本發(fā)明涉及一種檢測(cè)水果中5種萘衍生物的方法,屬于化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

植物激素是指植物體內(nèi)天然存在的對(duì)植物生長(zhǎng)、發(fā)育有顯著作用的微量有機(jī)物質(zhì)，也被稱為植物天然激素或植物內(nèi)源激素。由于植物體內(nèi)的植物激素含量甚微，如果通過從植物體內(nèi)提取植物激素再應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)非常困難，成本也很高。于是，人們就用化學(xué)的方法，仿照植物激素的作用合成具有類似植物激素功能的有機(jī)化合物，這便是植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑又稱為植物外源激素,屬于農(nóng)藥管理范疇，每種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑都有特定的用途，而且應(yīng)用技術(shù)要求相當(dāng)嚴(yán)格。歐盟、美國(guó)、澳大利亞、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)蔬菜水果中植物激素均制定了嚴(yán)格的安全限量控制標(biāo)準(zhǔn)，而且對(duì)植物外源激素進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)。

萘衍生物1-萘乙酰胺(nad)、1-萘乙酸(naa)、2-萘氧乙酸(2-noa)、萘丙酸(npa)和萘乙酸甲酯(name)，屬生長(zhǎng)素類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在果樹上使用能加強(qiáng)植株的新陳代謝和光合作用，促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，刺激生長(zhǎng)，提高嫁接成活率，促進(jìn)坐果和增大果粒。我國(guó)規(guī)定蘋果、葡萄和荔枝中naa最大殘留限量(mrl)分別為0.1，0.1，0.05mg/kg。日本規(guī)定naa在水果、蔬菜等產(chǎn)品中的最大殘留限量，范圍為0.03-5.0mg/kg，并且規(guī)定了nad在蘋果和梨中的限量為0.1mg/kg。歐盟規(guī)定nad、naa和2-noa在漿果類水果中的最大殘留限量分別為0.05，0.05和0.01mg/kg。

目前關(guān)于naa測(cè)定的報(bào)道已較多，方法主要有熒光光譜法、氣相色譜法(gc)、液相色譜-紫外檢測(cè)法(hplc-uv)、液相色譜-熒光檢測(cè)法(hplc-fld)、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(hplc-ms/ms)。而國(guó)內(nèi)外對(duì)nad、2-noa、npa和name檢測(cè)方面的報(bào)道都比較少，尤其是npa和name鮮有人報(bào)道，還未見有同時(shí)測(cè)定1-萘乙酰胺(nad)、1-萘乙酸(naa)、2-萘氧乙酸(2-noa)、萘丙酸(npa)和萘乙酸甲酯(name)5種萘衍生物的方法報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問題，提供一種檢測(cè)水果中5種萘衍生物的方法,通過本檢測(cè)方法使1-萘乙酰胺(nad)、1-萘乙酸(naa)、2-萘氧乙酸(2-noa)、萘丙酸(npa)和萘乙酸甲酯(name)5種萘衍生物達(dá)到很好的分離，建立同時(shí)檢測(cè)水果中5種萘衍生物的前處理方法和檢測(cè)方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種檢測(cè)水果中5種萘衍生物的方法,包括：

1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.0mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取nad、naa、2-noa、npa和name標(biāo)準(zhǔn)品各10.0mg，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，混勻后貯存于密閉的棕色玻璃瓶中，分別配制成1.0mg/ml的nad、naa、2-noa、npa和name標(biāo)準(zhǔn)溶液；

10mg/l混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別移取1.0mg/ml的nad、naa、2-noa、npa和name標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.1ml混合于10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻后貯存于密閉的棕色玻璃瓶中，配制成10mg/l混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：將10mg/l混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用含0.1％(v/v)甲酸的乙腈-水溶液(3:7，v/v)逐級(jí)稀釋成0.005、0.01、0.02、0.1和1.0mg/l的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，供超高效液相色譜測(cè)定；

2)樣品提取

稱取10g粉碎好的水果樣品于100ml具塞離心管中，加入20.0ml乙腈，渦旋2min，加入5g氯化鈉，蓋上蓋子，劇烈振搖1min，4000r/min離心5min，使乙腈和水相分層；

3)樣品凈化

移取10.0ml上層乙腈溶液于100ml梨形瓶中，40℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至干，加入2-5ml含1％-2％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10-95:5，v/v)淋洗液溶解殘?jiān)?，移入用淋洗液活化好的nh2固相萃取小柱中，收集流出液于50ml雞心瓶中，再用淋洗液洗滌梨形瓶2次，每次用2-5ml淋洗液，再移入上述nh2固相萃取小柱中，合并流出液，在30℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至干，用1.0ml含0.1％(v/v)甲酸的乙腈-水溶液(3:7，v/v)溶解殘?jiān)?jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，得樣品溶液，供超高效液相色譜測(cè)定；

4)超高效液相色譜測(cè)定

用超高效液相色譜測(cè)定1)所得的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和3)所得的樣品溶液，得到兩者的色譜圖，通過樣品色譜圖的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間對(duì)照定性。當(dāng)樣品色譜圖中色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖中的nad、naa、2-noa、npa和name這5種化合物的色譜峰保留時(shí)間的相對(duì)偏差不大于5％，則定性為檢出。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。

進(jìn)一步，在步驟1)中，所述甲醇的純度為色譜純。

進(jìn)一步，在步驟3)中，所述nh2固相萃取小柱用淋洗液活化的步驟為:向nh2固相萃取小柱中加入5-6ml含1％-2％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10-95:5，v/v)淋洗液，不收集。

進(jìn)一步，在步驟4)中，所述超高效液相色譜測(cè)定的條件為：

色譜柱：acquityuplcbehc18(1.7μm，2.1×100mm)；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)：ex(激發(fā)波長(zhǎng))＝280nm，em(發(fā)射波長(zhǎng))＝330nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：4μl；流速0.2-0.5ml/min；流動(dòng)相a為0.1％(v/v)甲酸水溶液，流動(dòng)相b為0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液，梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1，

表1流動(dòng)相梯度程序

本發(fā)明建立了超高效液相色譜-熒光檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定水果中1-萘乙酰胺(nad)、1-萘乙酸(naa)、2-萘氧乙酸(2-noa)、1-萘丙酸(npa)和1-萘乙酸甲酯(name)這5種萘衍生物的方法。以乙腈為樣品提取液；nh2固相萃取小柱凈化，含1％-2％甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10-95:5，v/v)為淋洗液；用1.7μm，2.1×100mmc18色譜柱分離，0.1％(v/v)甲酸水溶液-0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液為流動(dòng)相；于超高效液相色譜熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)280nm，發(fā)射波長(zhǎng)330nm下測(cè)定。5種化合物在質(zhì)量濃度0.005-1.0mg/l范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r²)≥0.99996。當(dāng)樣品中添加水平為0.004、0.02和0.2mg/kg時(shí)，回收率為77.6％-95.0％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)為4.3％-11.2％，方法檢出限為0.001-0.002mg/kg。本方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，適用于水果中nad、naa、2-noa、npa和name這5種萘衍生物的同時(shí)測(cè)定。

附圖說明

圖1為本發(fā)明5種萘衍生物在不同洗脫條件下的回收率圖,其中，

a.含1％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(95:5，v/v)；

b.含1％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10，v/v)；

c.含2％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(95:5，v/v)；

d.含2％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10，v/v)。

圖2為本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖(0.02μg/ml)；

圖3為本發(fā)明草莓空白樣品色譜圖；

圖4為本發(fā)明草莓加標(biāo)樣品色譜圖(0.004mg/kg)。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

agilent1290超高效液相色譜儀，配有熒光檢測(cè)器(美國(guó)agilent公司)；

ld5-2a高速離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)；

wh-3微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；

dt-1002a電子天平(常熟市金羊砝碼儀器有限公司)；

水果樣品草莓、葡萄和蘋果均購(gòu)買于成都市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；

nad、naa、2-noa和name標(biāo)準(zhǔn)品(純度均>99.0wt％，德國(guó)dr.ehrenstorfer公司)；

npa(英國(guó)fluorochem公司)；

甲酸(色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；

甲醇、乙腈、二氯甲烷(色譜純，美國(guó)sigma-aldrich公司)；

氯化鈉(分析純，西隴化工有限公司)；

psa填料、c18填料、無(wú)水硫酸鎂(美國(guó)agilent公司)；

nh2固相萃取小柱(500mg/6ml，美國(guó)thermo公司)；

實(shí)驗(yàn)用水均為優(yōu)普超純水系統(tǒng)制備；

0.22μm微孔濾膜(一次性針頭式濾器)(天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.0mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確稱取nad、naa、2-noa、npa和name標(biāo)準(zhǔn)品各10.0mg，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，混勻后貯存于密閉的棕色玻璃瓶中，分別配制成1.0mg/ml的nad、naa、2-noa、npa和name標(biāo)準(zhǔn)溶液；

10mg/l混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別移取1.0mg/ml的nad、naa、2-noa、npa和name標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.1ml混合于10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻后貯存于密閉的棕色玻璃瓶中，配制成10mg/l混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：將10mg/l混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用含0.1％(v/v)甲酸的乙腈-水溶液(3:7，v/v)逐級(jí)稀釋成0.005、0.01、0.02、0.1和1.0mg/l的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，供超高效液相色譜測(cè)定。

1.3色譜條件

色譜柱：acquityuplcbehc18(1.7μm，2.1×100mm)；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)：ex(激發(fā)波長(zhǎng))＝280nm，em(發(fā)射波長(zhǎng))＝330nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：4μl；流速0.3ml/min；流動(dòng)相a為0.1％(v/v)甲酸水溶液，流動(dòng)相b為0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液，梯度洗脫，梯度洗脫程序見表2。

表2流動(dòng)相梯度程序

1.4樣品前處理

1.4.1樣品提取

稱取10g粉碎好的水果樣品草莓于100ml具塞離心管中，加入20.0ml乙腈，渦旋2min，加入5g氯化鈉，蓋上蓋子，劇烈振搖1min，4000r/min離心5min，使乙腈和水相分層。

1.4.2樣品凈化

移取10.0ml上層乙腈溶液于100ml梨形瓶中，40℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至干，加入4ml含2％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10，v/v)淋洗液溶解殘?jiān)?，移入用淋洗液活化好的nh2固相萃取小柱中，收集流出液于50ml雞心瓶中，再用淋洗液洗滌梨形瓶2次，每次用3.0ml淋洗液，再移入上述nh2固相萃取小柱中，合并流出液，在30℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至干，用1.0ml含0.1％(v/v)甲酸的乙腈-水溶液(3:7，v/v)溶解殘?jiān)?，?jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，得樣品溶液，供超高效液相色譜測(cè)定。

nh2固相萃取小柱用淋洗液活化的步驟為:向nh2固相萃取小柱中加入5-6ml含2％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10，v/v)淋洗液，不收集。

2結(jié)果與討論

2.1凈化方法的選擇

水果樣品草莓經(jīng)乙腈提取，鹽析分層后進(jìn)行凈化操作。5種萘衍生物中，naa、2-noa和npa都有一定的酸性，實(shí)驗(yàn)最終選擇具有陰離子交換作用力的nh2固相萃取小柱凈化樣品，酸性二氯甲烷-乙腈溶液作為洗脫劑。

在前期的篩選實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明通過比較洗脫劑在不同甲酸含量和溶劑比例下目標(biāo)化合物的回收率(如圖1所示)，在4種不同洗脫劑〔a.含1％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(95:5，v/v)；b.含1％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10，v/v)；c.含2％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(95:5，v/v)；d.含2％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10，v/v)〕條件下，nad、naa和npa的回收率均能達(dá)到80％以上。2-noa的回收率受洗脫劑中甲酸含量的影響較大，當(dāng)洗脫劑含1％(v/v)甲酸時(shí)，2-noa的回收率不到60％，洗脫劑中甲酸含量增加到2％(v/v)時(shí)，2-noa的回收率能達(dá)到80％。而name的回收率則與洗脫劑中乙腈的含量成正比，當(dāng)洗脫劑為二氯甲烷-乙腈(95:5，v/v)時(shí)，name的回收率不到70％，當(dāng)洗脫劑為二氯甲烷-乙腈(90:10，v/v)時(shí)，name的回收率能達(dá)到80％以上。因此，最終確定以含2％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10，v/v)溶液作為nh2固相萃取小柱的洗脫劑，此條件下5個(gè)化合物均能獲得較好的回收率。

2.2儀器條件的優(yōu)化

用液相色譜熒光檢測(cè)器對(duì)nad、naa、2-noa、npa和name標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)掃描，5個(gè)化合物的最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)在270-280nm和330-340nm附近。試驗(yàn)比較了acquitybehc18色譜柱和acquitybehphenyl色譜柱和acquitycortecsc18+色譜柱在水-甲醇，水-乙腈，0.1％甲酸(v/v)-甲醇，0.1％甲酸(v/v)-乙腈不同流動(dòng)相下對(duì)色譜分離的影響，以水-乙腈為流動(dòng)相，通過改變?nèi)軇O性進(jìn)行梯度洗脫能夠使5種化合物在一定的時(shí)間內(nèi)獲得比水-甲醇更好的分離效果，水相中加入0.1％甲酸(v/v)可以改善化合物的色譜峰形和獲得更穩(wěn)定的保留。c18色譜柱、phenyl色譜柱和cortecsc18+色譜柱在0.1％甲酸(v/v)-乙腈為流動(dòng)相時(shí)，對(duì)5個(gè)化合物的分離效果無(wú)明顯差異。因此，試驗(yàn)確定采用較通用的behc18色譜柱，0.1％(v/v)甲酸-乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫，在激發(fā)波長(zhǎng)280nm，發(fā)射波長(zhǎng)330nm下進(jìn)行nad、naa、2-noa、npa和name的測(cè)定(標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖見圖2)。從草莓空白樣品和草莓加標(biāo)樣品色譜圖(圖3、圖4)可以看出，該條件下5種萘衍生物在樣品中基本無(wú)色譜干擾。

草莓空白樣品：稱取10g粉碎好的草莓樣品直接進(jìn)行樣品提取凈化處理得到的空白測(cè)試樣品。

草莓加標(biāo)樣品：稱取10g粉碎好的草莓樣品，添加一定濃度(具體數(shù)值參見表3)萘衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行樣品提取凈化處理得到的加標(biāo)測(cè)試樣品。

2.3線性范圍與檢出限

將10mg/l的nad、naa、2-noa、npa和name混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋成0.005、0.01、0.02、0.1和1.0mg/l的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，經(jīng)超高效液相色譜儀測(cè)定，5種萘衍生物在0.005-1.0mg/l濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r²)≥0.99996，回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，根據(jù)信噪比(s/n)≥10的峰響應(yīng)值和樣品前處理的稀釋倍數(shù)，確定方法定量限(loq)為0.001-0.002mg/kg。

表3回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r²)、定量限(loq)

2.4方法的準(zhǔn)確度與精密度

對(duì)水果空白樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，添加水平為0.004、0.02和0.2mg/kg，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，5種萘衍生物在水果中的添加回收率為77.6％-95.0％，rsd為4.3％-11.2％。

表4添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)(n＝6)

采用與草莓相同的實(shí)驗(yàn)方法，我們又測(cè)定了葡萄和蘋果，具體數(shù)值見表3。

由于水果品種眾多，上述實(shí)驗(yàn)我們只列舉了草莓、葡萄和蘋果三種具有代表性的水果，但是本檢測(cè)方法對(duì)所有水果均通用。選取上述三種水果是因?yàn)槠咸押吞O果普遍食用，草莓基質(zhì)相對(duì)其它水果更加復(fù)雜，更能反映本方法的前處理凈化情況和色譜分離情況。

總之，本發(fā)明建立了超高效液相色譜-熒光檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定水果中1-萘乙酰胺(nad)、1-萘乙酸(naa)、2-萘氧乙酸(2-noa)、1-萘丙酸(npa)和1-萘乙酸甲酯(name)5種萘衍生物的方法。以乙腈為樣品提取液；nh2固相萃取小柱凈化，含1％-2％甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10-95:5，v/v)為淋洗液；用1.7μm，2.1×100mmc18色譜柱分離，0.1％(v/v)甲酸水溶液-0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液為流動(dòng)相；于超高效液相色譜熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)280nm，發(fā)射波長(zhǎng)330nm下測(cè)定。5種化合物在質(zhì)量濃度0.005-1.0mg/l范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r²)≥0.99996。當(dāng)樣品中添加水平為0.004、0.02和0.2mg/kg時(shí)，回收率為77.6％-95.0％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)為4.3％-11.2％，方法檢出限為0.001-0.002mg/kg。本方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，適用于水果中nad、naa、2-noa、npa和name這5種萘衍生物的同時(shí)測(cè)定。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。