本發(fā)明涉及新型具有抗癌活性化合物含量檢測方法，具體涉及樺木酮酸-氨基酸衍生物的反相高效液相色譜法(rp-hplc)含量測定，屬分析化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：樺木酮酸，又名路路通酸，是有c-30骨架的五環(huán)三萜烯類化合物，整體保持了羽扇烷的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)式如下所示。樺木酮酸分子式為c30h46o3，樺木酮酸是一種天然生物活性物質(zhì)，其在自然界如樺樹皮、楓香樹果序等的含量很少。樺木酮酸結(jié)構(gòu)式i據(jù)研究表明：樺木酮酸具有清熱解毒、調(diào)血脂、提高免疫力、消炎、改善頭發(fā)光澤、促使頭發(fā)生長、抗炎、抗痢疾、抗病原體等作用，還可以作為前列腺素e-2和一氧化氮的抑制體。更重要的是，樺木酮酸在抗hiv和抗腫瘤等活性方面表現(xiàn)出了比以往的藥物靶向性更強、作用機制不同、免疫抑制作用更低、毒副作用更小的特性。因此，對于樺木酮酸及其衍生物這類新型藥物的研究已經(jīng)逐步受到了藥物研究者的密切關(guān)注。但是樺木酮酸的開發(fā)應(yīng)用和臨床研究受到了很大程度的限制，原因是其水溶性很差，極難溶于水中，以致其在有機體內(nèi)細胞中的抗癌活性只能得到有限的很少部分的發(fā)揮。為此，需要高水溶性的賴氨酸對樺木酮酸進行系列化學(xué)改性，使其具有良好的生物利用度、高生物活性，尤其是抗腫瘤活性和良好的水溶性，造福人類。目前，樺木酮酸-氨基酸衍生物已有相關(guān)報道，結(jié)構(gòu)如下式所示。樺木酮酸-氨基酸衍生物的純度直接關(guān)系到藥物的應(yīng)用，為此，對其純度進行檢測，具有重要價值但樺木酮酸-氨基酸衍生物的含量測試方法還沒見相關(guān)報道。樺木酮酸-氨基酸衍生物結(jié)構(gòu)式ii。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種線性關(guān)系好，測定準確性高、具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性的樺木酮酸-氨基酸衍生物含量測試方法。為達上述目的，本發(fā)明采用反相高效液相色譜法測定樺木酮酸-氨基酸衍生物的含量。具體技術(shù)方案如下：（1）樺木酮酸-氨基酸衍生物溶液配制：稱取樺木酮酸-氨基酸衍生物，置于容量瓶中，加甲醇或乙腈超聲溶解并定容至刻度線，配置成500μg/ml，用有機濾膜過濾以備分析測試用。(2)取配制的樺木酮酸-氨基酸衍生物溶液再經(jīng)有機系枕頭濾器過濾后注入樣品瓶中，放入液相色譜儀中，采用反相高效液相色譜法(rp-hplc)測定樺木酮酸-氨基酸衍生物的含量，所用的液相色譜柱為c18，以甲醇和質(zhì)量百分含量0.5%甲酸水溶液為流動相，流動相流速為0.8-1.2ml/min，優(yōu)選1.0ml/min。進樣量為1-20μl。測定樺木酮酸-氨基酸衍生物的含量范圍為0.10μg/ml～100μg/ml。優(yōu)選：所述色譜柱為c18(4.6×250mm，5μm)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。優(yōu)選：所述流動相中甲醇與質(zhì)量百分含量0.5%甲酸水溶液體積比為（85-70）：（15-30），進一步優(yōu)選78：22。反相高效液相色譜法(rp-hplc)測定條件優(yōu)選：柱溫為35℃，流速為1.0ml/min，進樣體積為5μl，樣品濃度為500μg/ml。dad檢測器，最佳檢測波長為205nm。優(yōu)選如上樺木酮酸-氨基酸衍生物結(jié)構(gòu)式ii化合物。本發(fā)明優(yōu)點：本發(fā)明確定了采用反相高效液相色譜法(rp-hplc)測定樺木酮酸-氨基酸衍生物含量的最佳條件，經(jīng)實驗驗證，樺木酮酸-氨基酸衍生物含量測試方法線性關(guān)系好（r=1），測定準確性高，相對標(biāo)準偏差小，僅為0.15%，具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，穩(wěn)定性相對標(biāo)準偏差為0.24%。附圖說明圖1為樺木酮酸-氨基酸衍生物液相色譜圖；圖2為樺木酮酸-氨基酸衍生物線性關(guān)系；圖3為樺木酮酸-氨基酸衍生物工作曲線。具體實施方式為對本發(fā)明進行更好地說明，舉實施例如下:實施例1色譜條件：用agilent1290高效液相色譜儀，用c18色譜柱c18(4.6×250mm，5μm)；柱溫：35℃；檢測器：dad檢測器，檢測波長205nm；流動相溶液：甲醇：質(zhì)量百分含量0.5%甲酸水溶液=78：22；（1）樺木酮酸-氨基酸衍生物溶液配制：精密稱取5.0mg樺木酮酸-氨基酸衍生物結(jié)構(gòu)式ii化合物，置于10ml容量瓶中，加甲醇或乙腈超聲使樣品溶解并定容至刻度線，最后用0.45μm有機濾膜過濾以備分析測試用。（2）取出0.5ml按上述方法配制的樺木酮酸-氨基酸衍生物溶液，再經(jīng)0.2μm有機系枕頭濾器過濾后注入2.0ml的樣品瓶中，貼上標(biāo)簽，放入液相色譜儀中，進樣量：5μl；流速：1.0ml/min，采用反相高效液相色譜法(rp-hplc)測定樺木酮酸-氨基酸衍生物含量。結(jié)果顯示樺木酮酸-氨基酸衍生物的保留時間t=19.925min，峰形良好，對稱因子為1.02，其含量為99.7%（hplc），見圖1所示。本發(fā)明的方法學(xué)考察(1)線性關(guān)系考察按上述方法配制的500μg/ml樺木酮酸-氨基酸衍生物（式ii化合物）溶液，用甲醇稀釋成100μg/ml，再經(jīng)0.2μm有機系枕頭濾器過濾后注入2.0ml的樣品瓶中，貼上標(biāo)簽，放入液相色譜儀中，采用反相高效液相色譜法(rp-hplc)，如下所述的條件下依次進樣1μl、2μl、3μl、4μl、5μl，對進樣量和峰面積進行數(shù)據(jù)回歸，得線性方程為y=982x-0.96（r2=1），分析得r=1，可見本方法的線性關(guān)系很好，見圖2。其中，色譜柱：c18(4.6×250mm，5μm)；dad檢測器，檢測波長為205nm；流動相溶液：甲醇：質(zhì)量百分含量0.5%甲酸水溶液=78：22；色譜柱溫度：35℃；進樣量：5μl；流速：1.0ml/min。(2)線性范圍考察上述配制500μg/ml的樺木酮酸-氨基酸衍生物溶液用甲醇分別稀釋成0.1μg/ml，1.0μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，再經(jīng)0.2μm有機系枕頭濾器過濾后注入2.0ml的樣品瓶中，貼上標(biāo)簽，放入液相色譜儀中。采用反相高效液相色譜法(rp-hplc)，如下所述的色譜條件下進行檢測，并依次記錄相應(yīng)的峰面積，以樺木酮酸-氨基酸衍生物的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，其濃度(x)為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得線性方程為y=49.07x-2.49（r2=1），即濃度在0.10μg/ml-100μg/ml范圍內(nèi)，樺木酮酸-氨基酸衍生物的含量和峰面積呈良好的線性關(guān)系，見圖3所示。其中，色譜柱：c18(4.6×250mm，5μm)；dad檢測器，檢測波長為205nm；流動相溶液：甲醇-質(zhì)量百分含量0.5%甲酸水溶液=78：22；色譜柱溫度：35℃；進樣量：5μl；流速：1.0ml/min。(3)精密度考察上述配制500μg/ml的樺木酮酸-氨基酸衍生物溶液用甲醇稀釋成100μg/ml，再經(jīng)0.2μm有機系枕頭濾器過濾后注入2.0ml的樣品瓶中，貼上標(biāo)簽，放入液相色譜儀中。采用反相高效液相色譜法(rp-hplc)，如下所述的色譜條件下進行檢測，重復(fù)進樣6次，計算相對標(biāo)準偏差rsd。表1測試100μg/ml樺木酮酸-氨基酸衍生物溶液6次結(jié)果次數(shù)123456rsd/%峰面積/mau*s4909.14921.34915.14914.64918.74900.60.15結(jié)果表明：本發(fā)明測定樺木酮酸-氨基酸衍生物含量的方法精密度高，重現(xiàn)性好，相對標(biāo)準偏差小，rsd=0.15%，見上表1所示。其中，色譜柱：c18(4.6×250mm，5μm)；dad檢測器，檢測波長為205nm；流動相溶液：甲醇：質(zhì)量百分含量0.5%甲酸水溶液=78：22；色譜柱溫度：35℃；進樣量：5μl；流速：1.0ml/min。(4)溶液的穩(wěn)定性考察上述制備的500μg/ml樺木酮酸-氨基酸衍生物溶液用甲醇稀釋成100μg/ml，再經(jīng)0.2μm有機系枕頭濾器過濾后注入2.0ml的樣品瓶中，貼上標(biāo)簽，放入液相色譜儀中，分別于不同時間進樣。采用反相高效液相色譜法(rp-hplc)，如下所述色譜條件進樣，并記錄24h內(nèi)不同時間的峰面積，計算相對標(biāo)準偏差rsd。表2樺木酮酸-氨基酸衍生物穩(wěn)定性結(jié)果時間/h06121824rsd/%峰面積/mau*s4909.14915.64922.44931.74938.60.24結(jié)果表明：本發(fā)明測定樺木酮酸-氨基酸衍生物溶液在24小時內(nèi)的峰面積未見明顯變化，穩(wěn)定性良好，相對標(biāo)準偏差小，rsd=0.24%，見上表2所示。其中，色譜柱：c18(4.6×250mm，5μm)；dad檢測器，檢測波長為205nm；流動相溶液：甲醇：質(zhì)量百分含量0.5%甲酸水溶液=78：22；色譜柱溫度：35℃；進樣量：5μl；流速：1.0ml/min。當(dāng)前第1頁12