本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，涉及ck19和ov6蛋白的聯(lián)合應用，具體涉及ck19和ov6蛋白組合在指導肝癌索拉菲尼精準治療中的應用。本發(fā)明中基于ck19和ov6蛋白檢測的試劑盒可以用于判定肝前體細胞來源的肝癌(即ck19⁺ov6⁺的肝癌)，并可以用于指導臨床醫(yī)生對此類病人進行sorafenib精準治療。

背景技術：

原發(fā)性肝細胞癌(簡稱肝癌)是全球常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率長期居高不下。目前肝癌的治療仍以手術治療為主，但肝癌發(fā)病復雜，部分病人確診時已是中晚期，錯過最佳手術時間；在我國，很多肝癌病人長期經(jīng)歷肝硬化病程，身體狀況差，不能接受手術治療；另外，大量肝癌病人經(jīng)手術治療后出現(xiàn)復發(fā)，二次手術難度大、風險高。對于這類病人，有效的藥物治療是控制病情、緩解癥狀和延長生存時間的最佳途徑。然而，肝癌對常規(guī)化療藥物不敏感，加之很多患者身體狀況不佳，難以承受化療藥物帶來的毒副作用，進而導致肝癌患者較差的預后。近年來針對腫瘤細胞異常信號通路的分子靶向抗腫瘤藥物，因其較高的治療指數(shù)和較低的毒副作用備受關注。其中sorafenib是迄今唯一被美國fda批準用于肝癌治療的分子靶向藥物；然而，已有多項研究證實sorafenib治療肝癌病人的總體療效不高，中位生存時間為3個月，部分患者未顯示出治療效果，甚至出現(xiàn)嚴重不良反應。因此，尋找特異性分子標志物指導sorafenib在臨床中的用藥顯得尤為重要。

相關研究表明，部分肝癌來源于肝前體細胞的惡性轉化，肝前體細胞標志物ck19的表達與肝癌病人的不良預后相關；另外，有研究報道肝前體細胞表達某些特異性標志物，如ov6。我們通過對肝癌組織連續(xù)切片進行ck19和ov6的免疫組織化學染色分析，發(fā)現(xiàn)來源于肝前體細胞ck19⁺ov6⁺肝癌病人預后更差。sorafenib能顯著抑制惡性轉化的肝前體細胞的自我更新，并誘導其凋亡。ck19⁺ov6⁺肝癌病人術后給予sorafenib治療后，其復發(fā)及總體生存狀況得到明顯改善，提示肝前體細胞來源的ck19⁺ov6⁺肝癌更適用于sorafenib的治療。以上結果提示我們，ck19和ov6聯(lián)用可以作為肝癌分子分型標志物并指導預后和個性化治療。

目前ck19和ov6聯(lián)合作為肝癌分子分型標志物并指導預后和個性化治療未見文獻報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供ck19和ov6蛋白的聯(lián)合在制備肝癌分子分型試劑盒用于肝癌索拉菲尼個性化治療的應用。

本發(fā)明前期統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人所在的中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學附屬東方肝膽外科醫(yī)院手術切除的hcc中膽系標志物ck19陽性比例約為9％。由于肝前體細胞表達肝細胞和膽管細胞的標志物，因此其可能是ck19⁺hcc的主要來源。ov6是公認且常用的肝前體細胞標志物，通過對ck19⁺hcc進行ov6免疫組織化學染色，我們發(fā)現(xiàn)其中約65％呈ov6陽性，說明這部分ck19⁺ov6⁺肝癌來源于肝前體細胞，提示ck19和ov6的聯(lián)合應用可指導肝癌的分子分型。

進一步地，本發(fā)明經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)sorafenib能夠顯著抑制惡性轉化的肝前體細胞的自我更新能力，并促進細胞凋亡，提示sorafenib可能用于肝前體細胞來源的ck19⁺ov6⁺肝癌的個性化治療。

更進一步地，我們對ck19⁺ov6⁺肝癌患者的臨床資料進行統(tǒng)計分析，篩選出給予sorafenib治療的ck19⁺ov6⁺病人和未給予sorafenib治療的ck19⁺ov6⁺病人，結果表明給予sorafenib治療的ck19⁺ov6⁺肝癌病人的復發(fā)及總體生存狀況均好于未給予sorafenib治療的ck19⁺ov6⁺肝癌病人，進一步提示sorafenib更適用于肝前體細胞來源的ck19⁺ov6⁺肝癌的個性化治療。

因此，本發(fā)明認為，ck19和ov6的聯(lián)合應用具備作為肝癌分子分型標志物的可能性，并可指導肝癌預后和個性化治療。

本發(fā)明的第一方面，提供了ck19和ov6聯(lián)用在制備肝癌分子分型標志物中的應用。

本發(fā)明的第二方面，提供了上述用于檢測肝癌組織中ck19和ov6試劑盒的檢測方法，具體步驟如下：

1.脫蠟至水

(1)4μm厚石蠟切片，每個腫瘤組織2張連續(xù)切片，60℃烤箱烤1h；

(2)二甲苯10minx3次；

(3)依次經(jīng)過100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇、雙蒸水，各5min。

2.抗原修復

(1)3％h2o2甲醇液20min；

(2)雙蒸水洗5minx3次；

(3)抗原修復(高壓修復)：

切片放入盛有edta堿性修復液(2mmedta、2mmna2hpo4)的高壓鍋中，高壓煮沸2min，自然冷卻至室溫。

3.一抗孵育

(1)pbs洗5min；

(2)50μl1％bsa覆蓋組織，37℃封閉30min；

(3)吸去封閉液，2張連續(xù)切片分別滴加ck19、ov6一抗50μl，濕盒中4℃孵育過夜。

4.二抗孵育

(1)吸走一抗，pbs洗5minx4次；

(2)滴加50μl帶hrp標記的二抗，37℃孵育30-45min；

5.顯色、反藍

(1)pbs洗5minx4次；

(2)dab(1∶50)顯色3-10min，至出現(xiàn)磚紅色沉淀，雙蒸水終止顯色；

(3)蘇木素復染10min，鹽酸酒精分化后自來水沖洗反藍20-30min。

6.脫水封片

(1)依次經(jīng)過雙蒸水、75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、100％乙醇、石炭酸、二甲苯，各5min。滴加樹脂封片。

7.分析

顯微鏡下判讀ck19和ov6的表達是否為陽性。

本發(fā)明的第三方面，提供了檢測肝癌組織中ck19和ov6表達的試劑盒在制備肝癌分子分型試劑盒中的應用。

本發(fā)明提供了一種肝癌分子分型試劑盒，用于鑒別ck19⁺ov6⁺肝癌和ck19^-或ov6^-肝癌。

所述的試劑盒通過免疫組織化學方法檢測生物樣品中ck19和ov6的表達情況。

所述的試劑盒，包括：特異性識別人ck19的抗體、特異性識別人ov6的抗體、免疫組化實驗試劑等。

所述的生物樣品，為病人肝癌的石蠟包埋組織。

所述的肝癌，為原發(fā)性肝細胞癌。

本發(fā)明的第五方面，提供了ck19和ov6聯(lián)合在sorafenib治療肝癌中的應用，所述的肝癌是指ck19⁺ov6⁺肝癌。

本發(fā)明提出聯(lián)合ck19和ov6作為肝癌分子分型標志物，為來源于前體肝細胞的ck19⁺ov6⁺肝癌預后評估及索拉菲尼個性化治療提供了重要指導。

附圖說明

圖1為肝癌組織連續(xù)切片ck19(a)和ov6(b)的免疫組化染色；

圖2為ck19⁺ov6⁺肝癌病人與對照病人的累積復發(fā)；

圖3為正常和惡性轉化的肝前體細胞在sorafenib作用下的成球實驗；

圖4為正常和惡性轉化的肝前體細胞在sorafenib作用下的凋亡實驗；

圖5為肝癌病人術后給予sorafenib和未給予sorafenib治療下的總生存率；

圖6為ck19⁺ov6⁺肝癌病人術后給予sorafenib和未給予sorafenib治療下的累積復發(fā)；

圖7為ck19⁺ov6⁺肝癌病人術后給予sorafenib和未給予sorafenib治療下的總生存率。

具體實施方式

現(xiàn)結合實施例和附圖，對本發(fā)明作詳細描述，但本發(fā)明的實施不僅限于此。

實施例1：ck19陽性肝癌病人組織中ov6表達的檢測

我們通過檢索東方肝膽外科醫(yī)院手術切除的肝癌的病理信息，發(fā)現(xiàn)肝癌中膽系標志物ck19陽性比例約為9％。然后隨機選取102例ck19⁺肝癌進行肝前體細胞標志物ov6的免疫組織化學染色，ov6抗體購自r&d公司，稀釋比例為1∶100，抗原修復條件為高壓堿性修復。結果發(fā)現(xiàn)其中約65％為ck19⁺ov6⁺肝癌(見圖1)，這部分ck19⁺ov6⁺肝癌可能來源于肝前體細胞，提示ck19和ov6的聯(lián)合應用可指導肝癌的分子分型。

實施例2：ck19⁺ov6⁺肝癌與對照肝癌病人的預后分析

我們對上述102例ck19⁺肝癌病人進行隨訪，記錄病人復發(fā)時間(復發(fā)時間指從手術日至診斷腫瘤復發(fā)日)。根據(jù)免疫組織化學結果，ck19⁺肝癌被分為ck19⁺ov6⁺肝癌與ck19^-或ov6^-肝癌，采用kaplan-meier法對ck19⁺ov6⁺hcc與ck19^-或ov6^-肝癌病人的無瘤生存期進行比較分析，發(fā)現(xiàn)ck19⁺ov6⁺肝癌病人無瘤生存期更短，預后更差(見圖2)。這一結果提示ck19和ov6的聯(lián)合應用可指導肝癌病人的預后判定。

實施例3：sorafenib對惡性轉化的肝前體細胞的作用

我們建立了惡性轉化的肝前體細胞系wb-tnf(肝前體細胞系wb-f344經(jīng)1ng/mltnf-α連續(xù)刺激20周后穩(wěn)定成系)，構建方法如下：

1.含0.5％胎牛血清的dmem貼壁培養(yǎng)肝前體細胞系wb-f344，培養(yǎng)基中加入1ng/mltnf-α；

2.每兩天進行胰酶消化、細胞傳代，待細胞貼壁后繼續(xù)向培養(yǎng)基中加入1ng/mltnf-α；

3.如1、2所述培養(yǎng)20周，建成惡性轉化的肝前體細胞系wb-tnf。

之后，我們采用sorafenib(購自bayer公司)處理wb-tnf及對照細胞，分別進行成球實驗和凋亡實驗，結果發(fā)現(xiàn)sorafenib能顯著抑制惡性轉化的肝前體細胞的自我更新(見圖3)，并促進細胞凋亡(見圖4)，這些結果提示sorafenib可能用于肝前體細胞惡性轉化來的肝癌(ck19⁺ov6⁺)的個性化治療。

實施例4：sorafenib對ck19⁺ov6⁺肝癌患者術后治療的作用

我們對66例術后給予sorafenib治療的肝癌病人及97例術后未給予sorafenib治療的肝癌病人進行隨訪，記錄病人復發(fā)時間(復發(fā)時間指從手術日至診斷腫瘤復發(fā)日)，采用kaplan-meier法對術后給予sorafenib和未給予sorafenib治療的肝癌病人復發(fā)進行比較分析，發(fā)現(xiàn)兩組肝癌病人累積復發(fā)無統(tǒng)計學差異(見圖5)。這一結果提示給予sorafenib治療肝癌病人并未表現(xiàn)出明顯的生存優(yōu)勢。

進一步，我們對實施例1中ck19⁺ov6⁺肝癌患者的臨床資料進行統(tǒng)計分析，篩選出給予sorafenib治療的ck19⁺ov6⁺病人和未給予sorafenib治療的ck19⁺ov6⁺病人，結果表明給予sorafenib治療的ck19⁺ov6⁺hcc病人的復發(fā)及總體生存狀況均好于未給予sorafenib治療的ck19⁺ov6⁺hcc病人(見圖6、7)，進一步提示sorafenib更適用于肝前體細胞來源的ck19⁺ov6⁺hcc的個性化治療。

由以上實驗結果可知，通過采用免疫組化的方法檢測ck19和ov6蛋白表達能預測肝細胞癌患者術后的生存或死亡，并能夠指導sorafenib對肝癌病人的個體化治療。當癌組織中ck19⁺ov6⁺時，給予sorafenib治療后，肝癌病人的復發(fā)及總體生存狀況均得到明顯改善。因此，以ck19聯(lián)合ov6作為分子分型標志物對其表達進行檢測能預測肝細胞癌手術后復發(fā)等事件，并指導sorafenib在臨床中的精準應用。相應的，特異性抗ck19和ov6的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，能用于制備肝癌分子分型的制劑或試劑盒，這對于本領域技術人員來說是顯而易見的。

以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內(nèi)。