本發(fā)明屬于食品領(lǐng)域，涉及一種食品的安全檢測方法，具體來說是一種檢測生鮮乳中4種巴比妥類鎮(zhèn)靜藥物的方法。
背景技術(shù)：
：巴比妥類(barbiturates)是普遍性中樞抑制藥，包括苯巴比妥(phenobarbital)、戊巴比妥(pentobarbital)、異戊巴比妥(amobarbital)、司可巴比妥(secobarbital)等安眠鎮(zhèn)靜藥物，獸藥臨床用作鎮(zhèn)靜劑和化學(xué)保定，可引起近似生理性睡眠，主要表現(xiàn)在對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制，還能抑制延腦的呼吸中樞及血管運動中樞。抑制中樞神經(jīng)的深度，一般與劑量成比例。小劑量起鎮(zhèn)靜作用，中等劑量有催眠作用，大劑量起麻醉作用。量大時對循環(huán)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)也產(chǎn)生抑制作用，服用過量易造成急性死亡，致死期一般多在服藥后10天左右，長期服用易產(chǎn)生藥物積累，導(dǎo)致死亡。人食入殘留有巴比妥類藥物的動物組織，可導(dǎo)致頭暈、惡心、嘔吐，長期攝入可能產(chǎn)生耐受性和成癮性。許多國家嚴禁將巴比妥藥物用于人類，也禁止其作為飼料添加劑，我國的農(nóng)業(yè)部第178號公告中就明確規(guī)定嚴禁將巴比妥、苯巴比妥、苯巴比妥鈉、戊巴比妥、戊巴比妥鈉添加到飼料和動物飲用水中。此外，獸藥臨床規(guī)定了巴比妥藥物的休藥期，防止動物體內(nèi)該類藥物蓄積濃度過高而影響食用者安全。牛奶的安全質(zhì)量問題關(guān)系國計民生，其中生鮮乳的質(zhì)量控制是牛奶生產(chǎn)的重要前提。然而，從我國國內(nèi)養(yǎng)殖環(huán)境來看，在我國大部分地區(qū)，特別是廣大農(nóng)村地區(qū)的動物和飼料生產(chǎn)過程中仍存在使用違禁獸藥的情況。為了防止巴比妥類藥物在產(chǎn)品化過程中的傳播與積累，將生鮮乳作為重要的一種生物檢材并對其巴比妥類藥物進行檢測對于保障乳制品安全具有重要意義。目前，現(xiàn)有技術(shù)公開的測定巴比妥類藥物殘留的生物檢材主要是人血、血清、血漿、飼料、尿液等其他生物組織。方法主要有薄層色譜法、毛細管電泳法、高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。其中，液相色譜法以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對于巴比妥類藥物的檢測制備要求較低，只要能將巴比妥類藥物制備成溶液且凈化后，就能用于液相分析。另外，液相色譜相對氣相色譜而言，靈敏度高，分析范圍廣，分析時間短等優(yōu)點，近年來已經(jīng)廣泛運用于巴比妥等類別獸藥化合物的分析，且涵蓋的生物檢材也十分廣泛。除此之外，由于不同樣品的基質(zhì)特點不同，預(yù)處理方法會有很大的差異。然而，目前還沒有將生鮮乳作為生物檢材并檢測其中巴比妥類藥物的方法報導(dǎo)。由于生鮮乳中富含蛋白質(zhì)和脂肪，如何對其中可能含有的巴比妥類獸藥化合物進行提取、凈化，提高其在生鮮乳中的回收率和靈敏度已經(jīng)成為亟待解決的問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種檢測生鮮乳中4種巴比妥類鎮(zhèn)靜藥物的方法，所述的這種檢測生鮮乳中4種巴比妥類鎮(zhèn)靜藥物的方法要解決現(xiàn)有技術(shù)在檢測生鮮乳中巴比妥類鎮(zhèn)靜藥物困難的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種檢測生鮮乳中4種巴比妥類鎮(zhèn)靜藥物的方法，包括如下步驟：1)一個對待測新鮮乳中的巴比妥類鎮(zhèn)靜藥物進行預(yù)提取的步驟，將生鮮乳和乙腈溶液混合，震蕩，超聲，加入無機鹽a，離心，所述的生鮮乳、乙腈溶液、無機鹽a的物料比為10～20ml：5～20g：2～10g；上清液采用氮氣吹干，用乙腈水溶液定容，待凈化用；所述無機鹽a為無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、無水氯化鈉、無水碳酸鈉中的任意一種或兩種以上的組合；2)一個凈化的步驟，先用甲醇和乙腈水溶液預(yù)洗柱，將待凈化定容液過柱后，超純水洗柱，真空抽干；然后采用二氯甲烷洗脫，控制流速，洗脫液于氮氣吹干，乙腈水溶液定容，待上機用；凈化所用柱為spe柱；3)將預(yù)處理方法得到的溶液進行高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測分析；所述的高效液相色譜法檢測的流動相為：流動相a：水；流動相b：乙腈；所述的高效液相色譜法檢測的柱溫為25～35℃；所述的高效液相色譜法檢測的待測樣品的流速為0.3～0.6ml/min；所述的高效液相色譜法檢測的進樣體積為5～15μl；所述的高效液相色譜法檢測的梯度洗脫的條件為：所述的質(zhì)譜檢測條件為：離子源：電噴霧離子源；掃描模式：負離子模式；毛細管電壓：3.5kv；離子源溫度：100℃；去溶劑溫度：350℃。進一步的，在一個對待測新鮮乳中的巴比妥類鎮(zhèn)靜藥物進行預(yù)提取的步驟中，將生鮮乳樣品、乙腈溶液混合，震蕩混勻，超聲后加入無機鹽a，離心；取上清液10ml于15ml離心管中，50℃氮氣吹干，用2ml含乙腈水溶液定容，待凈化用；進一步的，在一個凈化的步驟中，將步驟(1)中定容待凈化溶液用spe柱凈化，先用甲醇和乙腈水溶液過柱，控制流速0.5ml/min；將2ml待凈化液過柱后，用超純水洗柱，真空抽干；用二氯甲烷洗脫，控制流速，洗脫液于50℃氮氣吹干，1ml乙腈水溶液定容，過濾，待上機用。進一步的，步驟(1)中，所述的乙腈的添加量為每5～20g待測樣品添加10～20ml；步驟(1)中，所述無機鹽a的添加量為2～10g。進一步的，所述的乙腈溶液中還添加酸；所述的酸為甲酸和/或乙酸；所述酸的添加量為所述乙腈添加量的0.1～0.3％，所述百分比為占乙腈的體積百分比。進一步的，步驟(1)中，所述的震蕩的時間為0.5～3min；步驟(1)中，所述的超聲時間為20～40min；步驟(1)中，所述的離心的轉(zhuǎn)速為5000～10000rpm；步驟(1)中，所述的離心時間為5～15min；進一步的，步驟(2)中所述的spe柱規(guī)格為6ml或150mg；步驟(2)中，所述甲醇、乙腈水、超純水為5～10ml；所述二氯甲烷體積為10～30ml；所述乙腈水溶液濃度為30～50％；所述百分比為占水溶液的體積百分比；步驟(2)中，所述的過濾方法為將溶液經(jīng)有機微孔濾膜過濾。進一步的，步驟(2)中所述的spe柱購買廠家為besep，步驟(2)中，所述的有機微孔濾膜的孔徑為0.22μm。進一步的，所述的高效液相色譜法檢測的色譜柱為hplccshc18柱；所述的色譜柱的規(guī)格為2.1×100mm，1.7μm；所述的高效液相色譜法檢測的待測樣品的流速為0.3ml/min；所述的高效液相色譜法檢測的進樣體積5μl；所述的高效液相色譜法檢測的柱溫為25℃。進一步的，所述的質(zhì)譜檢測過程中，目標(biāo)檢測化合物母離子、子離子、碰撞能、保留時間為：其中，a代表定量離子。進一步的，所述的待測樣品較佳的可能含有苯巴比妥和/或戊巴比妥和/或異戊巴比妥和/或司可巴比妥的生鮮乳。較佳的，所述的生鮮乳為不含有固體顆粒的生鮮乳。進一步的，步驟(1)中，所述的震蕩是為了利于提取，使乙腈進一步提取苯巴比妥和/或戊巴比妥和/或異戊巴比妥和/或司可巴比妥。所述的震蕩的方法和條件為本領(lǐng)域常規(guī)的方法和條件，所述的震蕩的時間較佳的為0.5～3min。進一步的，步驟(1)中，所述的超聲是為了利于提取，使乙腈進一步提取苯巴比妥和/或戊巴比妥和/或異戊巴比妥和/或司可巴比妥。所述的超聲的方法和條件為本領(lǐng)域常規(guī)的方法和條件，所述的超聲的時間較佳的為30～60min。本發(fā)明中，所述的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測的方法為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員均知道，所述的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法為高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜方法。所述的質(zhì)譜的檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式。在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。本發(fā)明解決了復(fù)雜基質(zhì)生鮮乳中巴比妥類獸藥化合物提取、凈化的難題，所設(shè)計的預(yù)處理方法能較好地將生鮮乳中雜質(zhì)去除，高效地提取生鮮乳中巴比妥類藥物，具有較好的回收率；同時該檢測方法對兩種巴比妥類同分異構(gòu)體進行了較好的分離，具有高效、快速、成本低、操作簡便等優(yōu)勢，凈化效果好，靈敏度高，準確度和精確度均符合多殘留分析方法的要求。本發(fā)明方法采用的檢測方法，能同時高效、快速、精確地同時對生鮮乳中苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥4種巴比妥類獸藥化合物進行測定，尤其是對戊巴比妥和異戊巴比妥兩個同分異構(gòu)體具有較高的分辨率。本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進步是顯著的。本發(fā)明彌補現(xiàn)有檢測生鮮乳中巴比妥類化合物的方法的缺失，提供一種靈敏、簡便、快速而準確的能同時測定生鮮乳中多種巴比妥類獸藥化合物的方法。本發(fā)明檢測方法中的預(yù)處理方法能有效地提高生鮮乳中巴比妥類藥物的提取率，且顯著提高了巴比妥類藥物在生鮮乳中的回收率，方法簡便、經(jīng)濟、可靠，有效地降低了生鮮乳的基質(zhì)影響，靈敏度、重復(fù)率和回收率好。附圖說明圖1是高效液相色譜-質(zhì)譜檢測加入苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥的生鮮乳的色譜圖。圖2是高效液相色譜-質(zhì)譜檢測生鮮乳空白樣的色譜圖。圖3是高效液相色譜-質(zhì)譜檢測加入苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥的生鮮乳的色譜圖。具體實施方式下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。實施例1標(biāo)準曲線的制備將苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥和司可巴比妥用甲醇配制成10μg/ml的母液，于-20℃儲藏。臨用時各精確吸取1ml，用甲醇配制成濃度為1μg/ml的混合標(biāo)準溶液10ml，于-20℃儲藏。使用前稱取0μl，50μl，100μl，200μl，500μl，1000μl混合標(biāo)準溶液，50℃氮氣吹干，用空白生鮮乳樣品提取液1ml定容。進樣檢測，制得標(biāo)準曲線。色譜柱：acquitycshc18(2.1×100mm,1.7μm)；柱溫：25℃；流速為0.3ml/min；進樣量：5μl；流動相a：水；流動相b：乙腈；梯度洗脫條件如表1所示表1液相色譜線性梯度洗脫條件時間(min)％a(水)％b(乙腈)0.0090.0010.000.5090.0010.000.6073.5026.504.0073.5026.504.1075.0025.005.5073.5026.506.0073.5026.509.0020.0080.009.1090.0010.0010.0090.0010.00質(zhì)譜檢測條件為：離子源：電噴霧離子源；掃描模式：負離子模式；毛細管電壓：3.5kv；離子源溫度：100℃；去溶劑溫度：350℃；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式；目標(biāo)檢測化合物母離子、子離子、碰撞能、保留時間如表2所示：表24種巴比妥類藥物母離子、子離子、碰撞能、保留時間信息檢測結(jié)果：圖1是高效液相色譜-質(zhì)譜檢測加入苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥的生鮮乳的色譜圖。測定圖1中所對應(yīng)化全物峰面積，以濃度c(ng/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積a為縱坐標(biāo)，繪制苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥的標(biāo)準溶液工作曲線，得標(biāo)準曲線方程及其相關(guān)系數(shù)，如表3所示。表34種巴比妥類藥物線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍實施例2待測樣品的預(yù)處理(1)將10.0g生鮮乳(牧場a)，置于50ml聚丙烯離心管中，加入20ml0.1％乙酸乙腈溶液，震蕩30s，超聲20min；加入2g無水氯化鈉，震蕩3min；5000rpm，離心5min；取10ml上清液于15ml聚丙烯離心管中，50℃氮氣吹干，2ml30％的乙腈水溶液定容，待凈化。(2)將上述定容液過spe小柱。先用5ml甲醇和5ml30％乙腈水溶液預(yù)處理。上述定容液過柱，控制流速在0.5ml/min左右。然后用5ml超純水洗柱，真空抽干15min；用10ml二氯甲烷洗脫，收集洗脫液，于50℃氮氣吹干；1ml30％乙腈水溶液定容，過0.22μl有機濾膜，用于hplc-ms/ms分析。待測樣品中苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥的檢測方法如實施例1所示，經(jīng)過上述預(yù)處理方法和檢測方法，能夠檢測出待測樣品中的苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥。實施例3待測樣品的預(yù)處理(1)將10.0g生鮮乳(牧場b)，置于50ml聚丙烯離心管中，加入20ml0.1％乙酸乙腈溶液，震蕩1min，超聲30min；加入5g無水氯化鈉，震蕩3min；8000rpm，離心10min；取10ml上清液于15ml聚丙烯離心管中，50℃氮氣吹干，2ml30％的乙腈水溶液定容，待凈化。(2)將上述定容液過spe小柱。先用8ml甲醇和8ml30％乙腈水溶液預(yù)處理。上述定容液過柱，控制流速在0.5ml/min左右。然后用8ml超純水洗柱，真空抽干15min；用20ml二氯甲烷洗脫，收集洗脫液，于50℃氮氣吹干；1ml30％乙腈水溶液定容，過0.22μl有機濾膜，用于hplc-ms/ms分析。待測樣品中苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥的檢測方法如實施例1所示，經(jīng)過上述預(yù)處理方法和檢測方法，能夠檢測出待測樣品中的苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥。實施例4待測樣品的預(yù)處理(1)將10.0g生鮮乳(牧場c)，置于50ml聚丙烯離心管中，加入20ml0.1％乙酸乙腈溶液，震蕩3min，超聲40min；加入10g無水氯化鈉，震蕩3min；10000rpm，離心15min；取10ml上清液于15ml聚丙烯離心管中，50℃氮氣吹干，2ml30％的乙腈水溶液定容，待凈化。(2)將上述定容液過spe小柱。先用10ml甲醇和10ml30％乙腈水溶液預(yù)處理。上述定容液過柱，控制流速在0.5ml/min左右。然后用10ml超純水洗柱，真空抽干15min；用30ml二氯甲烷洗脫，收集洗脫液，于50℃氮氣吹干；1ml30％乙腈水溶液定容，過0.22μl有機濾膜，用于hplc-ms/ms分析。待測樣品中苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥的檢測方法如實施例1所示，經(jīng)過上述預(yù)處理方法和檢測方法，能夠檢測出待測樣品中的苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥。對比例1利用sn/t2217中方法檢測生鮮乳中巴比妥類藥物。sn/t2217方法檢測生鮮乳中巴比妥類藥物步驟如下：(1)稱取2g(精確至0.01g)經(jīng)檢測不含目標(biāo)待測物的生鮮乳，置于50ml聚丙烯離心管中，加入200μl1.0μg/ml的混合標(biāo)準工作液靜置5min。加入5g無水硫酸鈉，混勻；加入10ml0.1％乙酸乙腈溶液，渦旋混合3min，超聲10min；4000rpm，離心2min；取上清液于另一50ml聚丙烯離心管中，下層溶液用10ml0.1％的乙酸乙腈重復(fù)提取一次，合并上清液。在提取液中加入5ml乙腈飽和的正己烷，渦旋混合，離心，棄去上層正己烷，下層乙腈氮氣吹干，5ml的0.1mol/l乙酸胺緩沖液：甲醇(90+10，體積比)溶解定容，待凈化。(2)將上述定容液過hlb小柱。先用5ml甲醇和5ml0.1mol/l乙酸胺緩沖液預(yù)處理。上述定容液過柱，控制流速在0.5ml/min左右。然后用5ml0.1mol/l乙酸胺緩沖液：甲醇(90+10，體積比)洗柱，真空抽干15min；隨后用5ml正己烷和5ml正己烷：乙酸乙酯(95+5，體積比)淋洗；最后用10ml正己烷：乙酸乙酯(50+50，體積比)洗脫，氮氣吹干，用1.0ml甲酸溶解殘渣，過0.45μm有機濾膜，供hplc-ms/ms分析。分析條件如實施例1。實驗設(shè)計3個平行。實驗結(jié)果以回收率為指標(biāo)對sn/t2217方法和本發(fā)明方法進行對比，結(jié)果見表5。由表5可以看出，本發(fā)明方法對生鮮乳中巴比妥類藥物的回收率遠高于sn/t2217方法，說明本方法更加適用于生鮮乳類復(fù)雜基質(zhì)中巴比妥類藥物的檢測。效果例1檢出限的測定將實施例1中制備的混合標(biāo)準溶液搖勻，從高濃度往低濃度稀釋，進樣5μl，按實施例1中hplc色譜條件分析。信噪比s/n＝3時所測濃度作為檢出限，信噪比s/n＝10時所測濃度作為定量限。其檢出限和定量限如表4所示。表44種巴比妥類藥物的檢出限和定量限效果例2加標(biāo)回收率的測定稱取10g經(jīng)檢測不含目標(biāo)獸藥化合物的生鮮乳，分別加入1μg/ml的混合標(biāo)準工作液100μl，200μl，400μl，制成10、20、40ng/g生鮮乳三個質(zhì)控濃度水平，每個濃度水平做6個平行樣品，用本發(fā)明方法分別進行樣品前處理和hplc-ms/ms分析，并按照標(biāo)準品色譜峰面積和添加標(biāo)準品提取后測定峰面積計算回收率，結(jié)果見表5。圖2為高效液相色譜-質(zhì)譜檢測生鮮乳空白樣的色譜圖。圖3為高效液相色譜-質(zhì)譜檢測加入苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥和司可巴比妥的生鮮乳的色譜圖。檢測得到苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥濃度在誤差允許范圍內(nèi)。由表5可以看出，4種巴比妥類獸藥化合物在生鮮乳中的回收率在85.04％和111.37％之間，而sn/t2217方法檢測生鮮乳中巴比妥類藥物的回收率在23.65％和43.24％之間，遠遠低于本發(fā)明方法，說明本發(fā)明方法適用于復(fù)雜基質(zhì)生鮮乳中巴比妥類藥物的檢測。表5回收率檢測結(jié)果與對比效果例3精密度的測定按效果例2中同樣實驗設(shè)計，測定并計算回收率。精密度以相對標(biāo)準偏差(rsd)計算，生鮮乳中4種巴比妥類獸藥的相對標(biāo)準偏差見表6。由表6可看知，批內(nèi)相對標(biāo)準偏差在1.09％和9.85％之間，批間相對標(biāo)準偏差在3.88％和7.28％之間，符合多殘留分析的要求。表6精密度實驗結(jié)果以上結(jié)果表明，本方法的預(yù)處理方法是一種對生鮮乳中巴比妥類藥物提取和凈化的良好方法，在待測樣品中苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥殘留檢測中具有重要的應(yīng)用價值。效果例4實際樣品中巴比妥類藥物的檢測將本發(fā)明方法應(yīng)用到不同牧場，共50個生鮮乳盲樣中巴比妥類藥物的檢測，具體實驗步驟按照實施例3進行(標(biāo)準曲線的制作按照實施例1進行)。具體檢測結(jié)果如下：50個生鮮乳盲樣中，共48個陰性產(chǎn)品，檢測出2個陽性產(chǎn)品。結(jié)果見表7(陰性結(jié)果未列出)，此結(jié)果表明，本發(fā)明可有效地檢測生鮮乳中巴比妥類藥物。表7實際生鮮乳盲樣中4種巴比妥類藥的檢測結(jié)果注：nd代表未檢出。當(dāng)前第1頁12