本發(fā)明屬于重金屬離子檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于比率型sers傳感原理檢測(cè)重金屬離子的方法。

背景技術(shù)：

表面增強(qiáng)拉曼光譜法(sers)作為分析化學(xué)領(lǐng)域中一種重要的分析檢測(cè)手段，它具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，例如，檢測(cè)靈敏度高、獨(dú)特的分子指紋信息、拉曼光譜譜帶窄、操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)快速以及無(wú)需復(fù)雜的樣品預(yù)處理等。因此，sers作為一種有效的傳感平臺(tái)具有潛在的應(yīng)用，并且已經(jīng)被成功用于dna、小分子和蛋白質(zhì)的分析檢測(cè)中。sers信號(hào)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性易受sers基底的影響。分光光度法測(cè)定重金屬離子適用于常量和半微量分析；在測(cè)定微量和痕量元素時(shí)，條件要求較嚴(yán)格，靈敏度較低。化學(xué)發(fā)光分析法和電化學(xué)分析法選擇性較差。hplc分析成本高。ic檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，濃度范圍小，濃度大無(wú)法檢測(cè)。光譜法測(cè)試成本高，模型需不斷變化，易受光學(xué)系統(tǒng)參數(shù)等外部或內(nèi)部因素影響。icp-ms技術(shù)檢測(cè)成本高，主要檢測(cè)微量、痕量元素。sers基底往往局限于銅、金、銀等貴金屬。傳統(tǒng)的sers基底的物理性質(zhì)，比如納米顆粒的形狀、大小、團(tuán)聚程度、形狀、吸附能以及sers信標(biāo)分子在不同金屬顆粒表面的分布和取向等，會(huì)影響sers信號(hào)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明旨在提出一種基于比率型sers傳感原理檢測(cè)重金屬離子的方法，以解決sers信號(hào)的不穩(wěn)定和重現(xiàn)性差等問(wèn)題。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種基于比率型sers傳感原理檢測(cè)重金屬離子的方法，該方法包括如下步驟：

(1)設(shè)計(jì)識(shí)別探針和與之互補(bǔ)的dna；

(2)合成金納米顆粒；

(3)識(shí)別探針功能化修飾金納米顆粒；

(4)合成雙鏈dna修飾的銀包金納米顆粒；

(5)表面拉曼光譜檢測(cè)重金屬離子。

進(jìn)一步的，所述步驟(1)識(shí)別探針末端增加間隔序列。

進(jìn)一步的，所述間隔序列為4～9個(gè)c堿基。

進(jìn)一步的，步驟(2)金納米顆粒的合成方法如下：

將50ml的0.02％～0.1％haucl4溶液，攪拌加熱至沸，然后快速加入0.5ml新配制的1.0％檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)加熱攪拌10～25min，溶液的最終顏色為酒紅色，移除熱源，攪拌冷卻至室溫，然后用0.22μm孔徑的濾膜進(jìn)行純化分離后置于4℃下保存，以備待用。

進(jìn)一步的，步驟(3)識(shí)別探針功能化修飾金納米顆粒的合成方法如下：

將巰基化的識(shí)別探針通過(guò)au-s鍵功能化修飾于金納米顆粒表面，其步驟如下：取1～5.0μl的100μm的識(shí)別探針與1～5.0μl的100mm含5.0mmtcep的tris-hcl在室溫下孵育反應(yīng)0.2～1h，然后與3.0ml步驟(1)制備的金納米顆粒溶液避光孵育反應(yīng)24h后在12000rpm下離心10～25min，除去上清液，下層沉淀物重新分散于3.0ml超純水中。

進(jìn)一步的，雙鏈dna修飾的銀包金納米顆粒的合成方法如下：

取30～80μl的10mm的l-抗壞血酸溶液與識(shí)別探針修飾的金納米顆粒溶液充分混合，不斷攪拌下將5mm的硝酸銀溶液逐滴滴加到上述溶液中，形成識(shí)別探針修飾的銀包金納米顆粒，取60～120μl的cdna加入到識(shí)別探針修飾的銀包金納米顆粒的混合溶液中，置于80～110℃下熱變性2～10min，自然冷卻至室溫，12000rpm下離心10～25min。

進(jìn)一步的，步驟(5)表面拉曼光譜檢測(cè)重金屬離子的操作步驟如下：

不同濃度的重金屬離子與上述制備雙鏈dna修飾的銀包金納米顆粒溶液在12000rpm下離心10～25min，除去上清液，下層沉淀物重新分散于超純水中，重復(fù)三次得到樣品，用點(diǎn)樣毛細(xì)管吸取樣品，進(jìn)行sers光譜測(cè)定。

一種基于比率型sers傳感原理檢測(cè)重金屬離子的方法在微量或痕量重金屬離子檢測(cè)中的應(yīng)用。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所述的基于比率型sers傳感原理檢測(cè)重金屬離子的方法具有以下優(yōu)勢(shì)：

(1)本發(fā)明所述的基于比率型sers傳感原理檢測(cè)重金屬離子的方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)最低濃度為pm級(jí)重金屬離子的檢測(cè)；

(2)本發(fā)明所述的基于比率型sers傳感原理檢測(cè)重金屬離子的方法克服了sers技術(shù)中最常見(jiàn)的重現(xiàn)性差的問(wèn)題，本方法能夠克服銀殼厚度對(duì)結(jié)果的影響，傳感器表現(xiàn)出更好的響應(yīng)性能。實(shí)現(xiàn)了對(duì)重金屬離子簡(jiǎn)單、選擇性好、重現(xiàn)性強(qiáng)的高靈敏檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

構(gòu)成本發(fā)明的一部分的附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1為本發(fā)明的原理示意圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1所述的hg²⁺檢測(cè)的sers光譜圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例1所述的該方法的重現(xiàn)性考察；

圖4本發(fā)明實(shí)施例1所述的該方法的選擇性考察；

圖5本發(fā)明實(shí)施例1所述的該方法的穩(wěn)定性考察。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。

實(shí)施例1

1、設(shè)計(jì)識(shí)別探針和與之互補(bǔ)的dna，具體序列信息見(jiàn)表1。

表1.

2、溶液的配制

dna干凍粉用滅菌超純水稀釋成100μm儲(chǔ)存液；100mm的tris-hcl緩沖液(150mmnacl，5.0mmtcep，ph7.0)用于配制識(shí)別探針；10mm的pbs緩沖液(100mmnacl，5.0mmmgcl2，ph7.4)用于配制低濃度的互補(bǔ)dna鏈；hg²⁺溶液以及其它的金屬離子溶液用超純水配制和稀釋。

3、納米顆粒的合成

3.1金納米顆粒的合成

首先，將50ml的0.03％haucl4溶液，攪拌加熱至沸，然后快速加入0.5ml新配制的1.0％檸檬酸鈉溶液，可以觀察到溶液的顏色由淺黃色變?yōu)樗{(lán)色，繼續(xù)加熱攪拌20min，溶液的最終顏色為酒紅色，移除熱源，攪拌冷卻至室溫，然后用0.22μm孔徑的濾膜進(jìn)行純化分離后置于4℃下保存，以備待用。

2.2識(shí)別探針功能化修飾的金納米顆粒

巰基化的識(shí)別探針通過(guò)au-s鍵功能化修飾于金納米顆粒表面，其步驟如下：取2.0μl的100μm的識(shí)別探針與在室溫下孵育反應(yīng)0.5h，以除去雙硫鍵，然后與3.0ml上述制備的金納米顆粒溶液避光孵育反應(yīng)24h后在12000rpm下離心15min，除去上清液，下層沉淀物重新分散于3.0ml超純水中，以上步驟重復(fù)三次，以除去未被結(jié)合的識(shí)別探針。

2.3銀包金納米顆粒的合成

在識(shí)別探針修飾的金納米顆粒表面包裹一層銀以增強(qiáng)拉曼信號(hào)：取50μl的10mm的l-抗壞血酸溶液與上述識(shí)別探針修飾的金納米顆粒溶液充分混合，不斷攪拌下將10mm的硝酸銀溶液逐滴滴加到上述溶液中，形成識(shí)別探針修飾的銀包金納米顆粒。為了形成雙鏈dna修飾的銀包金納米顆粒(dsdna-au@agnps)，取80μl的cdna加入到以上混合溶液中，置于90℃下熱變性8min，自然冷卻至室溫，12000rpm下離心20min，以除去未被結(jié)合的cdna。

3、表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)hg²⁺

不同濃度的hg²⁺(或其他金屬離子)與上述制備dsdna-au@agnps溶液在常溫下避光孵育40min后在12000rpm下離心15min，除去上清液，下層沉淀物重新分散于超純水中，重復(fù)三次，以除去被解離下來(lái)的cdna和未反應(yīng)的物質(zhì)。

用點(diǎn)樣毛細(xì)管吸取樣品，進(jìn)行sers光譜測(cè)定，每個(gè)樣本平行測(cè)量5次。實(shí)驗(yàn)中，sers光譜測(cè)定采用英國(guó)雷尼紹公司生產(chǎn)的invia-reflex激光共聚焦倒置顯微拉曼光譜儀，選用633nm和532nmhene激光器，50倍長(zhǎng)焦物鏡，sers光譜掃描范圍為900～1900cm^-1，曝光時(shí)間為3s，累積次數(shù)為2次，對(duì)其它金屬離子也在同樣的條件下測(cè)定。

4、重現(xiàn)性考察

除了靈敏度，重現(xiàn)性也是sers傳感檢測(cè)方法的一個(gè)重要的性能指標(biāo)。本發(fā)明考察了相同hg2+濃度下10個(gè)平行樣本的重現(xiàn)性，結(jié)果如圖3所示。為了使數(shù)據(jù)更加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，我們分別計(jì)算了采用單信號(hào)響應(yīng)cy3在拉曼位移1586cm-1和rox在1646cm-1處特征峰的峰強(qiáng)度的rsd，分別為13.4％和13.3％，而當(dāng)以icy3/irox的值作為定量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，rsd為3.6％。以上數(shù)據(jù)表明，相比于以單獨(dú)的拉曼信標(biāo)分子的sers信號(hào)強(qiáng)度作為考察標(biāo)準(zhǔn)，該傳感方法以icy3/irox的值作為考察重現(xiàn)性的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，結(jié)果的重現(xiàn)性有明顯的提高。

5、選擇性考察

我們進(jìn)一步對(duì)該方法的選擇性進(jìn)行了考察，結(jié)果如圖4所示，只有hg2+產(chǎn)生明顯的icy3/irox值的改變，而其它的金屬離子基本沒(méi)有變化。表明，由于hg2+能特異性與t堿基結(jié)合形成t-hg2+-t復(fù)合物，該傳感方法對(duì)hg2+的檢測(cè)具有良好的選擇性。

6、穩(wěn)定性考察

實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步對(duì)傳感器的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，結(jié)果如圖5所示。將該傳感器分別置于4℃下一周和兩周后仍對(duì)hg2+具有較好的響應(yīng)，對(duì)相同濃度的hg2+進(jìn)行檢測(cè)后，icy3/irox的值分別1.52、1.50和1.48，三者之間偏差較小，表明該傳感器穩(wěn)定性較好。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。