本發(fā)明涉及一種檢測肽?；彼崦搧啺泵赣蒙飩鞲衅骷捌渲苽浞椒ê蛻?yīng)用。

背景技術(shù)：

肽?；彼崦搧啺泵甘氢}離子依賴的翻譯后的一種家族酶，可以催化肽?；彼釟埢D(zhuǎn)變?yōu)殡孽；习彼釟埢?。pad異構(gòu)體分別為pad1，pad2，pad3，pad4，和pad6，其中pad4是這些同工體中唯一一個位于細(xì)胞核中的酶。pad4可以催化組蛋白h2a，h3和h4中的精氨酸殘基發(fā)生瓜氨酸化，因此可以調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄，分化和全能性。最近研究發(fā)現(xiàn)pad4的異常表達會導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，通過蛋白瓜氨酸化的過程，細(xì)胞內(nèi)高水平的pad4活性與疾病惡化自身抗體的產(chǎn)生有關(guān)。除此之外，在人類癌癥中如肺癌，乳腺癌和骨癌中也發(fā)現(xiàn)大量過量表達的pad4。所以對pad4的檢測引起了研究者對其的關(guān)注。

超分子化學(xué)是根據(jù)分子互補的原則來研究兩個或更多分子的特定關(guān)聯(lián)。主-客體相互作用是超分子化學(xué)的典型例子。該文章是采用具有剛性大環(huán)結(jié)構(gòu)的葫蘆脲作為主體分子，多肽鏈作為客體分子，通過主-客體相互作用自組裝分子，使信號放大進而實現(xiàn)對靶標(biāo)蛋白的檢測。

雖然研究表明pad4的異常表達與相關(guān)疾病的診斷和治療相關(guān)，但是對pad4催化蛋白瓜氨酸化的生理機能迄今為止知之甚少。目前為止只有一些分析方法來檢測pad酶，如比色法，sds-paeg，和熒光，大部分還是依賴于熒光技術(shù)。但是熒光標(biāo)記過程很復(fù)雜和很容易受到外界環(huán)境的干擾，這些方法也難操作復(fù)雜，檢測靈敏度也不高，很難用于實時檢測與分析。因此電化學(xué)分析方法由于高靈敏性，操作簡單和響應(yīng)快，已經(jīng)成為一門流行的檢測技術(shù)。多肽可以作為原件來構(gòu)建有效的生物傳感器，超分子化學(xué)輔助的主-客體相互作用可以實現(xiàn)多肽分子自組裝，從而實現(xiàn)信號識別與放大。銀納米顆粒通過與多肽鏈相互作用，在葫蘆脲大分子的輔助下把信號連接在體系中。pad4可以催化多肽鏈中精氨酸殘基瓜氨酸化作用生成瓜氨酸殘基，此時也借助胰蛋白酶的引入，該酶可以水解賴氨酸或精氨酸c端的羧基，因此可用于輔助驗證精氨酸瓜基化修飾過程。所以，通過該方法技術(shù)手段檢測pad4的活性以及抑制劑的作用效果，為檢測pad4提供了一個新穎的電化學(xué)方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種肽酰基精氨酸脫亞氨酶檢測用生物傳感器。

本發(fā)明的目的之二提供該傳感器的制備方法。

本發(fā)明的目的之三在于提供采用該傳感器檢測肽?；彼崦搧啺泵傅姆椒ā?/p>

本發(fā)明是采用電化學(xué)技術(shù)對肽?；彼崦搧啺泵柑禺愋院挽`敏性的檢測。為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的機理如下：

多肽鏈1序列為fgggrgac通過c端半胱氨酸的巰基以金-硫鍵的方式結(jié)合在金電極的表面上，多肽鏈2序列為fggggc也通過半胱氨酸的巰基與銀納米顆粒結(jié)合，在超分子葫蘆脲8的輔助下，其可以結(jié)合兩條多肽鏈fgg端，進而把多肽鏈2功能化的銀納米顆粒連接在電極表面上，這樣才可以表征電化學(xué)信號。胰蛋白酶可以催化賴氨酸或精氨酸c端的羧基，故其可以催化裂解多肽鏈1中的精氨酸殘基中的羧基，此時多肽鏈fgg片段脫離電極表面，這樣葫蘆脲8就不能捕捉到fgg序列，修飾多肽鏈2的銀納米顆粒就不能連接在電極上，得到的電化學(xué)響應(yīng)也很低。精氨酸脫亞氨酶可以催化肽酰精氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)殡孽９习彼釟埢?，故在pad4存在的條件下可以催化多肽鏈1中精氨酸發(fā)生瓜氨酸化作用。保護了多肽鏈1中的精氨酸免于胰蛋白酶的催化裂解，進而功能化的銀納米顆?？梢酝ㄟ^葫蘆脲8結(jié)合兩段多肽鏈上的fgg序列結(jié)合在電極上，得到很強的電化學(xué)信號。pad4是一種鈣離子依賴的酶，鈣離子的結(jié)合可以是pad4的構(gòu)象發(fā)生改變，進而表現(xiàn)出催化活性。酶都有一定的活性，氯脒是一種不可逆的pad4失活劑。在抑制劑存在的條件下，pad4失去活性則胰蛋白酶就可以催化裂解精氨酸。不同濃度的pad4可以根據(jù)固定在電極上的銀納米顆粒的多少，采用線性掃描伏安法的方法測定峰電流值的大小，從而實現(xiàn)定量檢測pad4的目的。

根據(jù)上述機理，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種肽?；彼崦搧啺泵笝z測用生物傳感器，其特征在于該傳感器是在金電極表面上修飾一條多肽鏈1，在銀納米顆粒表面修飾多肽鏈2，通過葫蘆脲[8]介導(dǎo)的超分子作用可以結(jié)合芳香族氨基酸，即葫蘆脲[8]結(jié)合多肽鏈1和多肽鏈2n末端的fgg，進而把兩條多肽鏈連接在電極上。所述的多肽鏈1序列為fgggrgac；多肽鏈2序列為fggggc。

一種制備上述的肽?；彼崦搧啺泵笝z測用生物傳感器的方法，其特征在于該方法的具體步驟如下：將預(yù)處理過的金電極浸沒在修飾電極的反應(yīng)液中，4℃反應(yīng)16-18h，即得到肽酰基精氨酸脫亞氨酶檢測用生物傳感器；每100μl所述的修飾反應(yīng)液由50μl、10μm的多肽1、30μl、10mm的pbs和20μl、50mm的tcep組成。

上述的金電極的預(yù)處理的方法為：將金電極用砂紙和含有顆粒大小為1.0μm、0.3μm和0.05μm的鋁粉的麂皮上打磨和拋光之后，將電極分別在無水乙醇和超純水中超聲3min，然后用配置好的水虎魚，即濃硫酸：過氧化氫=3:1的體積比的混合液，每根電極滴50μl，凈化金電極，去除殘留的雜質(zhì)；最后經(jīng)過0.5m的h2so4活化。

一種肽?；彼崦搧啺泵傅臋z測方法，采用三電極檢測系統(tǒng)，其中飽和甘汞電極作為參比電極，鉑絲作為對電極，工作電極采用上述的肽?；彼崦搧啺泵笝z測用生物傳感器，其特征在于該方法的具體步驟為：

a．每50μl反應(yīng)體系中含有50mm的tris-hcl、10mm的cacl2、0.005nm～200nm的pad4，ph=7.6，將金電極浸沒在該反應(yīng)體系中，在37℃恒溫溫育2h；

b．把步驟a所得金電極浸沒在200μl的10mg/ml的胰蛋白緩沖液溶液中，在37℃的條件下反應(yīng)1h；所述的胰蛋白酶的緩沖液配方為：50mm的tris-hcl，20mm的cacl2，ph8.4；

c．將步驟b所得的金電極浸沒在5μm的葫蘆脲8溶液中，室溫反應(yīng)1h；

d．將多肽鏈2修飾的銀納米顆粒在15000r，40℃，離心20min，去除未完全修飾上的多肽。再用修飾多肽的緩沖溶液復(fù)溶，將上述電極浸沒在復(fù)溶液中，反應(yīng)2.5h；

e．通過三電極檢測體系，采用線性掃描伏安法的電化學(xué)方法來表征銀納米顆粒的電化學(xué)信號的響應(yīng)。

上述的多肽鏈2修飾銀納米顆粒的方法為：取1440ul的制備好的銀納米顆粒，加入60ul濃度為5um多肽鏈2，在4℃的冰箱修飾16-18h。

本發(fā)明的傳感器利用超分子化學(xué)輔助的信號標(biāo)記方法提高該實驗的靈敏性，可以檢測到pad4的線性范圍為0.005nm至200nm，檢測限為0.79nm，特異性也特別強，可以有效地區(qū)分靶標(biāo)與其他對照蛋白，也可以做到在hl-60細(xì)胞裂解物中檢測到內(nèi)源性pad4的活性。

本發(fā)明方法可以達到靈敏檢測pad4，并能夠有效地區(qū)分其他對照蛋白，以及可以在細(xì)胞中檢測內(nèi)源性pad4。該方法具有簡單、易操作、靈敏高效和高選擇性的檢測方法，為以后進一步研究pad4提供了一種想法思路，也有望將來可以為診斷和治療相關(guān)疾病提供一種檢測手段。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的原理圖。

圖2為在不同修飾條件下的電化學(xué)的線性掃描伏安圖。a為多肽1修飾的電極，b為葫蘆脲8輔助的主客體反應(yīng)使信號放大，c和d分別為胰蛋白催化裂解多肽鏈1中的精氨酸在無pad4存在和有pad4存在的條件下得到的實驗結(jié)果。

圖3為不同濃度的pad4存在情況下得到的電化學(xué)信號變化圖，由a至k分別為pad4的濃度為0.005,0.01,0.05,0.1,0.5,1,5,10,50,100,200nm，隨著pad4濃度的增加，峰電流值也隨著增加。內(nèi)嵌圖為pad4在0.005nm到200nm范圍內(nèi)與電化學(xué)變化值之間的線性關(guān)系圖。

圖4為不同蛋白作為對照得到的電化學(xué)信號響應(yīng)柱狀圖。

圖5為在抑制劑氯脒不同濃度存在的情況下得到的電化學(xué)信號變化圖，從a至f為0,2.5,5,10,25and50μm，隨著抑制劑濃度的增加，抑制pad4的活性增強，得到的峰電流值降低。嵌入圖為抑制劑濃度與抑制率的關(guān)系圖。

圖6為在人急性早幼粒白血病細(xì)胞(hl-60)細(xì)胞核提取物中檢測到pad4的活性，以及在細(xì)胞質(zhì)提取物和抑制劑存在的情況下得到的電化學(xué)信號柱狀圖。

具體實施方式

實施例一：不同修飾條件下的反應(yīng)

首先，金電極用1μm,0.3μmand0.05μm的鋁粉拋光。然后，金電極在乙醇和雙蒸水中各超聲5分鐘。再用水虎魚（h2so4︰h2o2=3︰1）凈化5分鐘，雙蒸水沖去后用0.5mh2so4的電化學(xué)凈化以去除任何剩余的雜質(zhì)。在氮氣吹干后，金電極用來修飾多肽鏈1。4℃反應(yīng)16-18h；每100μl修飾反應(yīng)液由50μl、10μm的多肽1，30μl、10mm的pbs和20μl、50mm的tcep，混合均勻把電極浸沒在溶液中。此時多肽鏈2也與銀納米顆粒進行活化修飾。4反應(yīng)16-18h。60μl的5μm的多肽鏈2加入到1440μl的制備好的銀納米顆粒溶液中。

葫蘆脲8可以通過結(jié)合fgg把兩條多肽鏈連接起來，這樣就可得到很高的銀納米顆粒的電化學(xué)信號。胰蛋白酶催化裂解多肽鏈1中的精氨酸，這樣使fgggr片段脫離電極表面，此時獲得的電化學(xué)信號就很低。在pad4存在的情況下，pad4可以催化精氨酸發(fā)生瓜氨酸化作用。這樣就可以使多肽鏈1免于胰蛋白酶的催化裂解，也可以得到一個很強的電化學(xué)信號響應(yīng)。

實施例二：不同濃度的pad4的檢測

將不同濃度的pad4加到反應(yīng)體系中(0.005nm,0.01nm,0.05nm,0.1nm,0.5nm,1nm,5nm,10nm,50nm,100nm,200nm)結(jié)果如圖3所示。pad4的催化精氨酸發(fā)生瓜氨酸化的活性隨著其濃度增加得到的峰電流值也隨著增加。圖3內(nèi)嵌圖進一步說明了pad4在0.005nm到200nm范圍內(nèi)的線性關(guān)系。線性方程為i(10^-5a)=2.94233+1.12126lgcpad4(nm)，r²=0.993。在三倍噪聲比下得到的檢測限為0.79pm。

實施例三：pad4抑制劑的作用的研究

對于pad4抑制劑的研究，目前普遍是氯脒對其抑制劑的作用機理的研究。氯脒是一種不可逆的pad4失活劑，抑制劑的結(jié)合會破壞pad4活性位點的結(jié)構(gòu)，進而使pad4的活性大大降低。圖4顯示了不同濃度的抑制劑對pad4活性的影響。隨著抑制劑濃度的增加pad4的活性大大降低。嵌入圖表示抑制劑氯脒的濃度與抑制率的關(guān)系。

實施例四：生物傳感器特異性的研究

對照實驗表明了我們檢測方法的特異性。如圖5所示，在pad4存在的條件下獲得較高的峰電流值，而當(dāng)對照蛋白(牛血清白蛋白，肌紅蛋白，血紅蛋白，卵清蛋白，凝血酶)存在的情況下，僅僅獲得很低的峰電流值。即使對照蛋白的濃度1μm遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于pad4的濃度50nm的濃度，由此可見我們的方法具有很好的特異性。

實施例五：在細(xì)胞提取物中檢測內(nèi)源性pad4的活性

在之前的報道中發(fā)現(xiàn)pad4是在細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)的，故我們也研究了該酶在細(xì)胞里的活性。我們選用的是人急性早幼粒白血病細(xì)胞，分離出該細(xì)胞的細(xì)胞核提取物和細(xì)胞質(zhì)提取物，由圖6可見，在細(xì)胞核提取物有表達pad4的活性。pad4是一種鈣離子依賴的酶，在有無鈣離子對照pad4的活性，由圖可知鈣離子對pad4活性的重要性。最后也研究了抑制劑氯脒和二甲胺四環(huán)素對pad4活性的影響。因此，在細(xì)胞中的研究表明了我們的方法有望用于相關(guān)疾病的診斷和治療。

<110>上海大學(xué)

<120>檢測肽?；彼崦搧啺泵赣蒙飩鞲衅骷捌渲苽浞椒ê蛻?yīng)用

<160>2

<210>1

<211>8

<212>多肽

<213>人工序列

<400>1

fgggrgac8

<210>2

<211>6

<212>多肽

<213>人工序列

<400>1

fggggc6