本發(fā)明涉及一種量子點(diǎn)標(biāo)記仿生免疫分析-毛細(xì)管電泳檢測(cè)敵百蟲方法，屬于食品安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種敵百蟲的快速靈敏檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

敵百蟲被廣泛用于植物病蟲害的防治，它很容易通過皮膚和呼吸道進(jìn)入人體內(nèi)。近年來，敵百蟲因其高毒性和潛在的致癌特性而受到世界各國(guó)的廣泛關(guān)注。gb16319-1996規(guī)定食品中敵百蟲最大殘留量不得高于0.1mg/kg。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于食品中敵百蟲含量檢測(cè)的報(bào)道有很多，包括：氣相色譜；高效液相色譜；液、氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用；毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光和電化學(xué)檢測(cè)方法等，但上述幾種檢測(cè)方法均需要昂貴的儀器和較長(zhǎng)的分析時(shí)間。儀器檢測(cè)所使用的設(shè)備價(jià)格昂貴，通常還需要復(fù)雜樣品前處理技術(shù)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；酶聯(lián)免疫法雖然具有高靈敏度和低檢出限，但對(duì)敵百蟲等小分子物質(zhì)，特異性強(qiáng)的生物抗體制備困難，并且保存不當(dāng)容易失活。分子印跡聚合物作為仿生抗體，具有選擇性高，制備周期短，不失活易保存等優(yōu)點(diǎn)，因此作為人工抗體應(yīng)用于酶聯(lián)免疫分析，建立仿生免疫吸附檢測(cè)技術(shù)成為研究的熱點(diǎn)。然而由于酶的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和易變的特性，導(dǎo)致以酶作為標(biāo)記物的仿生酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的靈敏度相對(duì)較低。因此，用結(jié)構(gòu)較小的納米級(jí)粒子量子點(diǎn)作為標(biāo)記物，以具有高效分離作用的毛細(xì)管電泳儀作為檢測(cè)器建立新型仿生免疫檢測(cè)方法(量子點(diǎn)標(biāo)記仿生免疫分析-毛細(xì)管電泳方法未見報(bào)道)，用于檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品及食品中的敵百蟲，具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)的敵百蟲檢測(cè)方法存在的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、儀器價(jià)格昂貴、靈敏度低等缺陷，提供一種量子點(diǎn)標(biāo)記仿生免疫分析-毛細(xì)管電泳檢測(cè)敵百蟲方法。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

一種量子點(diǎn)標(biāo)記仿生免疫分析-毛細(xì)管電泳檢測(cè)敵百蟲方法，包括以下步驟：

1.量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原的合成：將敵百蟲半抗原、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺和硒化鎘/硫化鋅(cdse/zns)氨基量子點(diǎn)按照200:4000:1～5的摩爾比例依次加入到反應(yīng)容器中，充分混勻；再加入50～100μlph7.4的硼酸鹽緩沖液，室溫反應(yīng)2～10h。反應(yīng)結(jié)束后，離心除團(tuán)聚，并將反應(yīng)物超濾濃縮進(jìn)行分離純化得到量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原；量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原2-8℃下保存。

2.使用ph7.4的硼酸鹽溶液將步驟1)得到的量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原稀釋300～1000倍，取1～5ml稀釋后的量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原與2～5ml敵百蟲標(biāo)樣梯度稀釋液，然后加入5～10mg的分子印跡聚合物顆粒，在室溫下攪拌60～100min；5000r/min離心20min后，0.22μm濾膜過濾后毛細(xì)管電泳檢測(cè)；根據(jù)毛細(xì)管電泳峰面積計(jì)算抑制率，繪制敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.準(zhǔn)確稱取1～3g蔬菜樣品，加入10～15ml的超純水超聲提取3次，0.22μm濾膜過濾得樣品提取液；將樣品提取液代替步驟2)中所述敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)步驟2)操作，計(jì)算出待測(cè)物中敵百蟲含量。

本發(fā)明所使用的分子印跡聚合物顆粒根據(jù)孟玲(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文)，名稱為“基于分子印跡技術(shù)的敵百蟲新型檢測(cè)方法研究”制備得到。具體為：

將0.257g敵百蟲和0.172g甲基丙烯酸(maa)溶于3ml氯仿中，磁力攪拌30min；加入0.754ml二甲基丙烯酸乙二醇酯(egdma)和20mg偶氮二異丁腈(aibn)，超聲15min，充氮?dú)夂?8℃水浴18h；合成的聚合物研磨后，用甲醇/冰乙酸(9:1,v/v體積比)連續(xù)洗脫24h去除敵百蟲，再用甲醇洗至中性，60℃真空干燥12h后得分子印跡聚合物顆粒。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：

1.本發(fā)明使用的標(biāo)記物量子點(diǎn)結(jié)構(gòu)較小，能夠促進(jìn)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，因而提高了檢測(cè)方法的靈敏度(最低檢出限低于酶聯(lián)免疫和氣相色譜)。

2.本發(fā)明將仿生免疫技術(shù)與毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法聯(lián)用，大大縮短了分析時(shí)間，并有效降低了敵百蟲的檢測(cè)限，適用于快速檢測(cè)敵百蟲。

3.本發(fā)明使用分子印跡聚合物作為仿生抗體，可重復(fù)使用多次，大大降低了成本，且實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，分析流程短，靈敏度高且檢測(cè)限低，適用于各種食品中敵百蟲的快速檢測(cè)。

本發(fā)明與現(xiàn)有其他檢測(cè)方法的比較：

附圖說明

圖1為敵百蟲qd-bi-ce標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，本發(fā)明的靈敏度(抑制率50％值)為0.81mg/l，最低檢測(cè)限(抑制率15％值)為0.35μg/l。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明；下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明是將仿生免疫技術(shù)與毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法聯(lián)用，從而建立對(duì)敵百蟲具有高靈敏度的快速檢測(cè)方法。其具體實(shí)施例為：

1.量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原的合成：將16μl敵百蟲半抗原(1mm)、32μl1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(10mm)和10μl氨基量子點(diǎn)(8μm)依次加入到反應(yīng)容器中，充分混勻；加入72μlph7.4的硼酸鹽緩沖液，避光室溫反應(yīng)2h；反應(yīng)結(jié)束后，離心(8000r/min)除團(tuán)聚，并將反應(yīng)物超濾濃縮進(jìn)行分離純化得到量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原；量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原在2-8℃下保存。

2.將0.257g敵百蟲和0.172g甲基丙烯酸(maa)溶于3ml氯仿中，磁力攪拌30min；加入0.754ml二甲基丙烯酸乙二醇酯(egdma)和20mg偶氮二異丁腈(aibn)，超聲15min，充氮?dú)夂?8℃水浴18h；合成的聚合物研磨后，用甲醇/冰乙酸(9:1,v/v體積比)連續(xù)洗脫24h去除敵百蟲，再用甲醇洗至中性，60℃真空干燥12h后得分子印跡聚合物顆粒。

3.以分子印跡聚合物顆粒作為仿生抗體，仿生免疫分析-毛細(xì)管電泳方法流程如下：5ml量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原(用ph值7.4的硼酸鹽溶液稀釋至1:300)與5ml敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后加入5mg的分子印跡聚合物顆粒，室溫下攪拌80min；5000r/min離心20min，0.22μm濾膜過濾后毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

4.分別配制濃度為10000,1000,100,10,1,0.1μg/l的敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照毛細(xì)管電泳-仿生免疫分析方法流程得到一系列不同的峰面積，按照下列公式計(jì)算不同濃度敵百蟲對(duì)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率值：

式中：

ic％——敵百蟲對(duì)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率；

s樣品總—5ml(一定濃度)敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)溶液與5ml量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原(1/300)混合后進(jìn)毛細(xì)管電泳，量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原的峰面積；

s樣品未反應(yīng)—5ml(一定濃度)敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)溶液與5ml量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原(1/300)與5mg仿生抗體反應(yīng)，達(dá)到平衡后，離心取上清液進(jìn)毛細(xì)管分析后，量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原的峰面積；

s對(duì)照總—5ml超純水與5ml量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原(1/300)混合后進(jìn)毛細(xì)管電泳，量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原的峰面積；

s對(duì)照未反應(yīng)—5ml超純水與5ml量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原(1/300)與5mg仿生抗體反應(yīng)，達(dá)到平衡后，離心取上清液進(jìn)毛細(xì)管分析后，量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原的峰面積；

以敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5.分別稱取油菜和韭菜各1g，切碎，加入10ml超純水超聲提取3次，提取液定容至50ml，0.22μm濾膜過濾得到樣品提取液。將樣品提取液代替步驟3)中所述敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)步驟3)操作，根據(jù)上述公式計(jì)算得出油菜和韭菜提取液的抑制率分別為18.34％和29.66％，從而計(jì)算出所測(cè)油菜和韭菜中敵百蟲含量分別為0.0274mg/kg和0.507mg/kg。