本發(fā)明涉及一種鑒別移栽黃芪和野生黃芪的方法，具體屬于熒光輔助凝膠電泳技術(shù)，以黃芪多糖部分酸水解后差異性糖片段的含量為鑒定依據(jù)的移栽黃芪和野生黃芪的鑒別方法。
背景技術(shù)：
：傳統(tǒng)的野生黃芪主要是指生長(zhǎng)年限在5年以上、自然繁殖或人工撒種后自然生長(zhǎng)的蒙古黃芪或膜莢黃芪。野生的蒙古黃芪主要分布在山西、內(nèi)蒙、甘肅、陜西等省，其中山西和內(nèi)蒙古產(chǎn)的5～8年生的蒙古黃芪為道地藥材，具有“主根粗長(zhǎng)、少分支、綿性大、粉性強(qiáng)、甜味足、豆腥味濃”等特點(diǎn)。野生膜莢黃芪主產(chǎn)區(qū)為黑龍江、吉林，生長(zhǎng)年限在6年以上，商品量極小。移栽黃芪主要是指生長(zhǎng)年限在1～3年、人工栽培的蒙古黃芪或膜莢黃芪。生長(zhǎng)2～3年的移栽黃芪主要分布在甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古等省，以蒙古黃芪為主；河北、山東也有栽培一年即采收上市的膜莢黃芪。這種移栽黃芪外觀與野生黃芪有較大差別，呈現(xiàn)“主根短，分枝多，質(zhì)堅(jiān)硬，雞爪形，微甜而淡”等特征。二者的化學(xué)成分有差異導(dǎo)致其藥效不同，雖然黃芪根部形態(tài)特征有明顯區(qū)別，但制備成飲片或打粉后，肉眼難以區(qū)別。因此，近年來(lái)藥材市場(chǎng)上出現(xiàn)了兩種黃芪混雜現(xiàn)象，擾亂了中藥材市場(chǎng)。臨床研究表明，糖類成分是黃芪發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要物質(zhì)。因此，將糖類成分作為黃芪質(zhì)量控制與品質(zhì)評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)，具有良好的研究前景和意義。國(guó)內(nèi)外學(xué)者也采用苯酚硫酸法測(cè)定總多糖含量比較不同生長(zhǎng)年限、不同栽培方式的黃芪，然而，所測(cè)定的指標(biāo)缺乏專屬性特征，限制了應(yīng)用多糖作為黃芪鑒別的方法。授權(quán)公告號(hào)為104122287b的發(fā)明專利公開(kāi)了一種野生黃芪和栽培黃芪的鑒別方法，該方法通過(guò)核磁技術(shù)獲得黃芪藥材的核磁共振氫譜，對(duì)蔗糖、α-葡萄糖和β-葡萄糖信號(hào)分別進(jìn)行手動(dòng)積分，計(jì)算蔗糖和葡萄糖的積分面積比值，根據(jù)比值的范圍鑒別野生黃芪和栽培黃芪。申請(qǐng)公布號(hào)cn106093240a公開(kāi)了一種速生黃芪和野生黃芪的鑒別方法，該方法利用氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)分析黃芪中細(xì)胞壁糖類成分，從而區(qū)分速生黃芪和野生黃芪。上述方法中使用核磁技術(shù)和氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)，其實(shí)驗(yàn)成本高、操作復(fù)雜而且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理較為繁瑣，不適于普及和推廣。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有移栽黃芪和野生黃芪鑒別方法專屬性低、操作復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)成本高的技術(shù)問(wèn)題，提供一種鑒別移栽黃芪和野生黃芪的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種鑒別移栽黃芪和野生黃芪的方法，包括如下步驟：1)原料預(yù)處理：將干燥的黃芪粉碎成粉末后過(guò)100目篩得到黃芪細(xì)粉，備用；2)提取粗多糖：取上述黃芪細(xì)粉加水后在100℃的溫度下回流提取1h，降至室溫后離心取上清液；殘?jiān)偌铀貜?fù)提取1次，取上清，合并上清液；濃縮，將合并的上清液用95％的乙醇調(diào)節(jié)至含醇量為80％，3000r/min離心10min，合并沉淀，冷凍干燥得多糖粗粉；3)純化多糖：將步驟2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉與水的質(zhì)量比為1:200，向多糖粗粉溶液中加入濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液，所述濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液的加入量均為多糖粗粉溶液體積的10％，振搖后靜置30min，離心得到純化多糖，凍干，備用；4)多糖酸水解：取步驟3)得到的純化多糖10mg，加入0.5mol/l三氟乙酸500μl，混勻，隨后將混合液置于90℃保溫1h，反應(yīng)結(jié)束后，用氮吹干燥儀干燥多糖酸水解產(chǎn)物，然后加入適量甲醇清洗水解產(chǎn)物，繼續(xù)氮?dú)獯蹈桑?)多糖酸水解產(chǎn)物、三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化：取三糖標(biāo)準(zhǔn)品6mg、四糖標(biāo)準(zhǔn)品8mg以及步驟4)中的多糖酸水解產(chǎn)物，分別加入200μl的nacnbh3溶液，再分別加入200μl的ants衍生化試劑，渦旋，混勻；37℃恒溫反應(yīng)15h后，將三種產(chǎn)物用氮?dú)獯蹈?，溶?ml6mol/l的尿素溶液，制成三糖標(biāo)準(zhǔn)品、四糖標(biāo)準(zhǔn)品及多糖酸水解產(chǎn)物的衍生化樣品，其中三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化樣品用6mol/l的尿素溶液分別稀釋成不少于6個(gè)濃度梯度的衍生化樣品；6)衍生化樣品電泳分析：取步驟5)中多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化樣品，采用垂直板凝膠電泳分離每個(gè)衍生化樣品，分離膠為濃度為30％的聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠為濃度為8％的聚丙烯酰胺凝膠，電泳緩沖液為ph8.0-9.0、濃度0.1-0.2mol/l的tris-boric，上樣量為1-3μl，凝膠在uv300nm條件下成像，獲得多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品的電泳圖；7)繪制三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線：將多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品的電泳圖導(dǎo)入quantityone軟件，經(jīng)過(guò)處理后，得到多糖酸水解產(chǎn)物及三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值，以三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；8)移栽黃芪和野生黃芪的鑒別：將多糖酸水解產(chǎn)物的光密度值帶入步驟7)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黃芪多糖中三糖和四糖的含量，并根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)鑒別移栽黃芪和野生黃芪：當(dāng)三糖含量＜3.0mg/ml，且四糖含量＜3.2mg/ml時(shí)，為移栽黃芪；當(dāng)三糖含量＞3.0mg/ml，且四糖含量＞3.2mg/ml時(shí)，為野生黃芪。進(jìn)一步地，步驟2)中所述黃芪細(xì)粉與水的質(zhì)量比為1:100。進(jìn)一步地，步驟2)中所述殘?jiān)c水的質(zhì)量比為1:80。進(jìn)一步地，步驟6)中分離膠和濃縮膠的配制溶劑為ph8.0～9.0、濃度0.1～0.2mol/l的tris-boric緩沖液。進(jìn)一步地，步驟6)中的電泳分離過(guò)程分兩步進(jìn)行，首先采用60-80v的分離電壓電泳分離40-60min，隨后采用100-200v的分離電壓電泳分離100-120min。本發(fā)明的有益效果是：1)本發(fā)明將黃芪中的多糖部分酸水解，利用熒光輔助凝膠電泳技術(shù)分析，找出移栽黃芪和野生黃芪糖成分的差異，用于黃芪栽培方式的鑒別。該方法不僅操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)成本低，而且不同栽培方式黃芪多糖部分酸水解后形成的糖組分差異明顯，可用于黃芪栽培方式的鑒別。2)本發(fā)明采用的熒光輔助凝膠電泳(pace)技術(shù)，是一種十分便捷的多糖水解產(chǎn)物分離技術(shù)，具有分辨率高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、可多個(gè)樣品同時(shí)分析等特點(diǎn)；由于糖類化合物不帶紫外或熒光基團(tuán)，本發(fā)明在進(jìn)行pace分析之前，使用衍生化試劑8-氨基萘-1，3，6-三磺酸鈉(ants)對(duì)多糖水解產(chǎn)物做衍生化處理，使多糖水解產(chǎn)物攜帶紫外基團(tuán)和熒光基團(tuán)，使檢測(cè)的靈敏度大大提高。附圖說(shuō)明圖1為不同栽培方式黃芪多糖部分酸水解產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；圖2為不同栽培方式黃芪多糖部分酸水解產(chǎn)物的指紋圖譜；圖3為差異性糖片段的t檢驗(yàn)分析圖；圖4為不同栽培方式的黃芪多糖部分酸水解產(chǎn)物的pls-da圖；圖5為pls-da分析模型驗(yàn)證圖；圖6為差異性糖片段的載荷圖；圖7為不同栽培方式的黃芪多糖部分酸水解產(chǎn)物的差異性糖片段數(shù)目圖；圖8為三糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖9為四糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1本實(shí)施例中的一種鑒別移栽黃芪和野生黃芪的方法，包括如下步驟：1)原料預(yù)處理：將干燥的黃芪粉碎成粉末后過(guò)100目篩得到黃芪細(xì)粉，備用；2)提取粗多糖：取上述黃芪細(xì)粉約5g，精密稱定后置于1000ml圓底燒瓶中，加水500ml，在100℃的溫度下回流提取1h，降至室溫后離心取上清液；殘?jiān)偌铀?00ml，重復(fù)提取1次，取上清，合并上清；濃縮，將合并的上清液用95％的乙醇調(diào)節(jié)至含醇量為80％，3000r/min離心10min，合并沉淀，冷凍干燥得多糖粗粉；3)純化多糖：將步驟2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉與水的質(zhì)量比為1:200，向多糖粗粉溶液加入濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液，所述濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液的加入量均為多糖粗粉溶液體積的10％，振搖后靜置30min，離心得到純化多糖，凍干，備用；4)多糖酸水解：取步驟3)得到的純化多糖10mg，加入0.5mol/l三氟乙酸500μl，混勻，隨后將混合液置于90℃保溫1h，反應(yīng)結(jié)束后，用氮吹干燥儀干燥多糖酸水解產(chǎn)物，然后加入適量甲醇清洗水解產(chǎn)物，繼續(xù)氮?dú)獯蹈桑?)多糖酸水解產(chǎn)物、三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化：取三糖標(biāo)準(zhǔn)品6mg、四糖標(biāo)準(zhǔn)品8mg以及步驟4)中的多糖酸水解產(chǎn)物，分別加入200μl的nacnbh3溶液，再分別加入200μl的ants衍生化試劑，渦旋，混勻；37℃恒溫反應(yīng)15h后，將三種產(chǎn)物用氮?dú)獯蹈?，溶?ml6mol/l的尿素溶液，制成三糖標(biāo)準(zhǔn)品、四糖標(biāo)準(zhǔn)品及多糖酸水解產(chǎn)物的衍生化樣品，其中三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化樣品用6mol/l的尿素溶液分別稀釋成不少于6個(gè)濃度梯度的衍生化樣品；6)衍生化樣品電泳分析：取步驟5)中多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化樣品，采用垂直板凝膠電泳分離每個(gè)衍生化樣品；分離膠為濃度為30％的聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠為濃度為8％的聚丙烯酰胺凝膠，所述分離膠和濃縮膠的配制溶劑均為ph8.2、濃度0.1mol/l的tris-boric緩沖液；電泳緩沖液為ph8.2、濃度0.1mol/l的tris-boric，上樣量為1μl；首先采用60v的分離電壓電泳分離60min，隨后采用200v的分離電壓電泳分離120min；凝膠在uv300nm條件下成像，獲得多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品的電泳圖；7)繪制三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線：將多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品的電泳圖導(dǎo)入quantityone軟件，經(jīng)過(guò)處理后，得到多糖酸水解產(chǎn)物及三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值，以三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；8)移栽黃芪和野生黃芪的鑒別：將多糖酸水解產(chǎn)物的光密度值帶入步驟7)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黃芪多糖中三糖和四糖的含量，并根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)鑒別移栽黃芪和野生黃芪：當(dāng)三糖含量＜3.0mg/ml，且四糖含量＜3.2mg/ml時(shí)，為移栽黃芪；當(dāng)三糖含量＞3.0mg/ml，且四糖含量＞3.2mg/ml時(shí)，為野生黃芪。本實(shí)施例中計(jì)算所的三糖含量＝3.310mg/ml，四糖含量＝3.242mg/ml，鑒別結(jié)果為野生黃芪。實(shí)施例2本實(shí)施例中的一種鑒別移栽黃芪和野生黃芪的方法，包括如下步驟：1)原料預(yù)處理：將干燥的黃芪粉碎成粉末后過(guò)100目篩得到黃芪細(xì)粉，備用；2)提取粗多糖：取上述黃芪細(xì)粉約5g，精密稱定后置于1000ml圓底燒瓶中，加水500ml，在100℃的溫度下回流提取1h，降至室溫后離心取上清液；殘?jiān)偌铀?00ml，重復(fù)提取1次，取上清，合并上清；濃縮，將合并的上清液用95％的乙醇調(diào)節(jié)至含醇量為80％，3000r/min離心10min，合并沉淀，冷凍干燥得多糖粗粉；3)純化多糖：將步驟2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉與水的質(zhì)量比為1:200，向多糖粗粉溶液加入濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液，所述濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液的加入量均為多糖粗粉溶液體積的10％，振搖后靜置30min，離心得到純化多糖，凍干，備用；4)多糖酸水解：取步驟3)得到的純化多糖10mg，加入0.5mol/l三氟乙酸500μl，混勻，隨后將混合液置于90℃保溫1h，反應(yīng)結(jié)束后，用氮吹干燥儀干燥多糖酸水解產(chǎn)物，然后加入適量甲醇清洗水解產(chǎn)物，繼續(xù)氮?dú)獯蹈桑?)多糖酸水解產(chǎn)物、三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化：取三糖標(biāo)準(zhǔn)品6mg、四糖標(biāo)準(zhǔn)品8mg以及步驟4)中的多糖酸水解產(chǎn)物，分別加入200μl的nacnbh3溶液，再分別加入200μl的ants衍生化試劑，渦旋，混勻；37℃恒溫反應(yīng)15h后，將三種產(chǎn)物用氮?dú)獯蹈?，溶?ml6mol/l的尿素溶液，制成三糖標(biāo)準(zhǔn)品、四糖標(biāo)準(zhǔn)品及多糖酸水解產(chǎn)物的衍生化樣品，其中三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化樣品用6mol/l的尿素溶液分別稀釋成不少于6個(gè)濃度梯度的衍生化樣品；6)衍生化樣品電泳分析：取步驟5)中多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化樣品，采用垂直板凝膠電泳分離每個(gè)衍生化樣品；分離膠為濃度為30％的聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠為濃度為8％的聚丙烯酰胺凝膠，所述分離膠和濃縮膠的配制溶劑均為ph8.5、濃度0.2mol/l的tris-boric緩沖液；電泳緩沖液為ph8.5、濃度0.2mol/l的tris-boric，上樣量為1μl；首先采用70v的分離電壓電泳分離50min，隨后采用150v的分離電壓電泳分離110min；凝膠在uv300nm條件下成像，獲得多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品的電泳圖；7)繪制三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線：將多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品的電泳圖導(dǎo)入quantityone軟件，經(jīng)過(guò)處理后，得到多糖酸水解產(chǎn)物及三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值，以三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；8)移栽黃芪和野生黃芪的鑒別：將多糖酸水解產(chǎn)物的光密度值帶入步驟7)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黃芪多糖中三糖和四糖的含量，并根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)鑒別移栽黃芪和野生黃芪：當(dāng)三糖含量＜3.0mg/ml，且四糖含量＜3.2mg/ml時(shí)，為移栽黃芪；當(dāng)三糖含量＞3.0mg/ml，且四糖含量＞3.2mg/ml時(shí)，為野生黃芪。本實(shí)施例中計(jì)算所得三糖含量＝2.662mg/ml，四糖含量＝3.122mg/ml，鑒別結(jié)果為移栽黃芪。實(shí)施例3本實(shí)施例中的一種鑒別移栽黃芪和野生黃芪的方法，包括如下步驟：1)原料預(yù)處理：將干燥的黃芪粉碎成粉末后過(guò)100目篩得到黃芪細(xì)粉，備用；2)提取粗多糖：取上述黃芪細(xì)粉約5g，精密稱定后置于1000ml圓底燒瓶中，加水500ml，在100℃的溫度下回流提取1h，降至室溫后離心取上清液；殘?jiān)偌铀?00ml，重復(fù)提取1次，取上清，合并上清；濃縮，將合并的上清液用95％的乙醇調(diào)節(jié)至含醇量為80％，3000r/min離心10min，合并沉淀，冷凍干燥得多糖粗粉；3)純化多糖：將步驟2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉與水的質(zhì)量比為1:200，向多糖粗粉溶液加入濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液，所述濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液的加入量均為多糖粗粉溶液體積的10％，振搖后靜置30min，離心得到純化多糖，凍干，備用；4)多糖酸水解：取步驟3)得到的純化多糖10mg，加入0.5mol/l三氟乙酸500μl，混勻，隨后將混合液置于90℃保溫1h，反應(yīng)結(jié)束后，用氮吹干燥儀干燥多糖酸水解產(chǎn)物，然后加入適量甲醇清洗水解產(chǎn)物，繼續(xù)氮?dú)獯蹈桑?)多糖酸水解產(chǎn)物、三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化：取三糖標(biāo)準(zhǔn)品6mg、四糖標(biāo)準(zhǔn)品8mg以及步驟4)中的多糖酸水解產(chǎn)物，分別加入200μl的nacnbh3溶液，再分別加入200μl的ants衍生化試劑，渦旋，混勻；37℃恒溫反應(yīng)15h后，將三種產(chǎn)物用氮?dú)獯蹈?，溶?ml6mol/l的尿素溶液，制成三糖標(biāo)準(zhǔn)品、四糖標(biāo)準(zhǔn)品及多糖酸水解產(chǎn)物的衍生化樣品，其中三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化樣品用6mol/l的尿素溶液分別稀釋成不少于6個(gè)濃度梯度的衍生化樣品；6)衍生化樣品電泳分析：取步驟5)中多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化樣品，采用垂直板凝膠電泳分離每個(gè)樣品；分離膠為濃度為30％的聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠為濃度為8％的聚丙烯酰胺凝膠，所述分離膠和濃縮膠的配制溶劑均為ph9.0、濃度0.15mol/l的tris-boric緩沖液；電泳緩沖液為ph9.0、濃度0.15mol/l的tris-boric，上樣量為1μl；首先采用80v的分離電壓電泳分離40min，隨后采用100v的分離電壓電泳分離100min；凝膠在uv300nm條件下成像，獲得多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品的電泳圖；7)繪制三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線：將多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品的電泳圖導(dǎo)入quantityone軟件，經(jīng)過(guò)處理后，得到多糖酸水解產(chǎn)物及三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值，以三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；8)移栽黃芪和野生黃芪的鑒別：將多糖酸水解產(chǎn)物的光密度值帶入步驟7)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黃芪多糖中三糖和四糖的含量，并根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)鑒別移栽黃芪和野生黃芪：當(dāng)三糖含量＜3.0mg/ml，且四糖含量＜3.2mg/ml時(shí)，為移栽黃芪；當(dāng)三糖含量＞3.0mg/ml，且四糖含量＞3.2mg/ml時(shí)，為野生黃芪。本實(shí)施例中計(jì)算所得三糖含量＝3.010mg/ml，四糖含量＝3.212mg/ml，鑒別結(jié)果為野生黃芪。上述實(shí)施例中的三糖標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)是100274，四糖標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)自天津士蘭科技有限公司，批號(hào)是catno：pcm-my-001、20150401。本發(fā)明鑒別黃芪栽培方式的標(biāo)準(zhǔn)是通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)獲得的。以下實(shí)驗(yàn)中采用的移栽黃芪取自甘肅隴西及山東文登等地，野生黃芪取自山西渾源及黑龍江等地，2類黃芪各取12個(gè)樣本。按照本發(fā)明的方法對(duì)選取的黃芪樣本進(jìn)行處理，制成衍生化產(chǎn)物樣品，然后采用凝膠電泳法進(jìn)行分離，得到每個(gè)黃芪樣品的電泳圖，如圖1所示，圖中，s為含有6個(gè)聚合度糖的糖標(biāo)準(zhǔn)品，1-6及13-18號(hào)為野生黃芪樣品，7-12及19-24號(hào)為移栽黃芪樣品，dp表示單糖聚合度，dp1-dp6分別為一糖、二糖、三糖、四糖、五糖和六糖。將圖1中的電泳圖導(dǎo)入quantityone軟件，經(jīng)過(guò)處理后，得到與電泳圖相對(duì)應(yīng)的指紋圖譜，如圖2所示，圖中，1-6及13-18號(hào)為野生黃芪樣品，7-12及19-24號(hào)為移栽黃芪樣品。將圖2中的指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入spss16.0進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，得到圖3，由圖3可知，三糖和四糖具有顯著性差異，即三糖和四糖是區(qū)分黃芪栽培方式的主要差異性片段，圖中*代表顯著性差異的多糖片段。將圖2中的指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入smica-p13.0進(jìn)行分析，分析結(jié)果如圖4、圖5和圖6，圖4為不同栽培方式的黃芪多糖部分酸水解產(chǎn)物的pls-da圖，由圖4可知，移栽黃芪和野生黃芪可以得到很明顯的分離；圖5為pls-da分析模型的驗(yàn)證圖，圖中r2為解釋模型值，q2為預(yù)測(cè)模型值，由圖5可知pls-da模型驗(yàn)證成立，該模型可用于黃芪栽培方法鑒別中差異性糖片段的尋找；圖6為差異性糖片段的載荷圖，由圖6可知散點(diǎn)離中心較遠(yuǎn)，不同栽培方式的黃芪間差異較大。對(duì)差異性糖片段數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到圖7，由圖7可知，三糖和四糖是區(qū)分黃芪栽培方式的主要差異性片段。將圖2指紋圖譜中的光密度值分別帶入三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算黃芪樣品中的三糖及四糖含量，圖8和圖9分別為三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖中，y為光密度值，x為濃度值，r2為相關(guān)系數(shù)，計(jì)算結(jié)果如表1所示；黃芪樣品編號(hào)三糖含量(mg/ml)四糖含量(mg/ml)13.3103.24223.0883.33433.3843.46143.2703.21053.0133.29163.0583.20872.9583.03482.6623.12292.8663.131102.9912.973112.9782.963122.6603.045133.1673.274143.1583.244153.1973.252163.0363.432173.0383.245183.3303.232192.5093.121202.9613.122212.7633.034222.8943.131232.9593.032242.9743.142表1表1為24個(gè)黃芪樣品中的三糖及四糖的含量；由表1可知，1-6及13-18號(hào)野生黃芪樣品中的三糖含量均大于3.0mg/ml，四糖含量均大于3.2mg/ml；7-12及19-24號(hào)移栽黃芪樣品中的三糖含量均小于3.0mg/ml，四糖含量均小于3.2mg/ml。因此，本發(fā)明可以將三糖、四糖的含量作為鑒別黃芪栽培方式的標(biāo)準(zhǔn)，即當(dāng)三糖含量＜3.0mg/ml，且四糖含量＜3.2mg/ml時(shí)，為移栽黃芪；當(dāng)三糖含量＞3.0mg/ml，且四糖含量＞3.2mg/ml時(shí)，為野生黃芪。當(dāng)前第1頁(yè)12