本發(fā)明屬于醫(yī)學檢驗領域，具體涉及一種化學發(fā)光技術(shù)檢測糖化血紅蛋白的方法。

背景技術(shù)：

血紅蛋白是高等生物體內(nèi)負責運載氧的一種蛋白質(zhì)(hb、hgb)。血紅蛋白由四條鏈組成，兩條α鏈和兩條β鏈，每一條鏈有一個包含一個鐵原子的環(huán)狀血紅素。氧氣結(jié)合在鐵原子上，被血液運輸。血紅蛋白的特性是：在氧含量高的地方，容易與氧結(jié)合；在氧含量低的地方，又容易與氧分離。血紅蛋白的這一特性，使紅細胞具有運輸氧的功能。糖化血紅蛋白(hba1c)是人體血液中紅細胞內(nèi)的血紅蛋白與血糖結(jié)合的產(chǎn)物。血糖和血紅蛋白的結(jié)合生成糖化血紅蛋白是不可逆反應，并與血糖濃度成正比，且保持120天左右，糖化血紅蛋白測試通常可以反映患者近8～12周的血糖控制情況?，F(xiàn)階段檢測糖化血紅蛋白的方法有陽離子交換色譜法、免疫分析法等。這些方法仍然有許多不足，例如所需儀器價格昂貴、操作步驟繁瑣、低重現(xiàn)性和易受環(huán)境影響等。鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明利用適體捕獲糖化血紅蛋白，以lumaunps標記適體互補序列dna為探針，以lumaunps—羥胺-o-磺酸化學發(fā)光為檢測體系實現(xiàn)了糖化血紅蛋白的測定，方法具有靈敏度高、選擇性好、簡單的特點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在發(fā)明一種方法簡單、靈敏度高的測定糖化血紅蛋白的方法。

鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種化學發(fā)光技術(shù)檢測糖化血紅蛋白的方法。

實現(xiàn)本發(fā)明目的技術(shù)方案是：

一種化學發(fā)光技術(shù)檢測糖化血紅蛋白的方法。其原理是以魯米諾還原氯金酸，得到魯米諾膠體金納米粒子lumaunps，以適體互補序列dna修飾lumaunps，得化學發(fā)光探針；以磁珠為載體固定適體dna，得dna修飾磁珠；再將化學發(fā)光探針與dna修飾磁珠孵育得化學發(fā)光傳感器；在目標物糖化血紅蛋白存在時，適體dna與糖化血紅蛋白作用，化學發(fā)光探針從磁珠表面脫落；經(jīng)過磁分離后，在分離液中加入羥胺-o-磺酸，以lumaunps—羥胺-o-磺酸為化學發(fā)光體系，進行化學發(fā)光測定，根據(jù)產(chǎn)生的化學發(fā)光實現(xiàn)目標糖化血紅蛋白的測定。

本發(fā)明是通過以下措施來實現(xiàn)的：一種化學發(fā)光技術(shù)檢測糖化血紅蛋白的方法，其特征是包括以下步驟：

(1)魯米諾膠體金納米粒子的制備；

(2)適體dna修飾磁珠的制備；

(3)適體互補序列dna修飾lumaunps的制備；

(4)糖化血紅蛋白的檢測。

優(yōu)選的，所述的魯米諾膠體金納米粒子的制備包括以下步驟：

實驗開始前，將所用的玻璃儀器用hno3/hcl(3:1,v/v)的王水浸泡24h后，用二次蒸餾水沖洗，放入烘箱烘干。取一定量的1％的氯金酸溶液加去離子水稀釋成0.02％的氯金酸溶液并置于三口燒瓶中，在磁力攪拌下加熱回流煮沸；待溶液沸騰后，快速加入0.01ml～5ml0.01m的魯米諾溶液，繼續(xù)加熱煮沸，溶液的顏色由淺黃色變?yōu)楹谏?，最后變成酒紅色，40min后停止加熱，并在繼續(xù)攪拌下冷卻至室溫，得魯米諾膠體金納米粒子，即lumaunps，將制得的lumaunps轉(zhuǎn)移到棕色廣口瓶中，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

優(yōu)選的，所述的適體dna修飾磁珠的制備包括以下步驟：

取10μl～100μl羧基化磁珠溶液放入1.5ml離心管中，用10μl～200μl濃度為0.1m咪唑緩沖液洗滌三次，然后分散到0.01ml～2ml含有0.1medc和0.05mnhs的0.1m咪唑緩沖液中，在37℃條件下，振蕩反應30min；然后向離心管中加入10μl～200μl濃度為5.0×10^-8m適體dna，在37℃條件下振蕩過夜，得到適體dna修飾磁珠，然后再用2.0ml0.1mpbs緩沖溶液清洗三次，最后分散到2.0mlpbs緩沖溶液中，4℃保存。

優(yōu)選的，所述的適體互補序列dna修飾lumaunps的制備包括以下步驟：

將1μl～20μl的tcep加到10μl～200μl濃度為1.0×10^-6m的適體互補序列dna溶液中，37℃振蕩活化1小時，再取100μl～1000μl合成好的lumaunps加入到該溶液中，在37℃條件下震蕩過夜，然后再加入10μl～200μl含0.3mnaclph8.2的10mmtris-hcl緩沖液；繼續(xù)震蕩48h后，在12000rpm的條件下離心30min后，將紅色沉淀用1mlph7.4的0.1mpbs緩沖溶液清洗，再次離心，如此重復三次，得適體互補序列dna修飾lumaunps，即化學發(fā)光探針；最后得到的化學發(fā)光探針分散到1000μlph7.4的0.1mpbs緩沖溶液中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

優(yōu)選的，所述的糖化血紅蛋白的檢測包括以下步驟：

取10μl～200μl適體dna修飾磁珠溶液置于離心管中，然后在此離心管中加入10μl～100μl化學發(fā)光探針溶液，37℃條件下震蕩反應40min后，磁分離，將磁性分離物分散在10μl～100μl含目標物糖化血紅蛋白的溶液中，37℃震蕩反應40min，經(jīng)過磁分離后，將磁性分離液分散在50μlph7.4的0.1mpbs緩沖溶液中，然后再加入羥胺-o-磺酸溶液，產(chǎn)生化學發(fā)光，根據(jù)化學發(fā)光強度定量，實現(xiàn)糖化血紅蛋白的測定。

所述的適體dna為：5`-nh2-acacagcaacacacccacccaccagccccagcatcatgcccatccgtcgtgtgtg-3`

所述的適體互補序列dna為：5’-sh-cacacacgacggatgggcatgatgctggggctggtgggtgggtgtgttgctgtgt-3’

本發(fā)明研究了不同濃度目標物糖化血紅蛋白與化學發(fā)光強度之間的關(guān)系，得到了檢測目標物糖化血紅蛋白的標準曲線，線性范圍及線性方程。

發(fā)明的優(yōu)點與效果

當糖化血紅蛋白的濃度在0.01ng/ml到50ng/ml之間時，隨著糖化血紅蛋白濃度的變化，化學發(fā)光強度有明顯變化。經(jīng)計算得到檢測糖化血紅蛋白的非線性方程為y＝1045ln(x)+4075(y：化學發(fā)光強度；x：糖化血紅蛋白濃度，單位為ng/ml)，線性相關(guān)系數(shù)為0.9987，檢出限為0.003ng/ml(3σ)(圖2)。該測定方法的精密度通過對濃度為1.0ng/ml的糖化血紅蛋白進行11次平行測定而計算得出，相對標準偏差分別為3.6％，表明本發(fā)明的測定方法有較好的重現(xiàn)性。

附圖說明

圖1檢測糖化血紅蛋白的原理示意圖。

圖2糖化血紅蛋白的濃度與化學發(fā)光強度關(guān)系圖。

圖3lumaunps—羥胺-o-磺酸化學發(fā)光檢測體系(a)和lumaunps-h2o2化學發(fā)光檢測體系(b)的化學發(fā)光強度比較。

具體實施方式

下面的實例將進一步說明本發(fā)明的操作方法，但不構(gòu)成對發(fā)明的進一步限制。

實例1：一種化學發(fā)光技術(shù)檢測糖化血紅蛋白的方法

1.實驗部分

1.1儀器與試劑

1.1.1儀器設備

dhg鼓風干燥箱(善志儀器設備有限公司，上海)；ar224cn型奧豪斯分析天平(青島中和恒信電子有限公司，青島)；thz型恒溫振蕩箱(佳源興業(yè)科技有限公司，北京)；rfl-1型超微弱化學發(fā)光檢測儀(瑞邁分析儀器有限公司，西安)；anke-tgl-16c飛翁牌高速離心機(安亭科學儀器廠，上海)。

1.1.2試劑

糖化血紅蛋白購自于sigma-aldrichco.llc。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)、n-羥基丁二酰亞胺(nhs)、氯金酸(haucl4)從sigma公司購買；粒徑為0.5μm，濃度為10mg/ml的羧基磁珠從天津倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心購買；魯米諾(luminol)、羥胺-o-磺酸(hosa)和tcep(三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽)購買于aladdin公司；0.01m的魯米諾用0.1mnaoh溶解，在棕色瓶中保存在4℃冰箱中；取1g氯金酸加100ml水配成1％的氯金酸溶液，用棕色瓶保存，使用前用二次蒸餾水稀釋。

pbs緩沖溶液是0.10m，ph7.4，其配制方法是稱取0.2gkh2po4、8.0gnacl、2.9gna2hpo4·12h2o及0.2gkcl溶解于1l水中，即得。

所用到的dna由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下：

所述的適體dna為：5`-nh2-acacagcaacacacccacccaccagccccagcatcatgcccatccgtcgtgtgtg-3`

所述的適體互補序列dna為：5’-sh-cacacacgacggatgggcatgatgctggggctggtgggtgggtgtgttgctgtgt-3’

1.2lumaunps的合成

實驗開始前，所用的玻璃儀器均用hno3/hcl(3:1,v/v)的王水浸泡24h后，用二次蒸餾水沖洗，放入烘箱烘干。取100μl1％的氯金酸溶液加去離子水稀釋成50ml0.02％的氯金酸溶液并置于三口燒瓶中，在三口燒瓶中加磁子，并將其放入磁力攪拌器中，磁力攪拌下加熱回流煮沸。待溶液沸騰后，快速加入1ml0.01m的魯米諾溶液，繼續(xù)加熱煮沸40min，溶液的顏色由淺黃色變?yōu)楹谏詈笞兂删萍t色，40min后停止加熱并在繼續(xù)攪拌下冷卻至室溫。將制得的lumaunps轉(zhuǎn)移到棕色廣口瓶中，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3適體dna修飾磁珠的制備

取50μl羧基化磁珠溶液放入1.5ml離心管中，用100μl濃度為0.1m咪唑緩沖液洗滌三次，然后分散到1ml含有0.1medc和0.05mnhs的0.1m咪唑緩沖液中，在37℃條件下，振蕩反應30min；然后在離心管中加入100μl濃度為5.0×10^-8m適體dna，在37℃條件下振蕩過夜，得到適體dna修飾的磁珠，然后再用2.0ml0.1mpbs緩沖溶液清洗三次，最后分散到2.0mlpbs緩沖溶液中，4℃保存。

1.4適體互補序列dna修飾lumaunps的制備

將5μl的tcep加到100μl濃度為1.0×10^-6m的適體互補序列dna溶液中，37℃振蕩活化1小時，再取600μl合成好的lumaunps加入到該溶液中，在37℃條件下震蕩過夜，然后再加入50μl含0.3mnaclph8.2的10mmtris-hcl緩沖液；繼續(xù)震蕩48h后，在12000rpm的條件下離心30min后，將紅色沉淀用1mlph7.4的0.1mpbs緩沖溶液清洗，再次離心，如此重復三次，得適體互補序列dna修飾lumaunps，即化學發(fā)光探針。最后得到的化學發(fā)光探針分散到1000μlph7.4的0.1mpbs緩沖溶液中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5糖化血紅蛋白的檢測

取50μl適體dna修飾磁珠溶液置于離心管中，然后在此離心管中加入50μl適體互補序列dna修飾lumaunps溶液，37℃條件下震蕩反應40min，磁分離，將磁性分離物分散在50μl含糖化血紅蛋白的溶液中，37℃震蕩反應40min，通過適體互補序列dna與適體dna的作用以及糖化血紅蛋白與適體dna的作用，經(jīng)過磁分離，化學發(fā)光探針從磁珠表面剝落，將磁性分離液分散在50μlph7.4的0.1mpbs緩沖溶液中，然后再加入羥胺-o-磺酸溶液，產(chǎn)生化學發(fā)光。根據(jù)標準溶液濃度和化學發(fā)光強度關(guān)系作圖得標準曲線。

實例2：樣品分析

將含糖化血紅蛋白的樣品溶液按步驟1.5方法進行實驗，根據(jù)化學發(fā)光強度和步驟1.5所得標準曲線可以獲取糖化血紅蛋白含量。

根據(jù)發(fā)明的方法對糖化血紅蛋白含量進行了測定，并采用標準加入法對方法進行了評價，樣品測定回收率為97.0-103.2％，測定結(jié)果見表1，本發(fā)明的方法在糖化血紅蛋白檢測中具有精密度高的特點。

表1.樣品分析測定結(jié)果

^a7次測量結(jié)果

^b單位：mg/ml

實例3：方法靈敏度比較

利用lumaunps-h2o2為檢測體系，在其他步驟相同時，按本發(fā)明的方法對糖化血紅蛋白進行檢測，測定的檢出限為0.8ng/ml。表明本發(fā)明提出的一種化學發(fā)光技術(shù)檢測糖化血紅蛋白的方法具有高的靈敏度。當糖化血紅蛋白的濃度為1.0ng/ml時，以lumaunps-羥胺-o-磺酸為化學發(fā)光檢測體系，進行化學發(fā)光測定，所產(chǎn)生的化學發(fā)光強度是lumaunps-h2o2為化學發(fā)光檢測體系的4倍(圖3)。

sequencelisting

<110>青島科技大學

<120>一種化學發(fā)光技術(shù)檢測糖化血紅蛋白的方法

<160>2

<170>patentinversion3.3

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<211>55

<212>dna

<213>人工序列

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acacagcaacacacccacccaccagccccagcatcatgcccatccgtcgtgtgtg55

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