本發(fā)明涉及一種豬流行性腹瀉病毒抗體siga的elisa檢測方法，屬于動物抗體檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：豬流行性腹瀉(porcineepidemicdiarrhea，ped)是由豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)引起的豬的一種急性高度接觸性腸道傳染病，以嚴(yán)重的腸炎、嘔吐和水樣腹瀉為主要特征，臨床變化和癥狀與豬傳染性胃腸炎(tge)極為相似。pedv的傳播途徑主要是水平傳播，主要途徑為消化道，仔豬在采食或接觸被感染的飼料、糞便、飲水后引起發(fā)病，低溫、潮濕、衛(wèi)生環(huán)境差時會加速該疾病的傳播。ped呈爆發(fā)性流行，多數(shù)地區(qū)一次爆發(fā)流行后，第二年原發(fā)豬群不再發(fā)生本病，也有個別地區(qū)和豬場的架子豬和斷奶豬，每年秋冬延續(xù)發(fā)病。各年齡的豬均易感，尤以2～7日齡仔豬最易感，表現(xiàn)為高發(fā)病率和高致死率，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。導(dǎo)致仔豬的大批死亡，生豬出欄率下降，造成市場豬肉供應(yīng)不足，影響豬肉價格穩(wěn)定。因2-7日齡的仔豬的自身免疫系統(tǒng)并不完善，若想抵御pedv的侵染只能通過母乳來獲得被動免疫，母豬初乳中主要為分泌型免疫球蛋白a(siga)，siga不能通過胎盤屏障，新生仔豬可從母乳中獲得，保護(hù)其自身不受pedv感染。目前豬流行性腹瀉疫苗均進(jìn)行母豬免疫，使仔豬獲得被動免疫，因此評價母乳中pedvsiga抗體的滴度是評價pedv疫苗的主要手段，而國內(nèi)關(guān)于豬初乳siga的檢測方法存在空白。因此本發(fā)明建立了檢測母豬乳汁中pedvsiga抗體的elisa方法，希望能對母豬乳汁中pedvsiga抗體給出客觀的評價，以此評判pedv疫苗的免疫效果。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種豬流行性腹瀉病毒抗體siga的elisa檢測方法，該檢測方法特異性及重復(fù)性好，能夠?qū)edv抗體siga給出準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，也有利于pedv疫苗免疫效果的評價。實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種豬流行性腹瀉病毒抗體siga的elisa檢測方法，包括以下步驟：加入抗原：將抗原pedvs1蛋白和包被液加入酶標(biāo)板，進(jìn)行包被，然后用pbst洗去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)；封閉：加入含bsa的pbs作為封閉液進(jìn)行封閉，然后棄去封閉液，用pbst洗去殘余的封閉液；加樣：加入待檢樣品，然后用pbst洗去未與抗原結(jié)合的成份；加入酶標(biāo)抗體：加入酶標(biāo)抗體hrp-兔抗豬siga，反應(yīng)后用pbst洗去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體；顯色和測定：加入顯色劑，避光顯色后加入終止液，然后測定od450nm。進(jìn)一步地，制備所述抗原pedvs1蛋白的方法包括：pedv截短s1基因的擴(kuò)增和重組表達(dá)載體的構(gòu)建步驟：以pedv為模板擴(kuò)增b細(xì)胞抗原表位所在的pedv截短s1基因的435-789位氨基酸序列，回收和純化目的片段，得到pcr產(chǎn)物；pcr產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pgex4t1分別進(jìn)行雙酶切，并對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化后，通過t4連接酶在16℃的條件下進(jìn)行酶切產(chǎn)物的連接，得到重組表達(dá)載體pgex4t-s1；用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取菌落進(jìn)行重組質(zhì)粒提取，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行bamhi和sali雙酶切的鑒定，以檢測是否重組成功；重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測步驟：將含有重組質(zhì)粒的bl21(de3)細(xì)胞接種于amp+lb液體培養(yǎng)基中，以轉(zhuǎn)化pgex4t1空載體的大腸桿菌為陰性對照，收集菌體重懸、破碎后，進(jìn)行sds-page電泳鑒定和以蛋白質(zhì)印跡法檢測重組s1蛋白的表達(dá)情況和反應(yīng)原性。進(jìn)一步地，pedv截短s1基因的擴(kuò)增和重組表達(dá)載體的構(gòu)建步驟中，所述pcr擴(kuò)增b細(xì)胞抗原表位所在的pedv截短s1基因的435-789位氨基酸序列的步驟包括：先進(jìn)行rt-pcr擴(kuò)增，10μl的rt-pcr擴(kuò)增體系為：5×rt-buffer2μl，dntps2μl，引物s1-down1μl，rnaseinhibitor1μl，revertraace1μl，pedv核酸模板1μl，depcwater2μl，42℃作用50min，得到cdna；然后進(jìn)行pcr擴(kuò)增，20μl的pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10×kod-plus-neobuffer2μl，2mmdntps2μl，25mmmgso41.2μl，s1-up1μl，s1-down1μl，kod-plus-neo0.5μl，cdna1μl，d2h2o11.3μl；擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min；進(jìn)入循環(huán)：94℃變性45sec，50-62℃退火45sec，72℃延伸1min，30次循環(huán)；72℃再延伸10min后，4℃保存，得到目的片段；其中，所用的特異性引物為：下劃線部分為酶切位點。進(jìn)一步地，pedv截短s1基因的擴(kuò)增和重組表達(dá)載體的構(gòu)建步驟中，20μl雙酶切體系為：10×buffer-t3μl，bamhi1μl，sali1μl，pcr產(chǎn)物或pgex4t110μl，d2h2o5μl，37℃反應(yīng)3h。進(jìn)一步地，pedv截短s1基因的擴(kuò)增和重組表達(dá)載體的構(gòu)建步驟中，10μl酶切產(chǎn)物的連接體系為：10×t4dna連接酶buffer1μl，s1基因pcr酶切產(chǎn)物5μl，原核表達(dá)載體pgex4t1酶切產(chǎn)物3μl，t4dna連接酶1μl；各組分混勻后，離心，16℃條件下連接至少8h。進(jìn)一步地，重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測步驟中，將含有重組質(zhì)粒的bl21(de3)細(xì)胞接種于amp+lb液體培養(yǎng)基中，以轉(zhuǎn)化pgex4t1空載體的大腸桿菌為陰性對照，于37℃的條件下培養(yǎng)至od600nm為0.6時，于37℃的條件下加入終濃度為0.8mm的iptg，繼續(xù)培養(yǎng)4h。進(jìn)一步地，制備hrp-兔抗豬siga的的方法包括：siga的分離純化步驟：收集母豬的初乳，在4～8℃的條件下離心，棄掉上層脂肪和下層沉淀，取中間層乳清；以滴加的方式往乳清中加入醋酸，使得乳清的ph為3.2-5.6，則蛋白被沉于杯底；再于4℃的條件下離心，取上清液，將上清液調(diào)至ph＝7；將得到的上清液進(jìn)行凝膠過濾層析純化，收集各吸收峰的洗脫液，對洗脫液進(jìn)行sds-page電泳鑒定；將第二峰對應(yīng)的洗脫液進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，然后通過轉(zhuǎn)膜儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至pvdf膜上，用稀釋1000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬iga的多克隆抗體對膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行孵育，以蛋白質(zhì)印跡法檢測分離結(jié)果，從檢測結(jié)果得出siga中iga重鏈的免疫印跡，則表明siga分離成功，得到siga；兔抗豬siga的制備及標(biāo)記步驟：將經(jīng)分離純化的siga免疫新西蘭大耳兔，首免將siga加入等體積的弗氏不完全佐劑乳化后多點免疫兔子，兩周后取siga與等體積弗氏完全佐劑乳化后多點免疫兔子，二免后三周進(jìn)行三免，頸背部多點注射；三免兩周后采血分離血清，得到siga兔抗豬陽性血清；將血清用hrp標(biāo)記試劑盒進(jìn)行標(biāo)記，得到hrp-兔抗豬siga。進(jìn)一步地，加入抗原步驟中，抗原pedvs1蛋白的濃度為12.5μg/ml，加入量為100μl/每孔；在37℃的條件下1h，然后4℃的條件下包被至少8h。進(jìn)一步地，封閉步驟中，加入含體積百分比1％bsa的pbs作為封閉液，在37℃的條件下封閉1.5h，然后棄去封閉液，并用pbst洗去殘余的封閉液。進(jìn)一步地，加樣步驟中，加入待檢樣品后37℃的條件下反應(yīng)1h。進(jìn)一步地，酶標(biāo)抗體hrp-兔抗豬siga的稀釋度為1:5000-23000，加入量為100μl。進(jìn)一步地，加入酶標(biāo)抗體步驟中，加入經(jīng)稀釋的酶標(biāo)抗體hrp-兔抗豬siga，在37℃的條件下反應(yīng)30～45min后，用pbst洗去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。進(jìn)一步地，顯色和測定步驟中，加入顯色劑100μl，避光顯色10min后加入50μl終止液，然后測定od450nm。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明旨在提供一種豬初乳siga的間接elisa檢測方法，該檢測方法特異性及重復(fù)性好，能夠?qū)edv抗體siga給出準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，也有利于pedv疫苗免疫效果的評價。附圖說明圖1為實施例1的層析純化峰圖；圖2為實施例1sds-page電泳圖；圖3為實施例1蛋白質(zhì)印跡顯影圖；圖4為實施例2pcr和雙酶切電泳圖；圖5實施例2sds-page電泳圖；圖6為實施例2蛋白質(zhì)印跡顯影圖。具體實施方式下面，結(jié)合附圖以及具體實施方式，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：一種豬流行性腹瀉病毒抗體siga的elisa檢測方法，包括以下步驟：一、加入抗原：將抗原pedvs1蛋白和包被液加入酶標(biāo)板，在37℃的條件下1h，然后4℃的條件下包被至少8h，抗原pedvs1蛋白的濃度為12.5μg/ml，加入量為100μl/每孔；然后用pbst洗去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)；二、封閉：加入含體積百分比1％bsa的pbs作為封閉液，在37℃的條件下封閉1.5h，然后棄去封閉液，并用pbst洗去殘余的封閉液；三、加樣：以待檢豬初乳樣品，用稀釋液稀釋后，于37℃的條件下反應(yīng)1h，然后用pbst洗去未與抗原結(jié)合的成份；四、加入酶標(biāo)抗體：加入酶標(biāo)抗體hrp-兔抗豬siga，酶標(biāo)抗體hrp-兔抗豬siga的稀釋度為1:5000-23000，加入量為100μl；在37℃的條件下反應(yīng)30～45min后，用pbst洗去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體；五、顯色和測定：加入顯色劑100μl，避光顯色10min后加入50μl終止液，然后測定od450nm。具體實施方式中，制備抗原pedvs1蛋白的方法包括：1、pedv截短s1基因的擴(kuò)增和重組表達(dá)載體的構(gòu)建步驟：以pedv為模板擴(kuò)增b細(xì)胞抗原表位所在的pedv截短s1基因的435-789位氨基酸序列，具體為：采用以下的引物作為特異性引物，上下游引物分別引入限制性內(nèi)切酶位點bamhi和sali(下劃線部分)，先進(jìn)行rt-pcr擴(kuò)增，10μl的rt-pcr擴(kuò)增體系為：5×rt-buffer2μl，dntps2μl，引物s1-down1μl，rnaseinhibitor1μl，revertraace1μl，pedv核酸模板1μl，depcwater2μl，42℃作用50min，得到cdna；然后進(jìn)行pcr擴(kuò)增，20μl的pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10×kod-plus-neobuffer2μl，2mmdntps2μl，25mmmgso41.2μl，s1-up1μl，s1-down1μl，kod-plus-neo0.5μl，cdna1μl，d2h2o11.3μl；擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min；進(jìn)入循環(huán)：94℃變性45sec，50-62℃退火45sec，72℃延伸1min，30次循環(huán)；72℃再延伸10min后，4℃保存，得到目的片段，回收和純化目的片段，得到pcr產(chǎn)物。pcr產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pgex4t1分別進(jìn)行雙酶切，20μl雙酶切體系為：10×buffer-t3μl，bamhi1μl，sali1μl，pcr產(chǎn)物或pgex4t110μl，d2h2o5μl，37℃反應(yīng)3h，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化。通過t4連接酶在16℃的條件下進(jìn)行酶切產(chǎn)物的連接，10μl酶切產(chǎn)物的連接體系為：10×t4dna連接酶buffer1μl，s1基因pcr酶切產(chǎn)物5μl，原核表達(dá)載體pgex4t1酶切產(chǎn)物3μl，t4dna連接酶1μl；各組分混勻后，離心，金屬浴16℃條件下連接至少8h，得到重組表達(dá)載體pgex4t-s1。金屬浴是指：采用微電腦控制和半導(dǎo)體制冷技術(shù)制造的一款恒溫金屬浴儀器，儀器可配置多種模塊，可廣泛應(yīng)用于樣品的保存、各種酶的保存和反應(yīng)、核酸和蛋白質(zhì)的變性處理、pcr反應(yīng)、電泳的預(yù)變性和血清凝固等。用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取菌落進(jìn)行重組質(zhì)粒提取，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行bamhi和sali雙酶切的鑒定，以檢測是否重組成功。2、重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測步驟：將含有重組質(zhì)粒的bl21(de3)細(xì)胞接種于amp+lb液體培養(yǎng)基中，以轉(zhuǎn)化pgex4t1空載體的大腸桿菌為陰性對照，于37℃的條件下培養(yǎng)至od600nm為0.6時，于37℃的條件下加入終濃度為0.8mm的iptg，繼續(xù)培養(yǎng)4h；取菌液，離心收集菌體，以pbs重懸，超聲破碎后，進(jìn)行sds-page電泳鑒定；sds-page電泳鑒定后，以蛋白質(zhì)印跡法檢測重組s1蛋白的表達(dá)情況和反應(yīng)原性。具體實施方式中，制備hrp-兔抗豬siga的步驟包括：1、豬初乳中siga的分離純化步驟：收集母豬的初乳，在4～8℃的條件下離心，棄掉上層脂肪和下層沉淀，取中間層乳清；以滴加的方式往乳清中加入醋酸，使得乳清的ph為3.2-5.6，則蛋白被沉于杯底；再于4℃的條件下離心，取上清液，將上清液調(diào)至ph＝7；將得到的上清液進(jìn)行凝膠過濾層析純化，收集各吸收峰的洗脫液，對洗脫液進(jìn)行sds-page電泳鑒定；將第二峰對應(yīng)的洗脫液進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，然后通過轉(zhuǎn)膜儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至pvdf膜上，用稀釋1000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬iga的多克隆抗體對膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行孵育，以蛋白質(zhì)印跡法檢測分離結(jié)果，從檢測結(jié)果得出siga中iga重鏈的免疫印跡，則表明siga分離成功，得到siga；2、兔抗豬siga的制備及標(biāo)記步驟：將經(jīng)分離純化的siga免疫新西蘭大耳兔，首免將2mgsiga加入等體積的弗氏不完全佐劑乳化后多點免疫兔子，兩周后取4mgsiga與等體積弗氏完全佐劑乳化后多點免疫兔子，二免后三周進(jìn)行三免，6mg/只，頸背部多點注射；三免兩周后采血分離血清，得到siga兔抗豬陽性血清；將血清用hrp標(biāo)記試劑盒進(jìn)行標(biāo)記，得到hrp-兔抗豬siga。實施例1：實施例1為制備hrp-兔抗豬siga的具體方法：1、siga的分離純化：收集母豬的初乳，在4～8℃的條件下，轉(zhuǎn)速11000r/min，離心25min，棄掉上層脂肪和下層沉淀，取中間層乳清；以滴加的方式往乳清中加入0.05-0.2m的醋酸并攪拌，使得乳清的最終ph為3.2-5.6，則蛋白被沉于杯底；再于4℃的條件下，轉(zhuǎn)速11000r/min，離心15min，取上清液，將上清液調(diào)至ph＝7；將得到的上清液進(jìn)行凝膠過濾層析純化：先設(shè)定流速為0.5ml/min，柱壓報警設(shè)定為3mpa，先采用去離子水對整個管道及親和層析柱子進(jìn)行洗滌，每次30ml，洗2次；再用pbs洗2次，每次洗滌體積為30ml；取0.6mlsiga粗品溶液，注入上樣環(huán)中，設(shè)置流速為0.22ml/min，收集各吸收峰的洗脫液，峰圖如圖1所示，第1-3峰分別為：igm、iga、igg；對洗脫液進(jìn)行sds-page電泳鑒定；sds-page電泳的檢測結(jié)果如圖2所示，泳道1-6為不同時間收集的洗脫液，從中可以看出，第2泳道和第3泳道中均有明顯的80kd條帶，對該蛋白經(jīng)質(zhì)譜分析表明該蛋白為siga的分泌片蛋白，證實該蛋白為siga。將第2峰對應(yīng)的洗脫液進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，然后通過轉(zhuǎn)膜儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至pvdf膜上，用稀釋1000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬iga的多克隆抗體對膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行孵育，用dab顯色，以蛋白質(zhì)印跡法檢測分離結(jié)果，如圖3所示：泳道1為陽性對照，可明顯檢測出siga中的iga重鏈的免疫印跡，上述結(jié)果表明siga分離成功，純度較高。對以上蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果呈陽性的洗脫液送生物公司進(jìn)行質(zhì)譜分析，分析結(jié)果并與國際公布的iga的序列進(jìn)行比對，比對結(jié)果具有較高的同源性，可以確定，現(xiàn)已成功從豬的初乳中獲得了較高純度的iga。由于現(xiàn)有技術(shù)中，未有對豬初乳中的siga進(jìn)行分離純化的技術(shù)，本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，針對豬初乳物質(zhì)特性，研究出上述能夠高效穩(wěn)定分離純化豬初乳中siga的方法。2、兔抗豬siga的制備及標(biāo)記：將經(jīng)分離純化的siga免疫新西蘭大耳兔，首免將2mgsiga加入等體積的弗氏不完全佐劑乳化后多點免疫兔子，兩周后取4mgsiga與等體積弗氏完全佐劑乳化后多點免疫兔子，二免后三周進(jìn)行三免，6mg/只，頸背部多點注射；三免兩周后采血分離血清，得到siga兔抗豬陽性血清；將血清用hrp標(biāo)記試劑盒進(jìn)行標(biāo)記，得到hrp-兔抗豬siga。實施例2：實施例2為制備抗原pedvs1蛋白的具體方法：1、設(shè)計特異性引物：通過采用生物學(xué)軟件對pedv毒株進(jìn)行了在線(www.expasy.org)分析，最終確定了pedvs1蛋白的435-789位氨基酸為該毒株的潛在b細(xì)胞抗原表位所在區(qū)域；再利用primer5.0軟件設(shè)計擴(kuò)增截短s1基因435-789位氨基酸序列的特異性引物，上下游引物分別引入限制性內(nèi)切酶位點bamhi和sali(下劃線部分)，2、pedv截短s1基因的擴(kuò)增和重組表達(dá)載體的構(gòu)建：以pedv為模板擴(kuò)增b細(xì)胞抗原表位所在的pedv截短s1基因的435-789位氨基酸序列，具體為：先進(jìn)行rt-pcr擴(kuò)增，10μl的rt-pcr擴(kuò)增體系為：5×rt-buffer2μl，dntps2μl，引物s1-down1μl，rnaseinhibitor1μl，revertraace1μl，pedv核酸模板1μl，depcwater2μl，42℃作用50min，得到cdna；然后進(jìn)行pcr擴(kuò)增，20μl的pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10×kod-plus-neobuffer2μl，2mmdntps2μl，25mmmgso41.2μl，s1-up1μl，s1-down1μl，kod-plus-neo0.5μl，cdna1μl，d2h2o11.3μl；擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min；進(jìn)入循環(huán)：94℃變性45sec，50-62℃退火45sec，72℃延伸1min，30次循環(huán)；72℃再延伸10min后，4℃保存，得到目的片段，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1560bp左右出現(xiàn)了目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符；用dna凝膠回收試劑盒回收和純化目的片段，得到pcr產(chǎn)物。3、pcr產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pgex4t1分別進(jìn)行雙酶切：20μl雙酶切體系為：10×buffer-t3μl，bamhi1μl，sali1μl，pcr產(chǎn)物或pgex4t110μl，d2h2o5μl，37℃反應(yīng)3h，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。4、連接：通過t4連接酶在16℃的條件下進(jìn)行酶切產(chǎn)物的連接，10μl酶切產(chǎn)物的連接體系為：10×t4dna連接酶buffer1μl，s1基因pcr酶切產(chǎn)物5μl，原核表達(dá)載體pgex4t1酶切產(chǎn)物3μl，t4dna連接酶1μl；各組分混勻后，離心，金屬浴16℃條件下連接至少8h，得到重組表達(dá)載體pgex4t-s1。用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取菌落進(jìn)行重組質(zhì)粒提取，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行bamhi和sali雙酶切的鑒定，鑒定結(jié)果如圖4所示，在第1、2泳道出現(xiàn)5300bp、在第3泳道出現(xiàn)1560bp的特異性條帶，證明重組成功。5、重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測：將含有重組質(zhì)粒的bl21(de3)細(xì)胞接種于amp+lb液體培養(yǎng)基中，以轉(zhuǎn)化pgex4t1空載體的大腸桿菌為陰性對照，于37℃的條件下培養(yǎng)至od600nm為0.6時，分別于30℃、37℃的條件下加入0.2-1.0mm范圍內(nèi)梯度設(shè)置iptg的濃度，繼續(xù)培養(yǎng)4h；每隔1h取1ml菌液，離心收集菌體，以pbs重懸，超聲破碎后，測定蛋白的表達(dá)量，得出本步驟優(yōu)選的實驗參數(shù)為：以0.8mm的iptg，在37℃條件下培養(yǎng)4h，可以得到最高的蛋白表達(dá)量。進(jìn)行sds-page電泳鑒定，結(jié)果如圖5所示，第1、2泳道為重復(fù)，第3泳道為空載體誘導(dǎo)對照，第1、2泳道在74kd左右出現(xiàn)了一條明顯的目的條帶，分子量與預(yù)期大小一致。sds-page電泳鑒定后，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用封閉液室溫封閉1h，加入用tbst按1:500稀釋的豬抗pedv陽性血清，于37℃下，與nc膜孵育1h后，用tbst洗滌3次；再加入用tbst1：10000倍稀釋的hrp標(biāo)記的羊抗豬igg，于37℃下，與nc膜孵育1h，用tbst洗3次；加入dab顯色液于暗室顯色5-10min，終止顯影；蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果如圖6所示，第2泳道為空白對照，第1泳道在74kd處出現(xiàn)了一條特異性條帶，證明重組s1蛋白成功表達(dá)，且具有良好的反應(yīng)原性。實施例3：實施例3為抗原最適包被濃度和乳汁稀釋度的確定取酶標(biāo)板(8*12)，橫排將抗原pedvs1蛋白稀釋至50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml，每孔加入100μl，37℃1h后4℃包被至少8h。封閉好的elisa板取出后用pbst洗滌3次，每次1min；加入含體積百分比1％bsa的pbs封閉液，150μl每孔，在37℃的條件下封閉1.5h，然后棄去封閉液；用pbst洗滌3次，每次1min；豎排將陰陽性乳汁從1:10、1:20、1:40倍系列稀釋至1:1280，每孔100μl，然后37℃的條件下反應(yīng)1h；用pbst洗滌3次，每次1min；每孔加入100μl1:10000倍稀釋的實施例1制備的hrp-兔抗豬siga，37℃的條件下反應(yīng)30min；用pbst洗滌3次，每次1min；每孔加入100ul顯色劑，20℃避光顯色10min后，每孔加入50ul終止液，測定od450nm。最佳的抗原包被濃度和抗體稀釋度選擇標(biāo)準(zhǔn)是陽性乳汁od450nm值在1附近，且陽性od450nm值/陰性od450nm值(p/n)比值最大，od450nm值結(jié)果如表格1所示：表格1od值檢測結(jié)果從表格1得出，稀釋度為1:40時，p/n的比值為19.4(1.243/0.064)最大，確定抗原的最適包被濃度為12.5μg/ml、乳汁的最佳稀釋度為1:40。實施例4：實施例4為封閉液的選擇和封閉時間確定以12.5μg/ml為抗原pedvs1蛋白的濃度進(jìn)行包被，進(jìn)行間接elisa，分別以含5％新生牛血清、5％鴨血清、5％脫脂奶粉、1％bsa的pbs作為封閉液，37℃條件下反應(yīng)1h，顯色10min后每孔加入50ul終止液，測定od450nm，結(jié)果如表格2所示，比較陰性陽性乳汁的od450nm值和p/n值，選擇p/n值最大作為最佳封閉液，確定最佳封閉液為1％。表格2不同封閉液的od值檢測結(jié)果od450nm≥0.4為陽性，﹤0.4為陰性。以12.5μg/ml為抗原的濃度進(jìn)行包被，進(jìn)行間接elisa，用含1％bsa的pbs分別于37℃條件下封閉30min、60min、90min、120min后，進(jìn)行elisa反應(yīng)，測定od450nm，比較陰性陽性乳汁的od450nm值和p/n值，結(jié)果如表格3所示，選擇p/n值最大時的酶標(biāo)抗體濃度，確定最佳封閉時間為1.5h。表格3不同封閉時間的od值檢測結(jié)果od450nm≥0.4為陽性，﹤0.4為陰性。實施例5：實施例5為酶標(biāo)抗體最佳稀釋濃度和反應(yīng)時間的確定以12.5μg/ml為抗原的濃度進(jìn)行包被，進(jìn)行間接elisa，hrp-兔抗豬iga二抗分別作l:5000、l:10000、l:15000、1:20000稀釋，37℃條件下反應(yīng)1h，顯色10min后每孔加入50ul終止液，測定od450nm。結(jié)果如表格4所示，比較陰性陽性乳汁的od450nm值和p/n值，選擇p/n值最大作為酶標(biāo)抗體最佳濃度，確定最佳稀釋度為1:20000。表格4不同酶標(biāo)抗體稀釋度的od值檢測結(jié)果od450nm≥0.4為陽性，﹤0.4為陰性。將酶標(biāo)抗體的反應(yīng)條件分別設(shè)為37℃條件下30min、45min、60min、90min，比較陰性陽性乳汁的od450nm值和p/n值，結(jié)果如表格5所示，選擇p/n值最大作為最佳反應(yīng)時間，確定最佳反應(yīng)時間為45min。表格5酶標(biāo)抗體不同反應(yīng)時間的od值檢測結(jié)果od450nm≥0.4為陽性，﹤0.4為陰性。實施例6：實施例6為一種豬流行性腹瀉病毒抗體siga的elisa檢測方法，包括以下步驟：一、加入抗原：將抗原pedvs1蛋白和包被液加入酶標(biāo)板，在37℃的條件下1h，然后4℃的條件下包被至少8h，抗原pedvs1蛋白的濃度為12.5μg/ml，加入量為100μl/每孔；然后用pbst洗滌3次，每次1min；二、封閉：加入含體積百分比1％bsa的pbs作為封閉液，在37℃的條件下封閉1.5h，然后棄去封閉液，并用pbst洗滌3次，每次1min；三、加樣：加入待檢豬初乳樣品后37℃的條件下反應(yīng)1h，然后用pbst洗滌3次，每次1min；待檢豬初乳樣品濃度為12.5μg/ml，加入量為100μl/每孔；四、加入酶標(biāo)抗體：加入酶標(biāo)抗體hrp-兔抗豬siga，酶標(biāo)抗體hrp-兔抗豬siga的稀釋度為1:20000，加入量為100μl；在37℃的條件下反應(yīng)45min后，用pbst洗滌3次，每次1min；五、顯色和測定：加入顯色劑100μl，避光顯色10min后加入50μl終止液，然后測定od450nm。以相同的方法對樣品進(jìn)行重復(fù)檢測，測定od450nm如表格6所示：表格6重復(fù)檢測的od值檢測例1：檢測例1為重復(fù)性試驗取以實施例6的方式分別檢測3份陽性乳汁和2份陰性乳汁，結(jié)果如表格7所示：3份陽性乳汁的變異系數(shù)為3.05％、3.82％、2.09％，均小于10％，表明該方法的重復(fù)性好。表格7重復(fù)性試驗結(jié)果od450nm≥0.4為陽性，﹤0.4為陰性。檢測例2：檢測例2為特異性試驗以實施例6的elisa檢測方法分別檢測豬傳染性胃腸炎(tgev)、豬輪狀病毒(porv)、豬偽狂犬(prv)、豬瘟(hcv)、豬繁殖與呼吸綜合征(prrsv)的陽性乳汁和pedv陽性乳汁，試驗結(jié)果如表格8所示：豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒、豬偽狂犬、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征的陽性乳汁elisa檢測結(jié)果均為陰性，證實該方法的特異性好。表格8特異性試驗結(jié)果陽性乳汁tgevporvprvhcvprrsvpedvod450nm0.130.160.200.180.211.65od450nm≥0.4為陽性，﹤0.4為陰性。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司<120>一種豬流行性腹瀉病毒抗體siga的elisa檢測方法<130>2017<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>28<212>dna<213>人工合成<400>1aaggatccatgtgcactggttacgctgc28<210>2<211>28<212>dna<213>人工合成<400>2aagtcgacttaatggtagaagaaaccag28當(dāng)前第1頁12