本發(fā)明涉及分子生物學分析及可視化儀器研制領(lǐng)域。更具體地，涉及一種肺癌診斷模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

質(zhì)譜成像是一種新的分子成像技術(shù)，它可獲得分子在組織切片中的空間分布，相比現(xiàn)有技術(shù)，它不需要特異性的標記，通過一次成像掃描分析，可以獲得上百種不同分子的分布圖。通過多分析物分布圖與組織病理或臨床信息相互關(guān)聯(lián)，使得質(zhì)譜成像技術(shù)有望成為一種理想的組織病理檢查方法。如maldi-msi成像技術(shù)可以對多肽、蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)等化合物進行檢測，其檢測限在atto摩爾水平的范圍內(nèi)。maldi-msi的質(zhì)譜成像的空間分辨率通常約為50-200μm。雖然低至幾個微米的分辨率的成像也可以實現(xiàn)，但質(zhì)譜檢測需要依賴更高靈敏度的質(zhì)譜分析器。desi-msi是一種常壓敞開式質(zhì)譜成像技術(shù)，不需要在高真空和封閉條件下進行試驗，樣品前處理簡單，因此在組織樣本的成像分析研究中得到迅速發(fā)展。desi更適用于研究小分子代謝物在生物組織中的空間分布，對于生物組織中脂類化合物的成像效果很好，但對于低豐度和低分子量的內(nèi)源性代謝物的成像分析卻鮮有報道。盡管近些年關(guān)于內(nèi)源性代謝物的質(zhì)譜成像研究日益受到重視，報道逐年增多，但在所能檢測的分子種類的范圍、檢測靈敏度和成像質(zhì)量等方面尚存在諸多問題需要解決。目前臨床上用于肺癌診斷的檢查手段主要有ct、pet-ct、支氣管鏡檢查、脫落細胞學檢查、組織穿刺活檢等，但是存在費用較高，穿刺活檢成功率不高，病情隨訪時間內(nèi)必須接受多次大劑量射線輻射的劣勢，診斷準確率和敏感性也有待提高，且不能判斷腫瘤預后，因而探索與肺癌診斷、治療效果隨訪、預后相關(guān)的標記物顯得尤為必要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種肺癌診斷模型的構(gòu)建方法，能夠更快捷、更靈敏、更特異地篩查肺癌，進而更有效地指導肺癌治療。

為達到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

一種肺癌診斷模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：(1)獲取3組組織標本切片，(2)利用afai-ms獲得3組肺癌組織標本切片的代謝脂質(zhì)分子分布圖，尋找組內(nèi)不同組織的脂質(zhì)分子表達差異，建立快速區(qū)分癌與正常組織的肺癌快速診斷模型、肺癌分子病理診斷模型和肺癌基因診斷模型；其中，3組組織標本切片包括1)肺癌組織、正常組織、癌旁組織，2)腺癌組織、鱗癌組織、小細胞癌組織，3)egfr基因突變與egfr野生型肺癌組織。

本發(fā)明的有益效果如下：

基于afai-msi技術(shù)的構(gòu)建肺癌診斷模型的方法具有以下優(yōu)勢：

1)無需特異性標記，能對已知目標和未知內(nèi)源性代謝物進行成像分析；

2)靈敏度高，對各類代謝物的檢測覆蓋范圍寬；

3)基于多代謝物相圖的直觀方式，可客觀呈現(xiàn)組織的各種生理、病理狀態(tài)和類型；

4)可提供豐富的生物化學信息，可為生物醫(yī)藥、分子生物學等方面的研究從代謝物水平提供新的視角；

5)成像速度快，1cm²的組織切片成像可在半小時內(nèi)完成

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細的說明。

圖1示出afai-msi生物組織成像分析原理。

圖2示出afai生物組織成像分析步驟圖。

圖3示出代表性肺癌組織與正常組織提取的質(zhì)譜峰。

圖4示出肺癌快速診斷模型、肺癌分子病理診斷模型和肺癌基因診斷模型。

圖5示出(a)肺正常組織和(b)肺癌組織的afai-ms圖像。

圖6示出(a)腺癌組織和(b)鱗癌組織的afai-ms圖像。

圖7示出egfr(wild)和egfr(mut)的afai-ms圖像。

具體實施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發(fā)明的保護范圍。

1、樣品及試劑

(1)組織樣本：人體術(shù)后肺癌組織切片按臨床規(guī)范及倫理要求收集。

(2)試劑：甲醇、乙腈、異丙醇(ipa)和甲酸(hplc級，購自德國merck公司)、純凈水(購于杭州娃哈哈集團有限公司)。

2、實驗儀器與裝置

(1)實驗儀器

自制的afai-msi成像系統(tǒng)平臺；超高壓液相色譜儀(dionexultimate3000，thermofisher)配有高壓二元梯度泵。q-orbitrap(qexactive，thermofisher)質(zhì)譜儀，配備自制的afai離子源。數(shù)據(jù)采集和分析采用xcalibur3.0數(shù)據(jù)系統(tǒng)和自制的質(zhì)譜成像控制軟件，成像數(shù)據(jù)分析采用自制的質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)處理軟件。

(2)afai-msi成像技術(shù)平臺

自制的空氣動力輔助離子化(afai)離子源，主要由以下部分組成：噴霧系統(tǒng)由電噴霧毛細管(od150μm，id100μm)、霧化氣管路、噴霧液流路組成，并安裝于多維手動精密調(diào)節(jié)裝置上；不銹鋼離子傳輸管(od4mm，id3mm)、與商用質(zhì)譜儀分析器的接口、真空泵管路和抽氣泵(0～60l/min，本單位真空抽氣系統(tǒng)或me4nt，vacuumbrand公司)。氣體流量計采用玻璃轉(zhuǎn)子流量計(0～45l/min，lzb-10wb，天津流量儀表有限公司)，接于抽氣泵和afai離子源出口。兩路高壓電源(-10000～10000v可調(diào)，東文高壓)分別施加在噴霧毛細管和離子傳輸管上。

質(zhì)譜成像控制平臺：自組裝的3d(x、y、z)樣品移動臺，精度控制在微米量級，三維樣品臺分別由步進平移臺sc100和步進電機控制器組裝而成(北光世紀光學儀器廠,北京,中國)，xyz三維電動平移臺控制箱(mts225,北光世紀光學儀器廠)、電噴霧噴嘴(od150μm，id100μm)、4d(x、y、z、旋轉(zhuǎn))精密手動噴霧系統(tǒng)調(diào)節(jié)裝置。自制的afai與q-orbitrap質(zhì)譜接口，自制的數(shù)據(jù)采集自動同步裝置。

(3)afai-msi平臺相關(guān)參數(shù)及數(shù)據(jù)采集條件

實驗過程中，設置好q-orbitrap質(zhì)譜儀及afai離子源的基本參數(shù)，冷凍保存的組織切片經(jīng)真空干燥后，直接進行質(zhì)譜成像分析。組織切片的質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)的采集采用逐行掃描方式。采用自編的質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)處理軟件(massimager1.0)進行質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)處理和分析，在“質(zhì)譜圖像生成參數(shù)”項下設置成像離子的質(zhì)量數(shù)，精確到小數(shù)點第4位?！百|(zhì)荷比容差”設置為0.005da，“強度歸一化值”設置為“全局圖像”或某一數(shù)值大??；“圖像質(zhì)量”設置為中，“預設色彩圖”點選為“光譜”。在色彩圖坐標上將0值設為黑色。在eic通道前的復選框中選中某一離子，在圖像窗口中顯示該離子的成像圖。

實施例1肺癌診斷模型的構(gòu)建

1、獲取組織標本切片

經(jīng)手術(shù)切除新鮮冰凍的3組組織標本，包括：1)肺癌組織、正常組織、癌旁組織，2)腺癌組織、鱗癌組織、小細胞癌組織，3)egfr基因突變與egfr野生型肺癌組織。

制備3組組織標本的切片，使其厚度為8um，用h&e染色。

2、組織切片的afai-msi(原理如圖1所示)掃描及數(shù)據(jù)處理

在配備有定制的afai離子源的qexactive混合四極orbitrap質(zhì)譜儀(thermofisherscientific，usa)上進行3組組織標本的切片的afai-msi分析，在正離子和負離子模式中獲得數(shù)據(jù)。在正離子掃描模式中，通過將甲醇和水(8:2，v/v)與0.1％甲酸混合，而甲醇：水(8：2，v/v)用作負離子掃描模式中的噴霧溶劑。溶劑流速為5μl/min，萃取流量為45l/min。所有數(shù)據(jù)采集都使用xcalibur2.3軟件進行操作。質(zhì)譜數(shù)據(jù)記錄在m/z100-1000的質(zhì)量范圍內(nèi)。噴射電壓為±8.5kv，管電壓為±3.0kv。毛細管溫度設定在450℃。orbitrap的分辨率設置為70000。

將樣本分為訓練和驗證集進行統(tǒng)計分析，按2:1比例隨機分配樣本。對所有組織樣品進行afai-msi分析(具體步驟如圖2所示)?；诜伟┙M織相應h&e染色光學圖像，分別多次多處提取感興趣區(qū)域(roi)中肺癌組織及相鄰癌旁組織、腺癌及鱗癌、egfr基因突變與egfr野生型肺癌組織的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。然后將多個提取的roi區(qū)域的矩陣數(shù)據(jù)文件導入markerview1.2.1軟件(absciex)進行背景扣除，峰值采集和峰值對齊后，然后對處理后的數(shù)據(jù)導入simca-p12.0軟件(umetricsab，sweden)建立分類模型。這里使用的多元統(tǒng)計方法包括正交偏最小二乘判別分析(opls-da)和偏最小二乘判別分析(pls-da)。其中opls-da用于篩選有統(tǒng)計學意義的差異離子峰和基于差異離子峰建立肺癌快速診斷模型(圖3給出了代表性肺癌組織與正常組織提取的質(zhì)譜峰)、肺癌分子診斷模型、肺癌基因診斷模型。pls-da用于檢驗該模型的穩(wěn)定性和有無擬合。分類后，通過s-plot和可變重要(variableimportance，vip)優(yōu)先選擇具有高協(xié)方差和高相關(guān)性的區(qū)別變量。候選生物標志物通過獨立的t檢驗(microsoftofficeexcel2010)進一步確認其是否具有明顯的統(tǒng)計學差異，實驗組之間潛在生物標志物水平的變化和比較以直方圖(graphpadprism6.02)表示。受試者工作曲線(roc)和曲線下面積(auc)值用于評估所選變量的診斷效能(ibmspssstatistics19.0.0)。自研的質(zhì)譜成像軟件(massimagerpro)用于可視化每個候選生物標志物在生物組織中的分布及豐度。

通過以上方法獲得能建立快速區(qū)分癌與正常組織的肺癌快速診斷模型、肺癌分子診斷模型和肺癌基因診斷模型(見圖4)，其中癌與正常組織的肺癌快速診斷模型的差異的m/z為760.6、246.9和329.3(見圖5)，腺癌和鱗癌的差異的m/z為282.1、276.1和637.6(見圖6)，egfr基因突變與egfr野生型肺癌組織的差異的m/z為307.3、732.6和746.6(見圖7)。

顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。