本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于煙粉虱化學(xué)感受蛋白的植物驅(qū)避劑篩選方法。

背景技術(shù)：

煙粉虱(bemisiatabacigennadius)是一種多食性的檢疫性害蟲，近三十年以來，隨著農(nóng)產(chǎn)品、苗木和花卉等作物國際貿(mào)易往來和跨地區(qū)傳運，煙粉虱不斷地向世界各地區(qū)擴張，已成為一種著名的外來入侵性害蟲。盡管煙粉虱寄主種類非常多，保守估計已超過74科600余種，但其對不同寄主植物存在較大的嗜性差異——這與其對不同植物揮發(fā)物氣味的反應(yīng)差異明顯有關(guān)。如煙粉虱可以對某些植物表現(xiàn)出較強的驅(qū)避行為，因此通過這些植物氣味揮發(fā)物可以設(shè)計和開發(fā)基于驅(qū)避行為的煙粉虱氣味驅(qū)避劑。然而煙粉虱驅(qū)避植物種類眾多復(fù)雜，如何快速地篩選出合適的驅(qū)避劑配方成為制約煙粉虱氣味驅(qū)避劑開發(fā)和設(shè)計的瓶頸。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種基于煙粉虱化學(xué)感受蛋白的氣味驅(qū)避劑篩選方法，本發(fā)明基于煙粉虱植物源的驅(qū)避劑配方的篩選和設(shè)計提供了新的策略。

一種基于煙粉虱化學(xué)感受蛋白的植物驅(qū)避劑篩選方法，其特征在于包括以下工藝步驟：

1)提供煙粉虱化學(xué)感受蛋白btabcsp1，

2)通過競爭性熒光結(jié)合方法獲得煙粉虱化學(xué)感受蛋白btabcsp1與氣味的結(jié)合反應(yīng)譜，并計算結(jié)合常數(shù)ka或解離常數(shù)kd，

3)如果煙粉虱氣味物質(zhì)將1-npn與btabcsp1相對熒光值競爭至50％以下，并且結(jié)合常數(shù)ka高于1.2×10⁴l/μmol以上或解離常數(shù)kd低于60μmol/l以下時，確定為適合煙粉虱的氣味驅(qū)避劑。

所述的步驟2)中競爭性熒光結(jié)合方法獲得煙粉虱重組化學(xué)感受蛋白與氣味的結(jié)合反應(yīng)譜的方法步驟包括：

(1)熒光配基1-npn與煙粉虱化學(xué)感受蛋白的結(jié)合，測定熒光值，

(2)選取煙粉虱氣味物質(zhì)和1-npn進行競爭結(jié)合煙粉虱重組化學(xué)感受蛋白，測定1-npn與btabcsp1相對熒光值，計算結(jié)合常數(shù)ka。

所述步驟(1)的方法為：在281nm激發(fā)波長下，向1μmol/l的煙粉虱化學(xué)感受蛋白中逐次加入1mmol/l的1-npn，充分混勻。

所述步驟2)后還有氣味驅(qū)避劑的驗證步驟，所述驗證采用y型嗅覺儀測試。

所述步驟1)中煙粉虱化學(xué)感受蛋白btabcsp1的獲取方法為：

a)提取煙粉虱成蟲含觸角在內(nèi)的頭部總rna；

b)設(shè)計煙粉虱化學(xué)感受蛋白基因引物，通過rt-pcr獲得煙粉虱化學(xué)感受蛋白基因全長；

c)構(gòu)建煙粉虱化學(xué)感受蛋白基因的原核表達載體；

d)通過iptg誘導(dǎo)煙粉虱重組化學(xué)感受蛋白重組表達，并通過鎳瓊脂糖凝膠親和層析柱對其進行純化；

步驟d)中iptg誘導(dǎo)煙粉虱重組化學(xué)感受蛋白表達的誘導(dǎo)條件為：iptg濃度為0.5mmol/l，溫度為30℃，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速為200rpm，誘導(dǎo)時間為5h。

本發(fā)明從煙粉虱嗅覺生理的模式出發(fā)，通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆了其化學(xué)感受蛋白基因全長，并通過載體構(gòu)建和原核表達技術(shù)獲得了編碼該基因的重組蛋白，最后通過生物化學(xué)配基結(jié)合技術(shù)探討了其與氣味物質(zhì)的親和力。本發(fā)明同時證明煙粉虱化學(xué)感受蛋白btabcsp1可以作為上述方法篩選煙粉虱植物源驅(qū)避劑，本發(fā)明基于煙粉虱植物源的驅(qū)避劑篩選和設(shè)計提供了新的策略。

附圖說明

圖1為重組煙粉虱化學(xué)感受蛋白btabcsp1的分離純化；

圖中：m：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；0：未誘導(dǎo)的pet30/btabcsp1的bl21(de3)菌體；1：誘導(dǎo)的1～6h優(yōu)化表達產(chǎn)物，

圖2為重組btabcsp1蛋白與熒光配基1-npn的熒光結(jié)合曲線圖；

圖3為候選配基與熒光配基1-npn和重組btabcsp1蛋白的競爭結(jié)合圖；

圖4為煙粉虱對不同氣味驅(qū)避物質(zhì)的嗅覺行為反應(yīng)對熒光結(jié)合驗證圖。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明。

實施例1：收集煙粉虱頭部(含觸角)總rna以及化學(xué)感受蛋白csp1的基因克隆

1煙粉虱化學(xué)感受蛋白btabcsp1(genbank登錄號gu250808)的克隆

1.1煙粉虱總rna的提取

利用ambion-microkit試劑盒提取煙粉虱頭部(含觸角)的總rna，具體操作步驟如下：

1)將載玻片滴入rna緩沖液置于冰上，將活的煙粉虱雌成蟲放入rnalater緩沖液液滴中，在顯微鏡(nikonsmz1500型)下解剖煙粉虱頭部，每10頭解剖完后，轉(zhuǎn)移到裝有200μl的rnalater的離心管中，累積到800頭左右時用于總rna提取。從-80℃取出保存的煙粉虱樣品，放入用液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮快速進行研磨，此步驟在冰上操作，待研成粉末后，稱取100mg組織樣品裝入1.5ml離心管中，然后加入1mllysissolution試劑，漩渦混合器上進行混合；

2)將樣品加至mircofiltercattridageassembly裝置中，蓋上蓋子；

3)4℃，12000×g，離心1min；

4)棄廢液，打開assembly蓋子，將上清轉(zhuǎn)移至assembly中(切勿吸取沉淀)，然后加入180μlwashsolution1，蓋上蓋子；

5)4℃，12000×g，離心1min；

6)棄廢液，打開assembly蓋子，將上清轉(zhuǎn)移至assembly中(切勿吸取沉淀)，然后加入180μlwashsolution2/3，蓋上蓋子；

7)4℃，12000×g，離心1min；

8)重復(fù)step6，7；

9)棄廢液，在空氣中干燥沉淀5～10min，再加30μlrnasefree水到裝在新的1.5ml離心管的assembly中；

10)4℃，12000×g，離心1min，總rna在該步驟溶解于離心管中；

11)利用nanodrop超微量紫外分光光度計測定總rna濃度，再將提取的總rna保存于-80℃冰箱中，用于反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈。

1.2第一鏈cdna的合成

采用invitrogen^tm公司的高通量反轉(zhuǎn)錄cdna試劑盒合成煙粉虱的第一鏈cdna。實驗方法按照試劑盒說明書進行，具體實驗步驟如下：

混勻，進行短暫離心，rt反應(yīng)程序：25℃10min，37℃120min，85℃5min。實驗到此階段合成了第一鏈cdna，將其在-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3基因克隆

根據(jù)genbank中登錄的煙粉虱csp1基因全長(genbank登錄號：gu250808)，設(shè)計引物：

正向引物：5′-gcggatccatgcaggttttgactttagttgtc-3′；

反向引物：5′-cgaagcttttacagggtttgtccgaagaggg-3′。

為了后續(xù)實驗操作的需要，即將目的基因片段亞克隆至其他載體上，在設(shè)計引物時分別在正、反向引物中加入了bamhi，hindiii酶切位點(用下劃線表示)。引物由上海生工公司合成。

以煙粉虱cdna為模板，借助extaq酶進行pcr擴增btabcsp1基因。pcr反應(yīng)體系如下(20μl)：

pcr的反應(yīng)條件為：95℃3min預(yù)變性，每個循環(huán)94℃45s，50℃45s，72℃45s，進行35個循環(huán)，然后72℃延伸10min，16℃forever。pcr結(jié)束后用1％的瓊脂糖凝膠電泳對目的條帶進行檢測分析。

1.4pcr產(chǎn)物的割膠回收

利用axygendna凝膠回收試劑盒對割膠產(chǎn)物進行回收。具體方法如下：

1)在紫外燈下切取目的片段，放入1.5ml的離心管中，先稱重量，然后按質(zhì)量比例換算后，加入600μlbufferde-a，在75℃條件下加熱融化(加熱5-7min，加熱過程中注意混勻)；

2)然后向1)中的離心管中加入250μlbufferde-b，充分混合后裝入制備管中，12000×g離心1min；

3)將柱中離心后的液體，加入500μlbufferw1，12000×g離心30s；

4)倒掉濾液，加入700μlbufferw2，12000×g常溫離心30s；

5)倒掉濾液，加入700μlbufferw2再洗一遍，12000×g離心1min；

6)取一新的1.5ml離心管，將柱子放入管中，加入20μlddh2o，室溫放置1min后，12000×g離心1min，棄柱子后，用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測回收后產(chǎn)物純度，并且用超微量紫外分光光度計檢測濃度后保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5連接反應(yīng)

將目的基因片段的割膠回收產(chǎn)物連接到pgem-teasy載體上，轉(zhuǎn)化至tg1感受態(tài)細胞。連接體系如下：

實施例2：煙粉虱化學(xué)感受蛋白btabcsp1表達載體構(gòu)建

2.1pcr擴增btabcsp1基因

提取煙粉虱的總rna，反轉(zhuǎn)錄得到的cdna第一鏈后作為模板，以設(shè)計合成的煙粉虱btabcsp1前后引物進行pcr反應(yīng)，pcr結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到了447bp左右的目的片段，與預(yù)期片段長度一致。

2.2雙酶切鑒定

btabcsp1基因pcr擴增得到的目的片段凝膠回收純化后與pgem-teasyvector連接轉(zhuǎn)化后，經(jīng)過藍白斑鑒定后，在含有氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上選取白色克隆菌，接種培養(yǎng)并提取質(zhì)粒后，利用bamhi和hindiii限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定目的條帶大小符合要求。。

2.3轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞tg1

對重組質(zhì)粒pgem-t-btabcsp1利用菌液pcr進行驗證，然后送入上海桑尼測序公司測序。測序驗證正確后，將pgem-t-btabcsp1質(zhì)粒與表達載體pet30a(+)質(zhì)粒均經(jīng)bamhi和hindiii限制性內(nèi)切酶雙酶切，然后目的片段與pet30a(+)載體以摩爾數(shù)比3:1，在t4連接酶的作用下4℃連接過夜構(gòu)建pet30/acerasp2。連接后的產(chǎn)物先轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌tg1，選取陽性克隆菌落之后經(jīng)pcr鑒定后，選取鑒定的含pet30/btabcsp1的陽性克隆菌擴大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切酶切驗證并送上海桑尼測序公司測序進一步確定。連接體系及雙酶切體系如下：

1)雙酶切體系(20μl)：

2)連接體系(10μl)：

3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

a.取-70℃凍存的tg1感受態(tài)細胞(100μl)，冰上融化；

b.加入5μl連接產(chǎn)物，輕輕吹打均勻，冰浴30min；

c.將菌液放入42℃水浴中熱激90s，迅速移置冰上放置5min；

d.加入1000μl的lb培養(yǎng)基(無氨芐)，于37℃恒溫搖床上200rpm，復(fù)蘇1h；

e.將菌液3000rpm/min，離心3min，吸出上清800μl；

f.剩余的200μl吸取100μl涂平板，待菌液被平板吸收后，于37℃倒置培養(yǎng)過夜；

g.挑取平板上的白色單菌落，放入含1mllb(含氨芐)的1.5ml離心管中，37℃，220rpm，過夜培養(yǎng)10～12h；

h.利用菌落pcr法鑒定其是否為陽性克??；

i.鑒定為陽性克隆的菌液，可進行擴大培養(yǎng)和測序。

2.4轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞bl21(de3)

將構(gòu)建成功的pet30-btabcsp1載體轉(zhuǎn)化進入用于原核表達的感受態(tài)bl21(de3)菌中。挑取單菌落經(jīng)擴大培養(yǎng)后再送入上海桑尼測序公司進行測序，如果測序得到的結(jié)果正確，可將此菌液保存于-20℃冰箱中。

實施例3：煙粉虱化學(xué)感受蛋白btabcsp1的誘導(dǎo)表達

驗證后的單菌落在3ml含100μg/ml氨芐霉素的lb培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日以1％(v/v)的接種量接種到20mllb培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)至od600在0.4左右，加iptg至終濃度為1mmol/l進行30℃200rpm開始誘導(dǎo)表達。每隔1h取出1ml菌液，共誘導(dǎo)5h，以未誘導(dǎo)的菌液為陰性對照，誘導(dǎo)結(jié)束后，將每小時收集的菌液在8000rpm下離心10min沉淀，并用ddh2o分別重新懸浮后5000rpm離心10min，收集菌體，加入150μl的1×sds樣品緩沖液懸浮菌體沉淀，并在100℃下隔水煮沸10min使菌體充分裂解，之后將各管中樣品進行在5％的濃縮膠及12％的分離膠的sds-page膠中進行電泳中確定菌體是否有表達。

取50ml誘導(dǎo)后的菌液，8000rpm下離心10min收集菌體，棄上清后，用5ml的含溶菌酶的細菌裂解緩沖液(50mmol/ltris-hcl，2mmol/ledta，100mmol/lnacl，0.5％tritonx-100，1mg/ml溶菌酶)重懸液體后置于4℃充分裂解過夜，次日使用細胞超聲裂解儀使菌體充分裂解，裂解后的菌體在4℃下12000rpm離心10min后將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中備用，在沉淀中加入3ml的包涵體裂解液(50mmol/ltris-hcl，ph8.0，1mmol/ledta，100mmol/lnacl，8mol/l尿素)進行4℃充分裂解過夜，次日裂解后的溶液經(jīng)4℃下12000rpm離心上清取出。將細菌裂解液裂解上清和包涵體裂解后上清各取出20μl加入20μl的1×sds樣品緩沖液在沸水中煮3min后，在5％的濃縮膠及12％的分離膠的sds-page蛋白變性膠中電泳，以觀察btabcsp1重組蛋白的表達形式。

表1sds-page電泳濃縮膠與分離膠成分

結(jié)果分析：為得到更多的btabcsp1，我們對表達時間進行優(yōu)化，經(jīng)sds-page，用bandscan軟件對電泳圖進行分析，結(jié)果顯示，當(dāng)iptg濃度為1mmol/l，溫度30℃，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速為200rpm時，5h的誘導(dǎo)量最大。且特異性蛋白條帶在20kd左右，與預(yù)期一致。

實施例4：煙粉虱化學(xué)感受蛋白btabcsp1的純化

4.1蛋白純化

1)確定了btabcsp1重組蛋白表達形式后誘導(dǎo)500ml的大腸桿菌，收集含有目的蛋白的細菌上清。在上清溶液中加入5ml蛋白提取液(50mmol/ltris-hcl，ph8.0，1mmol/ledta，100mmol/lnacl)，溶解1h，10000rpm離心后取上清。

2)用含有鎳nta瓊脂糖親和層析柱純化目的蛋白，用5倍柱體積的緩沖液ⅰ(0.5mol/lnah2po4，0.5mol/lna2hpo4，0.5mol/lnacl)平衡鎳nta瓊脂糖柱，將4.1中step1)得到的蛋白溶液上柱洗脫，控制流速在2ml/min，

3)然后用5倍柱體積的緩沖液ⅰ洗滌，

4)分別用不同梯度咪唑(10、20、50、100、200、300、400mol/l)進行洗脫，分別收集不同濃度下的洗脫液，最后用sds-page電泳檢測蛋白的純度，。各種梯度咪唑洗脫液配方如下：

表2洗脫液的配方比例

如圖1為重組煙粉虱氣味蛋白btabcsp1的分離純化圖，m為marker，1和3為未誘導(dǎo)的誘導(dǎo)的細菌總蛋白，2為誘導(dǎo)后的細菌總蛋白，4為純化后的btabcsp1重組蛋白。

4.2透析除鹽

1)透析袋的處理

a.將1ml0.5mol/ledta加入到499mlddh2o配成1mmol/ledta溶液；

b.向上述溶液中加入10gnahco3，充分?jǐn)嚢杌靹颍?/p>

c.將透析袋剪成適宜大小，然后放入到配置好的溶液中，煮沸10min；

d.蒸餾水洗干凈后再加入透析液透析。

2)透析

配制500ml0.01mol/l的pbs溶液(ph7.4)，將3.1.3中確定含有純btabcsp1重組蛋白的洗脫液全部轉(zhuǎn)移于透析袋中，放入pbs溶液中于4℃透析3d，期間每天早晚分別更換新鮮的pbs緩沖液一次，最后將透析好的蛋白用bradford法測定蛋白的濃度，用1.5ml離心管分裝，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例5：煙粉虱重組化學(xué)感受蛋白與氣味揮發(fā)物熒光競爭實驗

5.1材料與方法

5.1.1試劑與儀器

5.1.1.1實驗試劑

實驗所用的熒光探針n-苯基-1-萘胺(n-phenyl-1-naphthylamine,1-npn)和各種氣味揮發(fā)性物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品均購自于百靈威公司，純度都在97％以上。待測蛋白為上述純化好的btabcsp1重組蛋白，蛋白終濃度為0.6μmol/l。

5.1.1.2實驗儀器

rf-5301pc型熒光分光光度計(日本島津公司)

5.1.2實驗試劑的準(zhǔn)備

將熒光配基1-npn配成10mmol/l母液并置于4℃避光保存。將各標(biāo)準(zhǔn)樣品均溶于hplc級甲醇，配制成10mmol/l的溶液4℃保存。

5.1.3btabcsp1結(jié)合能力的測定

首先測定btabcsp1與1-npn的結(jié)合曲線。移取0.6μmol/lbtabcsp1蛋白溶液于石英比色皿中，然后逐步加入3μl的1mmol/l的1-npn溶液反應(yīng)2min后，在281nm波長下激發(fā)，記錄熒光發(fā)射光譜及最大發(fā)射波長328nm處時的熒光值，根據(jù)scatchard方程對光譜數(shù)據(jù)進行線性化(1)：

其中[dt]表示溶液中總的1-npn濃度，[d]表示溶液中游離的1-npn濃度，[pt]為btabcsp1融合蛋白的濃度，ka為1-npn與btabcsp1的結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點數(shù)。然后使用1-npn作為熒光探針，利用競爭結(jié)合實驗來研究植物揮發(fā)性物質(zhì)與煙粉虱btabcsp1重組蛋白的解離常數(shù)。將供試揮發(fā)物質(zhì)逐次加入到1-npn與btabcsp1蛋白混合液中，每次加入后反應(yīng)時間2min，然后記錄熒光值。根據(jù)公式(2)計算待測揮發(fā)物的解離常數(shù)kd：

其中[ic50]為揮發(fā)性物質(zhì)能夠?qū)?-npn與蛋白的結(jié)合率降至50％時的濃度，[1-npn]為溶液中未結(jié)合的1-npn濃度，k1-npn為蛋白/1-npn復(fù)合物的解離常數(shù)。

5.1.4熒光光譜分析

(1)熒光配基1-npn與重組蛋白的結(jié)合。

在281nm激發(fā)波長下，向0.6μmol/l的重組btabcsp1蛋白溶液中逐次加入1mmol/l的1-npn，充分混勻后進行熒光掃描，熒光光譜的多項式擬合相關(guān)系數(shù)達到0.9991，擬合較好(圖2中a)；用scatchard方程(公式1)線性化光譜數(shù)據(jù)后，擬合相關(guān)系數(shù)為0.9864，擬合較好(圖2中b)。根據(jù)公式1可求得1-npn與btabcsp1蛋白的解離常數(shù)k1-npn為7.38μmol/l。

(2)配基結(jié)合實驗

選擇9種配基(3-蒈烯3-carene、p-傘花烴4-cymene、順-3-己烯-1-醇hl-cis-3-hexen-1-ol、檸檬烯(+/-)-limonene、月桂烯myrcene、α-蒎烯α-pinene、反-2-己烯醛ehl-tran-2-hexenal、芳樟醇linalool和桉樹腦1,8-cinede)分別進行熒光結(jié)合實驗，這9種配基均能與1-npn競爭結(jié)合btabcsp1，且結(jié)合能力都較好，可將1-npn與btabcsp1相對熒光值競爭至50％以下(圖3)。將1-npn與相對熒光btabcsp1的相對熒光值競爭至50％的最強配基是3-蒈烯和p-傘花烴，解離常數(shù)分別達到26.47和39.43μmol/l。

表3候選配基與1-npn和重組btabcsp1蛋白的競爭結(jié)合

如圖3和表3所示，利用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)候選配基中的多種配基能將1-npn從btcsp1的相對熒光值競爭至50％以下，其中有些文獻報道如3-蒈烯、p-傘花烴、順-3-己烯-1-醇和α-蒎烯等能使煙粉虱產(chǎn)生驅(qū)避行為的植物揮發(fā)物質(zhì)，與這些物質(zhì)結(jié)合說明btcsp1可能參與了煙粉虱對非寄主植物的趨避行為，并有可能作為煙粉虱高效的驅(qū)避劑配方篩選手段。

實施例6：通過本發(fā)明篩選得到的驅(qū)避劑的有效性試驗

6.1材料與方法

6.1.1供試?yán)ハx

供試?yán)ハx：煙粉虱來自北京農(nóng)林科學(xué)院植物保護環(huán)境保護研究所養(yǎng)蟲室，并在溫室內(nèi)溫度25±3℃、rh60～80％、光照l:d＝16h:8h的條件下，以普通煙草nicotianatabacuml.(品種為云煙117)為寄主進行連代飼養(yǎng)。

6.1.2實驗儀器和試劑

6.1.2.1實驗儀器

儀器：y型嗅覺儀由y型無色透明玻璃管構(gòu)成，內(nèi)徑15cm，兩臂各長10cm，外加2cm磨口套管，兩臂夾角60°，y型管上方25cm處放有40w日光燈，室內(nèi)溫度保持25±3℃，管中氣體流速100ml/min。每個玻璃臂分別與流量計、味源玻璃容器和活性碳管等相連。

6.1.2.2試劑和揮發(fā)性氣味物質(zhì)樣品制備

各種標(biāo)準(zhǔn)品均購自百靈威。分別將9種植物揮發(fā)性物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品以石蠟油稀釋至0.01μl/μl濃度的氣味試液體，充分混勻后，分別將1μl試液滴加于濾紙上，并以石蠟油為對照，測定煙粉虱的趨性反應(yīng)。

6.1.3煙粉虱對植物揮發(fā)物質(zhì)的行為反應(yīng)測定。

y型嗅覺儀測試前，按照試驗設(shè)置要求，將味源置于味源瓶中，然后通氣10min，使氣味充滿管道，以保證測試結(jié)果。實驗時每次將1頭煙粉虱置于嗅覺儀y型管基部，觀察其3min內(nèi)(即從釋放口開始計時到進入兩臂的時間)的行為選擇反應(yīng)，當(dāng)雌蟲越過某臂1/3處則視為選擇，3min內(nèi)不作選擇，則記無反應(yīng)。每頭煙粉虱只測試1次，每測試10頭后，用75％的乙醇擦洗管的內(nèi)、外壁，烘干后調(diào)換對稱的兩臂與味源瓶聯(lián)接的位置，以消除誤差。具有行為選擇的有效重復(fù)為60頭。

6.1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

選擇率＝選擇臂蟲口數(shù)/總頭數(shù)×100％，校正反應(yīng)率＝(處理臂蟲口數(shù)－對照臂蟲口數(shù))/總頭數(shù)×100％，若值為正，為誘集率，若值為負，則為驅(qū)避率。

表4煙粉虱對氣味揮發(fā)物的行為反應(yīng)值

從表4可以發(fā)現(xiàn)3-蒈烯3-carene、p-傘花烴4-cymene、順-3-己烯-1-醇hl-cis-3-hexen-1-ol、α-蒎烯α-pinene、檸檬烯(+/-)-limonene和月桂烯myrcene等6種植物揮發(fā)物均能使煙粉虱產(chǎn)生驅(qū)避作用，而反-2-己烯醛ehl-tran-2-hexenal、芳樟醇linalool和桉樹腦1,8-cinede)等3種揮發(fā)物能使煙粉虱產(chǎn)生吸引作用。而圖4顯示，產(chǎn)生較強驅(qū)避行為的氣味揮發(fā)物往往具有有較高的結(jié)合常數(shù)，如驅(qū)避作用最顯著的3-蒈烯3-carene和p-傘花烴4-cymene，其相應(yīng)的熒光結(jié)合常數(shù)也所有測試氣味信息中最大(越大表明化學(xué)感受蛋白結(jié)合氣味配基能力越強)。結(jié)合上文所述btcsp1與氣味物質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)，確定當(dāng)二者結(jié)合常數(shù)ka高于1.2×10⁴l/μmol以上，即相應(yīng)行為反應(yīng)高于最弱的月桂烯時，確定為適合煙粉虱的氣味驅(qū)避劑。