μl的終濃度為50μg/ml的重組藻藍(lán)蛋白亞基溶液，于24℃孵育1小時(shí)。

將96孔板用pbst溶液沖洗，得到肝癌早期檢測(cè)試劑盒。

將得到的肝癌早期檢測(cè)試劑盒用熒光酶標(biāo)儀(biotekelx800tm、fluoroskanascent等)，檢測(cè)624nm熒光值，定量檢測(cè)肝癌表面抗原于檢測(cè)肝癌表面抗原cea，其檢測(cè)限度為1.01ng/ml。重復(fù)性較好。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。