本發(fā)明屬于植物細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及一種小麥根尖染色體制片的方法。

背景技術(shù)：

國內(nèi)外育種實(shí)踐證明，遺傳基礎(chǔ)狹窄已成為小麥育種難以取得突破的“瓶頸”。為保障小麥安全生產(chǎn)，保障農(nóng)業(yè)生態(tài)和環(huán)境安全，迫切需要開發(fā)和利用新的基因資源、培育綜合抗性好、適應(yīng)性強(qiáng)的小麥新品種。小麥野生近緣植物長期生活在自然環(huán)境中，經(jīng)受了各種惡劣環(huán)境的考驗(yàn)，具有大量普通小麥不具備或在人工選擇條件下已經(jīng)喪失的優(yōu)異基因，如抗病、抗逆、抗蟲、大穗多粒、優(yōu)質(zhì)等。通過遠(yuǎn)緣雜交方式將小麥近緣物種中的優(yōu)良基因?qū)肫胀ㄐ←渼?chuàng)制的新種質(zhì)，既可以豐富小麥遺傳變異，拓寬小麥的種質(zhì)資源，而且不涉及轉(zhuǎn)基因安全性問題，是推進(jìn)小麥育種取得突破性進(jìn)展的有效途徑(friebe等，1996)。在小麥的起源進(jìn)化研究、外源染色質(zhì)的鑒定、基因的染色體定位、物理圖譜構(gòu)建、減數(shù)分裂機(jī)理等研究中，都涉及到染色體的相關(guān)研究。

小麥染色體制片的準(zhǔn)備，是開展小麥細(xì)胞遺傳學(xué)、小麥分子細(xì)胞遺傳學(xué)以及基于染色體等相關(guān)研究的基礎(chǔ)。在小麥染色體制片的準(zhǔn)備過程中，預(yù)處理是一個非常重要的環(huán)節(jié)，合理的預(yù)處理能得到大量的分裂相和形態(tài)好的中期染色體。預(yù)處理的機(jī)理是抑制微管蛋白組裝成紡錘絲，但并不抑制前期的細(xì)胞分裂，因此，凡進(jìn)入中期的細(xì)胞均被阻斷而不能進(jìn)入后期，積累大量中期分裂相；可誘導(dǎo)染色體進(jìn)一步縮短變直，便于染色體分散和使染色體形態(tài)更清晰。實(shí)際操作中常用的方法有物理方法和化學(xué)方法。物理方法是用低溫對植物材料進(jìn)行預(yù)處理，處理溫度一般在0～8℃，或用冰水混合物直接對材料進(jìn)行預(yù)處理。此法對染色體無破壞作用，染色體縮短均勻.簡便易行，各種作物都適用，但是并不是任何時候都能獲得較多的中期相。化學(xué)方法預(yù)處理常用的試劑有：秋水仙素、對二氯苯和8-羥基喹啉。秋水仙素常用濃度0.05-0.2％的水溶液，適用于大、中、小染色體，尤其是適合染色體計數(shù)，使染色體易于分散較好，但顯示縊痕較差，而且秋水仙素毒性較強(qiáng)。對二氯苯預(yù)處理的效果與秋水仙素相當(dāng)，也具有較強(qiáng)的毒性；8-羥基喹啉，適宜中、小染色體，離體處理好。優(yōu)點(diǎn)在于顯示縊痕清晰，缺點(diǎn)在于中期相不如其它多。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種小麥根尖染色體制片的方法。

本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種小麥根尖染色體制片的方法，包含以下步驟：

1)種子發(fā)根；

2)預(yù)處理：待根長為1.8-3cm時，向培養(yǎng)皿中加入20μmol/lapm溶液至浸沒根，置于25℃培養(yǎng)箱生長預(yù)處理2小時；

3)笑氣處理：將預(yù)處理的根尖,在裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中清洗，用剪刀剪根，在室溫條件下，用壓強(qiáng)為1mpa的笑氣處理1-2小時；

4)固定：向用笑氣處理完之后的根加入4℃預(yù)冷的90％的冰醋酸，固定5-10min；

5)制片：先取出根尖，在45％醋酸中解離片刻，先切掉根冠，然后切取根尖生長點(diǎn)置于載玻片上，滴一滴45％醋酸解離細(xì)胞，蓋上蓋玻片后輕輕敲擊使細(xì)胞分散，在酒精燈外焰輕微烘一下后直接壓片。

作為本發(fā)明小麥根尖染色體制片方法的優(yōu)選，步驟1)種子發(fā)根的方法為：將種子放置于墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中于25℃恒溫箱中發(fā)芽，種子露白后，將培養(yǎng)皿中多余的水分倒掉，僅保持濾紙濕潤，移至4℃冰箱中處理20-24h，然后再將培養(yǎng)皿移至25℃培養(yǎng)箱中避光生長至1.8-3.0cm。

作為本發(fā)明小麥根尖染色體制片方法的優(yōu)選，步驟2)中20μmol/lapm溶液的配制方法為：向1000ml蒸餾水中加入100μl的0.2mol/lapm母液，配成20μmol/l的工作液；所述的0.2mol/lapm母液的配制方法為：60.86mgapm溶于10ml預(yù)冷的丙酮中,放入-20℃保存。

作為本發(fā)明小麥根尖染色體制片方法的優(yōu)選，步驟3)所述的笑氣處理的方法為：將預(yù)處理的根尖,在裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中清洗2次，每次4-5分鐘，用剪刀剪根，將根放入帶孔的eppendorf離心管中，離心管中預(yù)先加入適量的去離子水以保持濕潤，在室溫條件下，用壓強(qiáng)為1mpa的笑氣處理1-2小時。

作為本發(fā)明小麥根尖染色體制片方法的優(yōu)選，步驟4)所述的固定的方法為：把用笑氣處理完之后的盛有根的eppendorf離心管置于碎冰上，向離心管中加入4℃預(yù)冷的90％的冰醋酸，固定5-10min。

本發(fā)明小麥根尖染色體制片的方法進(jìn)一步優(yōu)選包含如下步驟：

1)種子發(fā)根：將種子放置于墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中于25℃恒溫箱中發(fā)芽，種子露白后，將培養(yǎng)皿中多余的水分倒掉，僅保持濾紙濕潤，移至4℃冰箱中處理24h，然后再將培養(yǎng)皿移至25℃培養(yǎng)箱中避光生長；

2)預(yù)處理：待根長1.8-3cm時，向培養(yǎng)皿中加入20μmol/lapm溶液至浸沒根，置于25℃培養(yǎng)箱生長預(yù)處理2小時；

3)笑氣處理：將預(yù)處理的根尖,在裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中清洗2次，每次5分鐘，用剪刀剪根，將根放入帶孔的eppendorf離心管中，離心管中預(yù)先加入適量的去離子水以保持濕潤，在室溫條件下，用壓強(qiáng)為1mpa的笑氣處理1-2小時；

4)固定：把用笑氣處理完之后的盛有根的eppendorf離心管置于碎冰上，向離心管中加入4℃預(yù)冷的90％的冰醋酸，固定5-10min；

5)制片：先取出根尖，在45％醋酸中解離片刻，用刀片先切掉根冠，然后切取根尖生長點(diǎn)置于載玻片上，滴一滴45％醋酸解離細(xì)胞，蓋上蓋玻片后輕輕敲擊使細(xì)胞分散，在酒精燈外焰輕微烘一下后直接壓片。

將按照上述方法制得的載玻片置于相差顯微鏡下觀察，選擇染色體形態(tài)良好、不重疊或重疊少、清晰的細(xì)胞，可以直接照相進(jìn)行核型分析，也可以用于染色體分帶或熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)。

本發(fā)明在預(yù)處理階段使用甲基胺草膦(amiprophos-methyl,apm)apm代替秋水仙素、對二氯苯和8-羥基喹啉，apm是一種直接干擾植物微管合成的特異性藥物，其作用類似于秋水仙素，起到收集中期染色體的作用，不同apm處理時間對有絲分裂中期指數(shù)有一定的影響。apm對微管蛋白有很高的親和力，在較低濃度時，對微管蛋白的解聚能力更強(qiáng)，對植物的毒害作用也小。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在操作簡單，不需要特殊設(shè)備；方便易學(xué)，沒有經(jīng)過細(xì)胞學(xué)訓(xùn)練的人員，根據(jù)本發(fā)明方法，都可以獲得大量的有絲分裂中期相，也可以制備出良好的小麥染色體制片。

附圖說明

圖1：六倍體普通小麥中國春染色體制片dapi染色后放大100倍(顯微鏡：目鏡10倍×物鏡10倍),a、b為不同視野下看到的中期相的分布情況；

圖2：六倍體普通小麥中國春染色體制片dapi染色后放大1000倍(顯微鏡：目鏡10倍×物鏡100倍)，為一個細(xì)胞在熒光顯微鏡下的鏡檢圖片(2n＝42)

圖3：四倍體硬粒小麥染色體制片dapi染色后放大100倍(顯微鏡：目鏡10倍×物鏡10倍),a、b為不同視野下看到的中期相的分布情況；

圖4：四倍體硬粒小麥染色體制片dapi染色后放大1000倍(顯微鏡：目鏡10倍×物鏡100倍)，為一個細(xì)胞在熒光顯微鏡下的鏡檢圖片(2n＝28)；

圖5：二倍體簇毛麥染色體制片dapi染色后放大100倍(顯微鏡：目鏡10倍×物鏡10倍),a、b為不同視野下看到的中期相的分布情況；

圖6：二倍體簇毛麥染色體制片dapi染色后放大1000倍(顯微鏡：目鏡10倍×物鏡100倍)，為一個細(xì)胞在熒光顯微鏡下的鏡檢圖片(2n＝14)

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：普通小麥中國春(2n＝42，aabbdd)的染色體制片舉例：

種子發(fā)根:將15粒普通小麥中國春種子放在墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中,加入足量的蒸餾水，使種子充分浸泡于蒸餾水中，放入25℃恒溫箱中發(fā)芽。放置24小時種子露白后，將培養(yǎng)皿中多余的水分倒掉，僅保持濾紙濕潤，移至4℃冰箱中處理24h，然后再將培養(yǎng)皿移至25℃培養(yǎng)箱中避光生長。

預(yù)處理:待小麥種子的根長約2cm時，向培養(yǎng)皿中加入20μmol/lapm溶液至浸沒根，置于25℃培養(yǎng)箱生長預(yù)處理2小時。

笑氣處理：將預(yù)處理的根尖，在裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中清洗2次，每次5分鐘，用剪刀剪取幼根(如果實(shí)驗(yàn)過程中需要獲得正常的植株，需要保留一條完整的根)。將根放入帶孔的eppendorf2.0ml離心管中，離心管中預(yù)先加入適量的去離子水以保持濕潤。在室溫條件下，用壓強(qiáng)為1mpa的笑氣處理1.5小時。

固定：把用笑氣處理完之后的盛有根的eppendorf離心管置于碎冰上，向離心管中加入預(yù)冷的90％的冰醋酸(4℃)，固定5-10min。

制片：先取出根尖，用刀片切取根尖部分，在45％醋酸中解離片刻，用刀片先切掉根冠，然后切取根尖生長點(diǎn)2mm(實(shí)際操作中，可根據(jù)需要切取1.5-2.5mm根尖部分)置于載玻片上，滴一滴45％醋酸解離細(xì)胞，蓋上蓋玻片，蓋玻片的一側(cè)墊在刀片的邊緣后，用解剖針輕輕敲擊蓋玻片使根尖細(xì)胞分散，使細(xì)胞分散，在酒精燈外焰輕微烘一下，將載玻片放在兩層濾紙之間，用大拇指按在蓋玻片的位置用力壓片后直接壓片。

鏡檢：將載玻片置于熒光顯微鏡20倍物鏡下觀察，從圖1中可以看出通過apm預(yù)處理后的材料，有絲分裂中期相的數(shù)量明顯的提高了。dapi染色后，在熒光顯微鏡100倍油鏡下照相，染色結(jié)果如圖2，圖中比例尺為即所示，由圖可見，該小麥根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為42，中期分裂相多，染色體分散良好、重疊少。

實(shí)施例2：四倍體硬粒小麥(2n＝28，aabb)的染色體制片舉例：

四倍體硬粒小麥在種子發(fā)根，預(yù)處理，笑氣處理，制片方面同六倍體普通小麥，詳見實(shí)施見例1。

鏡檢：將載玻片置于熒光顯微鏡20倍物鏡下觀察，從圖3中可以看出通過apm預(yù)處理后的材料，有絲分裂中期相的數(shù)量明顯的提高了。dapi染色后，在熒光顯微鏡100倍油鏡下照相，染色結(jié)果如圖4，圖中比例尺為即所示，由圖可見，該硬粒小麥根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為28，中期分裂相多，染色體分散良好、重疊少。

實(shí)施例3：二倍體簇毛麥(2n＝14，vv)的染色體制片舉例：

種子發(fā)根:將20粒簇毛麥種子放在墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中,加入足量的蒸餾水，使種子充分浸泡于蒸餾水中，放入25℃恒溫箱中發(fā)芽。放置24小時種子露白后，將培養(yǎng)皿中多余的水分倒掉，僅保持濾紙濕潤，移至4℃冰箱中處理24h，然后再將培養(yǎng)皿移至25℃培養(yǎng)箱中避光生長。

預(yù)處理:待簇毛麥種子的根長約2cm-3cm時，向培養(yǎng)皿中加入20μmol/lapm溶液至浸沒根，置于25℃培養(yǎng)箱生長預(yù)處理2小時。

笑氣處理：將預(yù)處理的根尖，在裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中清洗2次，每次5分鐘，用剪刀剪取幼根(如果實(shí)驗(yàn)過程中需要獲得正常的植株，需要保留一條完整的根)。將根放入帶孔的eppendorf2.0ml離心管中，離心管中預(yù)先加入適量的去離子水以保持濕潤。在室溫條件下，用壓強(qiáng)為1mpa的笑氣處理1小時。

固定：把用笑氣處理完之后的盛有根的eppendorf離心管置于碎冰上，向離心管中加入預(yù)冷的90％的冰醋酸(4℃)，固定5-10min。

制片：同例1。

鏡檢：將載玻片置于熒光顯微鏡20倍物鏡下觀察，從圖5中可以看出通過apm預(yù)處理后的材料，有絲分裂中期相的數(shù)量明顯的提高了。dapi染色后，在熒光顯微鏡100倍油鏡下照相，染色結(jié)果如圖6，圖中比例尺為即所示，由圖可見，該簇毛麥根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為14，中期分裂相多，染色體分散良好、重疊少。