本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種基于電化學(xué)阻抗相角分析的微生物檢測方法。

背景技術(shù)：

病原微生物的快速篩查是食品安全和動物疫病防控的關(guān)鍵，現(xiàn)有的檢測方法主要包括培養(yǎng)法(對細菌而言)或分離法(對病毒而言)、聚合酶鏈式反應(yīng)法(pcr)和免疫分析法。傳統(tǒng)的培養(yǎng)或分離法準確性及靈敏度高，但耗時長；pcr法雖然檢測時間短，靈敏度高，但是核酸提取操作復(fù)雜，而且需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員；免疫分析法雖然操作簡單，但其檢測靈敏度偏低，假陽性率偏高。

阻抗生物傳感器具有檢測速度快、操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點，在食源性致病菌檢測中逐步得到了越來越多的應(yīng)用。如專利“一種基于免疫磁分離和脲酶催化的微生物檢測方法”(專利申請?zhí)枺篶n201510202501.2)所述，先利用第一生物識別元件修飾的磁性顆粒對目標微生物進行分離和富集，再與由脲酶和第二生物識別元件共同修飾的金顆粒進行免疫結(jié)合，然后利用脲酶催化尿素水解，最后利用叉指陣列微電極作為傳感器，對阻抗幅值變化進行檢測，并利用阻抗幅值變化與待分析物濃度之間的標定曲線來計算得到目標微生物的數(shù)量，實現(xiàn)微生物的快速定量檢測。這種方法僅僅對電化學(xué)阻抗幅值變化進行目標微生物分析，但電化阻抗數(shù)據(jù)除了幅值信息外，還包含了相角信息，然而目前并無報道利用pcb電極結(jié)合電化學(xué)阻抗的相角信息進行微生物檢測的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供了一種基于電化學(xué)阻抗相角分析的微生物檢測方法，包括：

基于待測樣品催化產(chǎn)物的電化學(xué)阻抗相角譜，通過曲線擬合，得到最大相位角對應(yīng)的頻率值，利用最大相位角對應(yīng)的頻率值與目標微生物濃度的關(guān)系曲線，獲取待測樣品中目標微生物的濃度值；

其中，所述電化學(xué)阻抗相角譜是使用pcb電極檢測得到。

優(yōu)選地，所述pcb電極包括pcb電路板和pdms通道。

優(yōu)選地，所述最大相位角對應(yīng)的頻率值與目標微生物濃度的關(guān)系曲線的建立為：

基于多種含有已知濃度目標微生物的樣品催化產(chǎn)物的電化學(xué)阻抗相角譜，通過二次曲線擬合，獲取最大相位角對應(yīng)的特征頻率，再通過線性擬合，建立所述特征頻率與目標微生物濃度之間的關(guān)系曲線。

優(yōu)選地，基于含有多種已知濃度目標微生物的樣品催化產(chǎn)物的電化學(xué)阻抗相角譜具體為：

s11.利用所述目標微生物的第一生物識別元件修飾的免疫磁性元件對所述目標微生物進行捕獲，通過磁分離得到純化的磁性元件-目標微生物復(fù)合體；

s12.利用脲酶和所述目標微生物的第二生物識別元件共同修飾的納米金與所述磁珠-目標微生物復(fù)合體進行反應(yīng)，形成磁性元件-目標微生物-納米金-脲酶復(fù)合體；

s13.利用所述磁性元件-目標微生物-納米金-脲酶復(fù)合體上的脲酶催化尿素水解，利用所述pcb電極測量得到催化水解后的溶液的電化學(xué)阻抗相角譜。

優(yōu)選地，s11中所述目標微生物的第一生物識別元件修飾的免疫磁性元件的制備如下：

將鏈霉親和素固定在羧基磁性元件上，形成鏈霉親和素化磁性元件，再將生物素修飾在所述目標微生物的第一生物識別元件上，形成生物素化第一生物識別元件，然后將所述鏈霉親和素化磁性元件和所述生物素化第一生物識別元件進行混合孵育，所述鏈霉親和素化磁性元件上的鏈霉親和素與所述第一生物識別元件上的生物素偶聯(lián)，最后通過磁分離除去多余的所述第一生物識別元件，即可得到所述目標微生物的第一生物識別元件修飾的免疫磁性元件。

優(yōu)選地，s12中所述脲酶和所述目標微生物的第二生物識別元件共同修飾的納米金的制備如下：

利用檸檬酸三鈉還原法制備納米金，再將含目標微生物第二生物識別元件的溶液與納米金混合孵育，然后加入含脲酶的溶液與納米金混合孵育，所述第二生物識別元件和所述脲酶均通過靜電方式吸附至納米金，即得所述脲酶和所述目標微生物的第二生物識別元件共同修飾的納米金。

更優(yōu)選地，s12中所述脲酶和所述目標微生物的第二生物識別元件共同修飾的納米金的制備具體如下：

先利用檸檬酸三納還原法制備納米金；

再利用k2co3溶液將納米金的ph調(diào)節(jié)至7.0；然后將目標微生物的第二生物識別元件逐滴加入納米金，攪拌孵育；接著再逐滴加入脲酶，攪拌孵育，最后，分別利用peg和bsa進行封閉，離心除去多余的第二生物識別元件和脲酶，即可得到所述脲酶和所述第二生物識別元件共同修飾的納米金。

優(yōu)選地，所述第一生物識別元件和第二生物識別元件與目標微生物的結(jié)合位點不同。

優(yōu)選地，所述通過曲線擬合，獲取最大相位角對應(yīng)的頻率與目標微生物濃度的關(guān)系曲線具體為：

基于所述電化學(xué)阻抗相角譜，通過二次曲線擬合，得到相角譜的擬合函數(shù)，求導(dǎo)，獲取最大相位角對應(yīng)的特征頻率。

優(yōu)選地，所述擬合函數(shù)為：y＝ax²+bx+c，其中，y為相角，x為頻率；

最大相位角對應(yīng)的特征頻率x＝-b/(2a)。

優(yōu)選地，所述目標微生物為食源性致病菌，優(yōu)選為單增李斯特菌。

優(yōu)選地，所述目標微生物為單增李斯特菌，所述第一生物識別元件為單克隆抗體，所述第二生物識別元件為多克隆抗體。

本發(fā)明所提供的微生物檢測方法通過使用pcb電極檢測得到電化學(xué)阻抗相角譜，建立樣品催化產(chǎn)物的電化學(xué)阻抗相角譜中最大相位角對應(yīng)的頻率與目標微生物濃度的關(guān)系曲線，可以很準確地得到待測樣品中微生物的濃度。另外，通過生物識別元件修飾的免疫磁性元件分離并富集目標微生物，提高了目標微生物的濃度，減少了樣本背景中其它分子的干擾影響，之后利用脲酶催化反應(yīng)改變尿素溶液的鹽離子濃度，產(chǎn)生銨根離子和碳酸根離子，有效地放大了檢測信號，無需在pcb電極上進行任何修飾即可實現(xiàn)阻抗檢測。同時，本發(fā)明的方法背景噪聲低，系統(tǒng)信噪比高，檢測精度高，檢測時間短，操作簡單，成本低，一致性好。

附圖說明

圖1為根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實施例中pcb電極的電路圖。

圖2為根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實施例中微生物檢測方法中樣品前處理過程圖；

圖3為根據(jù)本發(fā)明實施例1中不同濃度的碳酸銨溶液的阻抗相角譜圖；

圖4為根據(jù)本發(fā)明實施例1中最大相角所對應(yīng)的特征頻率與碳酸銨溶液濃度的曲線圖；

圖5為根據(jù)本發(fā)明實施例2中不同濃度的單增李斯特菌的阻抗相角譜圖；

圖6為根據(jù)本發(fā)明實施例2中最大相角所對應(yīng)的特征頻率與單增李斯特菌濃度的曲線圖；

圖7為根據(jù)本發(fā)明實施例3中使用叉指陣列微電極和pcb電極分別對不同濃度的碳酸銨溶液進行測量得到的阻抗變化值與碳酸銨濃度的曲線圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明提供了一種基于電化學(xué)阻抗相角分析的微生物檢測方法，包括：

基于待測樣品催化產(chǎn)物的電化學(xué)阻抗相角譜，通過曲線擬合，得到最大相位角對應(yīng)的頻率值，利用最大相位角對應(yīng)的頻率值與目標微生物濃度的關(guān)系曲線，獲取待測樣品中目標微生物的濃度值；

其中，電化學(xué)阻抗相角譜是使用pcb電極檢測得到。

本發(fā)明通過pcb電極檢測并獲取數(shù)據(jù)，檢測時間短，檢測成本顯著低于微電極。

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，pcb電極包括pcb電路板和pdms通道。

電極的設(shè)計具體如下：

利用軟件altiumdesigner繪制pcb電極的pcb圖，利用3d打印機制作通道模具，并澆筑pdms通道。

該電極主要包括兩部分：pcb電路板和pdms通道。

pcb板的尺寸為4*2*0.1cm，板上包含10對金電極和一個usb接口，每個電極尺寸為6*0.1-6*0.2mm，電極間的間隔為0.1-0.2mm。

pdms尺寸為3*2cm，通道尺寸為20*2*0.224mm。

本發(fā)明的pcb電極的電路圖如圖1所示。

同時，本發(fā)明利用pcb電極測得的阻抗相角信息進行阻抗分析，通過建立最大相角所對應(yīng)的特征頻率與目標微生物濃度的數(shù)學(xué)模型，可以更準確地測定待測樣品中目標微生物的含量。

利用pcb電極檢測已知濃度目標微生物和待測樣品，成本低，操作簡單，清洗方便，一致性較好，可以更快捷，更有效的獲取數(shù)據(jù)并分析結(jié)果，為檢測細菌濃度提供一種更為簡便快捷的工具。

常規(guī)檢測方法是利用伯德圖(bode)中的阻抗幅值，建立阻抗值與細菌濃度之間的關(guān)系，本發(fā)明提出一種新的檢測方法，即利用伯德圖中的相位，建立最大相位角對應(yīng)的特征頻率與細菌濃度之間的關(guān)系曲線，為檢測細菌濃度提供一種新思路。

較常規(guī)使用催化溶液的阻抗幅值或ph值確定目標微生物濃度的方法相比，本發(fā)明的方法成本更低，操作更簡單，靈敏度更高，檢測時間更短，無需額外試劑，也無需額外增加阻抗測量的工作量，檢測結(jié)果更為精確。

本發(fā)明使用pcb電極測得的最大相位角對應(yīng)的頻率的變化代替常規(guī)的阻抗幅值進行細菌濃度計算，結(jié)合使用放大檢測信號的脲酶，檢測結(jié)果靈敏度更高，使用脲酶催化無需在pcb電極上固定抗體，pcb電極成本低，易于清洗，一致性好，可重復(fù)使用。

本發(fā)明的方法可以適用于不同微生物的檢測，優(yōu)選為食源性致病菌，更優(yōu)選為單增李斯特菌。

其中，單增李斯特菌是一種能引起人畜共患病的病原菌，廣泛分布于自然界中，適應(yīng)能力非常強，能在低溫、高鹽等不利生存條件下存活，而這些條件是保存食物常用的抑菌手段，因此它在食品中的檢出率非常高，尤其是在冷藏及生鮮食品中。在本發(fā)明的實施例中，以該菌的檢測為例詳述本發(fā)明。

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，“最大相位角對應(yīng)的頻率值與目標微生物濃度的關(guān)系曲線”的建立為：

基于多種含有已知濃度目標微生物的樣品催化產(chǎn)物的電化學(xué)阻抗相角譜，通過二次曲線擬合，獲取最大相位角對應(yīng)的特征頻率，再通過線性擬合，建立該特征頻率與目標微生物濃度之間的關(guān)系曲線。

為了進一步提高目標微生物的濃度，放大檢測信號，在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，上述步驟中“基于含有多種已知濃度目標微生物的樣品催化產(chǎn)物的電化學(xué)阻抗相角譜”具體為，如圖2所示：

s11.利用目標微生物的第一生物識別元件修飾的免疫磁性元件對目標微生物進行捕獲，通過磁分離得到純化的磁性元件-目標微生物復(fù)合體，并通過磁富集提高目標微生物的濃度，從而提高檢測的靈敏度；

s12.利用脲酶和目標微生物的第二生物識別元件共同修飾的納米金與磁性元件-目標微生物復(fù)合體進行反應(yīng)，形成磁性元件-目標微生物-納米金-脲酶復(fù)合體；

s13.利用磁性元件-目標微生物-納米金-脲酶復(fù)合體上的脲酶催化尿素水解，產(chǎn)生碳酸銨，利用上述pcb電極測量得到催化水解后的溶液的電化學(xué)阻抗相角譜。

在該實施方式中，通過免疫磁性元件捕獲得到純化和富集的磁性元件-目標微生物復(fù)合體，通過免疫脲酶納米金得到磁性元件-目標微生物-納米金-脲酶復(fù)合體，通過脲酶催化尿素得到碳酸銨，有效地放大了檢測信號。采用專一性較好的脲酶催化尿素得到碳酸銨，可以降低其它分子的干擾影響。使用pcb電極來測量催化水解后溶液的電化學(xué)阻抗相角譜，使得測量結(jié)果更準確。

在本發(fā)明中，針對不同的微生物，可以選用不同的生物識別元件，如針對單增李斯特菌，第一生物識別元件為單克隆抗體，第二生物識別元件為多克隆抗體。同時，采用抗體等生物識別元件分離目標物，具有較好的檢測特異性，可以減少樣本背景中其它分子的干擾影響。

優(yōu)選地，第一生物識別元件和第二生物識別元件與目標微生物的結(jié)合位點不同。

在本發(fā)明中，磁性元件可以為本領(lǐng)域中用于微生物檢測的磁性元件，可以但不限于為磁珠。

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，s11具體為：

s111.利用生物素、鏈霉親和素、磁性元件以及所述第一生物識別元件制備所述免疫磁性元件，并將免疫磁性元件溶解于磷酸鹽緩沖液中；

s112.將免疫磁性元件與含有目標微生物的樣本溶液進行混合孵育，免疫磁性元件捕獲目標微生物，形成磁性元件-目標微生物復(fù)合體；

s113.利用磁場從免疫磁性元件與樣本溶液形成的混合溶液中分離并富集s112中的磁性元件-目標微生物復(fù)合體。

在s111中，為了提高目標微生物的檢測精確度，目標微生物的第一生物識別元件修飾的免疫磁性元件的制備通常是先將鏈霉親和素固定在羧基磁性元件上，形成鏈霉親和素化磁性元件，再將生物素修飾在第一生物識別元件上，形成生物素化第一生物識別元件，然后將鏈霉親和素化磁性元件和生物素化第一生物識別元件進行混合孵育。

具體為：先將鏈霉親和素化的磁性元件與生物素化的第一生物識別元件進行混合孵育45min，磁性元件上的鏈霉親和素與第一生物識別元件上的生物素偶聯(lián)，再通過磁分離除去多余的第一生物識別元件，即可得到第一生物識別元件修飾的免疫磁性元件。

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，s12中脲酶和所述目標微生物的第二生物識別元件共同修飾的金顆粒的制備如下：

利用檸檬酸三鈉還原法制備納米金，再將含目標微生物第二生物識別元件的溶液與納米金混合孵育，然后加入含脲酶的溶液與納米金混合孵育，第二生物識別元件和脲酶均通過靜電方式吸附到納米金上，即可得到脲酶和目標微生物的第二生物識別元件共同修飾的納米金。

具體為：先利用檸檬酸三鈉還原法制備納米金；再將利用k2co3溶液將納米金的ph調(diào)節(jié)至7.0；然后將目標微生物的第二生物識別元件(5μg溶于50μl的超純水中)逐滴加入納米金(1ml)，攪拌孵育5min；接著逐滴加入脲酶(100μg溶于40μl的超純水中)，攪拌孵育1h，最后，分別利用1％的peg20,000和10％的bsa進行封閉30min，再以6950g離心15min除去多余的第二生物識別元件和脲酶，即可得到脲酶和第二生物識別元件共同修飾的納米金。

在本發(fā)明實施方式中，納米金可以為分散在溶液中的納米金顆粒。

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，s1中“通過曲線擬合，獲取最大相位角對應(yīng)的頻率與目標微生物濃度的關(guān)系曲線”具體為：

基于所述電化學(xué)阻抗相角譜，通過excel進行二次曲線擬合，得到相角譜的擬合函數(shù)，求導(dǎo)，獲取最大相位角對應(yīng)的特征頻率。

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，二次擬合函數(shù)為：y＝ax²+bx+c，其中，y為相角，x為頻率；

在上述二次擬合函數(shù)中，對x進行求導(dǎo)，可以得到dy/dx＝2ax+b，根據(jù)二次函數(shù)的特性，最大相位角(二次函數(shù)的奇點)是出現(xiàn)在dy/dx＝0處，也就是2ax+b＝0，即x＝-b/(2a)，即最大相位角對應(yīng)的特征頻率x＝-b/(2a)。

其中，a、b值可以通過excel軟件根據(jù)最小二乘法自動計算給出。

在本發(fā)明一個實施方式中，s13中“利用pcb電極測量得到催化水解后的溶液的電化學(xué)阻抗相角譜”通常為：將催化水解后的溶液注射到pcb電極中，利用電化學(xué)工作站測量得到電化學(xué)阻抗相角譜。

在本發(fā)明中，待測樣品催化產(chǎn)物的電化學(xué)阻抗相角譜的獲取步驟與s1中含有已知濃度目標微生物的樣品催化產(chǎn)物的電化學(xué)阻抗相角譜的獲取步驟相同，如圖2所示。

即先利用目標微生物的第一生物識別元件修飾的免疫磁性元件對待測樣品中目標微生物進行捕獲，通過磁分離得到純化的磁性元件-目標微生物復(fù)合體；

利用脲酶和目標微生物的第二生物識別元件共同修飾的納米金與磁性元件-目標微生物復(fù)合體進行反應(yīng)，形成磁性元件-目標微生物-納米金-脲酶復(fù)合體；

利用磁性元件-目標微生物-納米金-脲酶復(fù)合體中的脲酶催化尿素水解，產(chǎn)生碳酸銨，將水解后的溶液注射到pcb電極中，利用電化學(xué)工作站測量得到待測樣品催化產(chǎn)物的電化學(xué)阻抗相角譜值。

通過曲線擬合，得到相應(yīng)的最大相位角對應(yīng)的頻率值，根據(jù)上述最大相位角對應(yīng)的頻率值與目標微生物濃度的關(guān)系曲線，從而得到待測樣品中目標微生物的濃度值。

實施例1

本發(fā)明實施例中使用碳酸銨溶液進行方法驗證，實施過程主要包含以下步驟：

1)將制備好的1m碳酸銨分別稀釋到1μm、2.5μm、10μm、25μm、50μm和100μm。

2)分別取200μl不同濃度的碳酸銨溶液注射到pcb電極中，在電化學(xué)工作站上掃描電化學(xué)阻抗相角譜，如圖3所示。

3)通過excel對相角譜的數(shù)據(jù)進行二次曲線擬合，得到相角譜的擬合函數(shù)(y＝ax²+bx+c，y代表相角，x代表頻率)。其中，1μm、2.5μm、10μm、25μm、50μm和100μm的擬合函數(shù)分別為：y＝-20.98x²+165.03x–337.42、r²＝0.97，y＝-22.049x²+153.05x–276.27、r²＝0.98，y＝-22.13x²+165.14x–318.21、r²＝0.96，y＝-23.13x²+155.25x–270.68、r²＝0.98，y＝-23.10x²+192.48x–410.29、r²＝0.96。根據(jù)上述擬合函數(shù)通過求導(dǎo)數(shù)得到最大相位角對應(yīng)的特征頻率x＝-b/(2a)；

4)建立特征頻率與碳酸銨溶液濃度的標準曲線，如圖4所示，該曲線y＝145.23x+860.53、r²＝0.96，可見特征頻率與溶液濃度的對數(shù)具有很好的線性關(guān)系，證明了該方法的可行性。

實施例2

以單增李斯特菌的檢測為例，檢測方法包括以下步驟：

1)利用單克隆抗體修飾的免疫磁珠對單增李斯特菌進行捕獲，通過磁分離得到純化的磁珠-細菌復(fù)合體(磁細菌)，此步驟通過磁富集提高了李斯特菌的濃度，從而提高檢測的靈敏度；

其中，免疫磁珠是利用商品化的鏈霉親和素磁珠與商品化的生物素化單克隆抗體混合45min后，磁分離除去多余的生物素化單克隆抗體，并復(fù)溶在pbs溶液中。對細菌的捕獲步驟是：先利用0.2mg單克隆抗體修飾的免疫磁珠與1ml的單增李斯特菌樣本在室溫下進行旋轉(zhuǎn)混合孵育45min(轉(zhuǎn)速為15rpm)，然后磁分離除去樣本背景，再復(fù)溶在0.1ml的pbs溶液中，得到磁珠-單增李斯特菌復(fù)合體；

2)利用脲酶和多克隆抗體修飾的納米金顆粒與磁細菌進行反應(yīng)，形成磁珠-細菌-納米金-脲酶復(fù)合體(酶細菌)；

其中，具體步驟為：用195μl的pbs和5μl的脲酶和多克隆抗體修飾的納米金顆粒的混合溶液重懸富集的磁珠-單增李斯特菌復(fù)合體，之后分別用含有0.5％吐溫的pbs及超純水洗去未結(jié)合的膠體金及殘留的鹽離子，得到磁珠-細菌-納米金-脲酶復(fù)合體(酶細菌)；

其中，利用脲酶和多克隆抗體修飾的納米金顆粒的制備步驟為：先利用檸檬酸三納還原法制備納米金；再利用k2co3溶液將納米金的ph調(diào)節(jié)至7.0；然后將多克隆抗體(5μg溶于50μl的超純水中)逐滴加入納米金(1ml)，攪拌孵育5min；接著再逐滴加入脲酶(100μg溶于40μl的超純水中)，攪拌孵育1h，最后，分別利用1％的peg20,000和10％的bsa進行封閉30min，再以6950g離心15min除去多余的多克隆抗體和脲酶，即可得到脲酶和多克隆抗體共同修飾的納米金。

3)利用酶細菌上的脲酶催化尿素溶液水解，產(chǎn)生碳酸銨，改變尿素溶液的鹽離子濃度，此步驟中脲酶含量與細菌濃度呈正比，細菌濃度越高即脲酶含量越高，對尿素的催化水解速度越快，在相同催化時間下，尿素溶液中的鹽離子濃度越高；

其中，具體步驟為：向步驟2)中得到的酶細菌中加入200μl的1mm尿素溶液，在脲酶的催化作用下，尿素水解為銨根離子及碳酸根離子，從而增加尿素溶液中的鹽離子濃度；

4)將催化水解后的溶液注射到pcb電極中，利用電化學(xué)工作站測量得到電化學(xué)阻抗相角譜；

5)利用excel對步驟4)中的電化學(xué)阻抗相角譜分別進行二次曲線擬合，擬合函數(shù)為y＝ax²+bx+c，y代表相角，x代表頻率，對每個二次擬合曲線求導(dǎo)數(shù)y’＝2ax+b，導(dǎo)數(shù)y’為0的點，即x＝-b/(2a)處為最大相角所對應(yīng)的特征頻率，如圖5所示，圖5中給出了陰性對照樣本，10²，10³，10⁴，10⁵cfu/ml細菌的二次曲線，對應(yīng)的二次擬合曲線分別為y＝-20.98x²+140.18x-246.14、r²＝0.95，y＝-21.213x²+143.75x-255.22、r²＝0.93，y＝-20.79x²+146.26x-268.2、r²＝0.96，y＝-22.30x²+163.42x-310.93、r²＝0.95，y＝-23.56x²+177.62x-345.13、r²＝0.95；

6)根據(jù)步驟5)得到的特征頻率，建立特征頻率與細菌濃度的數(shù)學(xué)模型，如圖6所示，對于單增李斯特菌來說，f＝1126.50log(c)+135.2、r²＝0.94，可見最大相角所對應(yīng)的特征頻率與細菌濃度的對數(shù)具有很好的線性關(guān)系，可用于細菌的測定。

實施例3

pcb電極和叉指陣列微電極的對比

使用pcb電極和叉指陣列微電極分別對不同濃度的碳酸銨溶液進行檢測。

1)靈敏度對比：由圖7可知，pcb電極價格更低，靈敏度明顯優(yōu)于叉指陣列微電極。其中，如圖7所示，對于pcb電極：y＝51214ln(x)+34367、r²＝0.9914；對于叉指陣列微電極：y＝6300ln(x)+14088、r²＝0.99。

2)一致性對比：分別由兩種電極，檢測同一濃度的碳酸銨，pcb電極的重復(fù)性好，相對標準偏差為1.08％；叉指陣列微電極的重復(fù)性較好，相對標準偏差為2.20％。

3)其他項對比表

最后，本申請的方法僅為較佳的實施方案，并非用于限定本發(fā)明的保護范圍。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。