本發(fā)明屬于免疫測定法技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于輕中度腦損傷的快速診斷試劑及含有該試劑的試劑盒及該試劑盒的制備和檢測方法。

背景技術(shù)：

顱腦創(chuàng)傷(tbi)目前已是導(dǎo)致全球病死和病殘的主要公眾健康問題。美國每年有235×103例非致命性顱腦創(chuàng)傷患者住院治療，43.30％遺留不同程度殘疾。我國顱腦創(chuàng)傷年發(fā)生率為每10萬人中有783例，其中g(shù)lasgow昏迷量表(gcs)評(píng)分≤8分且傷后遺忘時(shí)間(pta)>24h的重型顱腦創(chuàng)傷約占10％。

在美國每年有超過150萬的兒童和成人遭患腦震蕩，全球范圍內(nèi)有成千上萬的軍人忍受著輕度的創(chuàng)傷性腦損傷。目前的檢測還不能確定損傷的程度或是否15-30％的受傷患者會(huì)經(jīng)受嚴(yán)重的、永久性的認(rèn)知缺陷，如處理速度、工作記憶和多種思想之間轉(zhuǎn)換和平衡的能力。目前診斷依據(jù)主要是臨床癥狀和神經(jīng)心理測驗(yàn)，影像學(xué)和生化檢測作為輔助手段，可用于排除其他病因?qū)е碌挠洃浰ネ?。臨床癥狀表現(xiàn)明顯的時(shí)候，現(xiàn)有醫(yī)療手段去逆轉(zhuǎn)已經(jīng)變得非常困難。那么預(yù)防疾病的發(fā)生，早期診斷變得尤為重要。現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)腦部損傷的病理病變實(shí)際上無法用傳統(tǒng)的影像，生化手段進(jìn)行檢測。一個(gè)新的生物標(biāo)志物能夠準(zhǔn)確預(yù)測，腦損傷患者持續(xù)發(fā)展出現(xiàn)白質(zhì)纖維束結(jié)構(gòu)的破壞和輕度腦創(chuàng)傷后永久性的認(rèn)知功能障礙。

腦損傷標(biāo)志物是指在腦部組織和細(xì)胞發(fā)生發(fā)育過程中，由腦部細(xì)胞本身合成、釋放，或由對腦部損傷反應(yīng)而產(chǎn)生的一類標(biāo)志物質(zhì)。這些物質(zhì)在正常成人中不存在或者是在癌癥患者中出現(xiàn)的水平顯著高于正常人。申請?zhí)枮?01580018413.5的發(fā)明創(chuàng)造公開了一種外傷性腦損傷和神經(jīng)退行性生物標(biāo)記物、方法和系統(tǒng)。該方法包括檢測患者樣品中的以下一種或多種：泛素c末端水解酶l1(uchl1)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(gfap)、醛脫氫酶1家族成員l1(aldh1l1)、磷酸化神經(jīng)絲重鏈(pnfh)、神經(jīng)絲中鏈(nfm)或神經(jīng)絲輕鏈(nfl)、α突觸核蛋白、視椎蛋白樣蛋白1(vilip1)和s100b。但是，以本申請發(fā)明人的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，由于個(gè)體差異的存在，上述單個(gè)因子或兩個(gè)因子的臨床試驗(yàn)都是失敗的，多個(gè)因子的組合也存在較大的不確定性。上述專利僅僅為一個(gè)布局專利，現(xiàn)有技術(shù)中尚未存在能排除個(gè)體差異的檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于輕中度腦損傷的快速診斷試劑及含有該試劑的試劑盒及該試劑盒的制備和檢測方法，達(dá)到在排除個(gè)體差異的前提下能快速確診輕中度腦損傷的目的。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：用于輕中度腦損傷的快速診斷試劑，包括捕獲抗體，其特征在于：所述捕獲抗體包括s100、gfap、uchl1分別制得的單克隆抗體。

該診斷試劑還包括檢測抗體，所述檢測抗體包括s100、gfap、uchl1分別制得的多克隆抗體。

作為改進(jìn)，所述捕獲抗體由如下步驟制備：(1)抗原的制備：將s100、gfap、uchl1基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到所需的抗原，該抗原作為標(biāo)準(zhǔn)品用；(2)捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑的捕獲抗體。

作為改進(jìn)，所述檢測抗體由如下步驟制備：(1)抗原的制備：把s100、gfap、uchl1的基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到抗原；(2)檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物，得到相應(yīng)的多克隆抗體為檢測抗體。

s100、gfap、uchl1在血清中的濃度參照值分別為1.2，1.5和0.6ng/ml，3項(xiàng)中若有2～3項(xiàng)超過濃度參照值則診斷為輕中度腦損傷。

包含上述診斷試劑的試劑盒包括以下制備步驟：(1)抗原的制備：將s100、gfap、uchl1基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到所需的抗原；(2)捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；(3)檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；(4)捕獲抗體包被：①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液將濃度為1μg/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；②.封蓋微量滴定板并在4℃下孵育過夜；③.棄去包被液，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200μlpbst，除去洗滌液和剩余的液滴，晾干放于4℃環(huán)境中；(5)封閉：每孔添加200μl封閉緩沖液，封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。捕獲抗體預(yù)先包被于微量滴定板的孔內(nèi)。

包含上述診斷試劑的試劑盒包括以下制備步驟：包括以下檢測步驟：(1)抗原的制備：將s100、gfap、uchl1基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)；(2)捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；(3)檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；(4)捕獲抗體包被：①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液將濃度為1μg/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；②.封蓋微量滴定板并在4℃下孵育過夜；③.棄去包被液，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200μlpbst，除去洗滌液和剩余的液滴，晾干放于4℃環(huán)境中；(5)封閉：①.在微量滴定板的每個(gè)孔添加200μl封閉緩沖液，封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)；②.封蓋微量滴定板并在37℃孵育1小時(shí)；(6)加樣：①.將100μl樣品添加到每個(gè)孔，在37℃孵育60分鐘；②.棄去樣品，并洗滌微量滴定板三次，每次在微孔中加入200μlpbst；③.將100μl濃度為0.5μg/ml的檢測抗體添加到每個(gè)孔；④.封蓋微量滴定板并在37℃孵育1小時(shí)；⑤.用pbst洗滌微量滴定板四次；⑥.添加100μl標(biāo)記二抗；⑦.封蓋微量滴定板并在37℃孵育1小時(shí)；⑧.用pbst洗滌微量滴定板四次；(7)檢測：①.將tmb溶液添加到每個(gè)孔，孵育15-30分鐘，添加等體積的終止液，然后在450nm處讀取光密度；(8)判斷：s100、gfap、uchl1在血清中的濃度參照值分別為1.2，1.5和0.6ng/ml，3項(xiàng)中若有2～3項(xiàng)超過濃度參照值則診斷為輕中度腦損傷。

本發(fā)明從眾多的腦損傷標(biāo)記物中，篩選出3個(gè)腦損傷標(biāo)記物s100，gfap和uchl1組成快速診斷試劑盒。三個(gè)因子中只要有2個(gè)因子的檢測結(jié)果達(dá)到了閥值，就能確診是否為輕中度腦損傷。該試劑盒克服了個(gè)體差異，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)的特點(diǎn)，其靈敏度及準(zhǔn)確性均達(dá)到96％以上。

附圖說明

圖1為本發(fā)明用于中輕度腦損傷患者快速診斷試劑盒的原理圖；

圖2為本發(fā)明用于中輕度腦損傷患者快速診斷試劑盒在正常人血液中檢測到s100/gfap/uchl1的濃度。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

用于中輕度腦損傷患者快速診斷試劑和試劑盒，包括捕獲抗體、捕獲抗體、封閉緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)記抗體、洗滌液及顯色液等。所述標(biāo)記抗體選用hrp標(biāo)記二抗。所述捕獲抗體包括s100、gfap和uchl1分別制得的單克隆抗體；通過對s100、gfap和uchl1的共同快速檢測，可以有效地提高檢測準(zhǔn)確率和靈敏度，有效的克服單憑檢測單個(gè)因子導(dǎo)致的不足。圖1為本發(fā)明用于中輕度腦損傷患者快速診斷試劑盒的原理圖。

所述捕獲抗體為將s100、gfap、uchl1克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到相應(yīng)的抗原，將所述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到的相應(yīng)單克隆抗體。

所述捕獲抗體的制備方法包括的步驟如下：(1)抗原的制備：通過分子克隆的方法把s100、gfap、uchl1基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到抗原，此抗原也可作為標(biāo)準(zhǔn)品用。所述抗原的制備也可以使用現(xiàn)有常規(guī)方法制備，在此不再累贅；(2)捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物，得到相應(yīng)的單克隆抗體為捕獲抗體。所述哺乳動(dòng)物是小鼠及兔子，優(yōu)選小鼠。所述捕獲抗體的制備也可以使用現(xiàn)有常規(guī)方法制備，在此不再累贅。

所述檢測抗體包括s100、gfap、uchl1分別制得的多克隆抗體。

所述檢測抗體為將s100、gfap、uchl1克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到相應(yīng)的抗原，將所述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到的相應(yīng)多克隆抗體。所述檢測抗體的制備方法包括的步驟如下：(1)抗原的制備：通過分子克隆的方法把s100、gfap、uchl1基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到抗原，此抗原也可作為標(biāo)準(zhǔn)品用；(2)檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物，得到相應(yīng)的多克隆抗體為檢測抗體。所述哺乳動(dòng)物是小鼠及兔子，優(yōu)選兔子。

其中，所述捕獲抗體可以預(yù)先包被于pvc材質(zhì)的微量滴定板的孔內(nèi)，可以簡化步驟，提高檢測效率。

用于中輕度腦損傷患者快速診斷試劑盒的制備方法，其包括以下步驟：

(1)抗原的制備：通過分子克隆的方法將s100、gfap、uchl1基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標(biāo)準(zhǔn)品用；

(2)捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；

(3)檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；

(4)捕獲抗體包被：

①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(ph9.6)將濃度為lμg/ml的捕獲抗體包被于微量滴定板的孔內(nèi)；

②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在4℃下孵育過夜；

③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體)，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200μ1pbst(磷酸鹽吐溫緩沖液)，在水槽上方輕輕甩動(dòng)微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃環(huán)境中備用；所述洗滌液為pbs(磷酸鹽緩沖液)中加入一定量的tween20，所述tween20的質(zhì)量百分比濃度為0.05％；

(5)封閉

①.在微量滴定板的每孔添加200μ1封閉緩沖液(為含1.2％bsa(牛血清白蛋白)的pbs(磷酸鹽緩沖液))，用于封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)；

②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37℃下孵育至少1小時(shí)，優(yōu)選的，孵育過夜。

用于中輕度腦損傷患者快速診斷試劑盒的檢測方法，其包括以下步驟：

(1)抗原的制備：通過分子克隆的方法將s100、gfap、uchl1基因克隆到真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標(biāo)準(zhǔn)品用；

(2)捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；

(3)檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動(dòng)物得到相應(yīng)的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；

(4)捕獲抗體包被：

①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(ph9.6)將濃度為lμg/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；

②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在4℃下孵育過夜；

③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體)，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200μ1pbst(磷酸鹽吐溫緩沖液，可以是含0.05％吐溫-20的ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液)，在水槽上方輕輕甩動(dòng)微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃環(huán)境中備用；所述洗滌液為pbs(磷酸鹽緩沖液)中加入一定量的tween20，tween20的質(zhì)量百分比濃度為0.05％；

(5)封閉

①.在微量滴定板的每個(gè)孔添加200μl封閉緩沖液(1.2％bsa/pbs)，封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)；

②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37℃下孵育至少1小時(shí)，優(yōu)選的，在4℃下孵育過夜；

(6)加樣

①.將100μι適當(dāng)稀釋(稀釋20倍)的樣品添加到每個(gè)孔，在37℃下孵育60分鐘；要得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果，通常做法是比較未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線的信號(hào)。每個(gè)酶標(biāo)板都必須測定標(biāo)準(zhǔn)品(兩重測定或三重測定)和空白樣，以確保準(zhǔn)確性；

②.棄去樣品，并洗滌微量滴定板三次，每次在微孔中加入200μ1pbst(磷酸鹽吐溫緩沖液)；

③.將100μι濃度為0.5μg/ml的檢測抗體添加到微量滴定板的每個(gè)孔；

④.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37℃下孵育1小時(shí)；

⑤.用pbst洗滌微量滴定板四次；

⑥.添加100μι標(biāo)記二抗，其在使用前便已在ros中稀釋10000倍(1:10000)。所述標(biāo)記二抗可以為hrp標(biāo)記羊抗兔。

⑦.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37℃下孵育1小時(shí)。

⑧.用pbst洗滌微量滴定板四次。

(7)檢測

①.將tmb(3，3'，5，5四甲基聯(lián)苯胺)溶液添加到每個(gè)孔，孵育15-30分鐘，添加等體積的終止液(2mh2s04)，然后在450nm處讀取光密度。

②.由系列稀釋液得到的數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度標(biāo)在x軸(對數(shù)標(biāo)度)上，而吸光度標(biāo)在y軸(線性標(biāo)度)上。通過內(nèi)插法在此標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出樣品濃度。

(8)判斷

s100、gfap、uchl1在血清中的濃度參照值分別為1.2，1.5和0.6ng/ml，3項(xiàng)中若有2～3項(xiàng)超過濃度參照值則診斷為輕中度腦損傷。

本發(fā)明用于中輕度腦損傷患者快速診斷試劑盒包括s100、gfap、uchl1三項(xiàng)指標(biāo)有倆項(xiàng)同時(shí)升高作為診斷腦損傷程度的標(biāo)準(zhǔn)，可以用于臨床上通過檢測血中3個(gè)腦損傷標(biāo)記物水平的高低對中度腦損傷患者的傷害程度進(jìn)行動(dòng)態(tài)評(píng)估。另外還可以用于臨床上對腦損傷患者后期癥狀判斷的應(yīng)用。

為確定本試劑盒能否用于對卵巢癌的治療效果進(jìn)行動(dòng)態(tài)評(píng)估，我們收集了8份中輕度腦損傷患者(gcs9-12)的血清。8個(gè)患者的檢測結(jié)果如下表所示，結(jié)果顯示腦損傷患者和正常人(3份)的血清中s100、gfap、uchl1的水平有顯著差異?；颊哐逯衧100，gfap，uchl1的水平會(huì)大大上升，提示本試劑盒能用于對腦損傷患者的進(jìn)行動(dòng)態(tài)評(píng)估。

圖2為本發(fā)明用于中輕度腦損傷患者快速診斷試劑盒在正常人血液中檢測到s100/gfap/uchl1的濃度，本發(fā)明確定s100、gfap、uchl1在血清中的參照濃度分別為1.2，1.5和0.6ng/ml，三項(xiàng)有兩項(xiàng)超過參照值作為輕中度腦損傷的標(biāo)準(zhǔn)。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思做出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者根據(jù)有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，均應(yīng)該在由本權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍之中。