本發(fā)明屬于天然藥物分離領(lǐng)域，具體涉及一種基于靶蛋白親和整體色譜柱的細(xì)菌生物膜抑制成分的分離鑒定方法、以及所述分離鑒定方法中使用的分離裝置。

背景技術(shù)：

近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌附著后分泌粘性胞外基質(zhì)并在其中生長(zhǎng)繁殖而形成的具有高度構(gòu)造性的復(fù)合物，即細(xì)菌生物膜(bacterialbiofilm，bbf)，是導(dǎo)致耐藥行為的重要原因?，F(xiàn)有抗生素應(yīng)用不僅不能有效清除bbf，還會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性，因而引起了廣泛的關(guān)注。

深入研究發(fā)現(xiàn)，bbf的形成等一系列病原菌的生命活動(dòng)均依賴(lài)于群體感應(yīng)(quorumsensing，qs)系統(tǒng)的調(diào)控。群體感應(yīng)抑制劑(qsinhibitor，qsi)有別于傳統(tǒng)抗菌藥的作用機(jī)制，一方面通過(guò)抑制該系統(tǒng)相關(guān)受體蛋白來(lái)調(diào)控其致病行為(包括bbf形成、外毒素和各種侵襲性酶類(lèi)的合成和分泌等)，另一方面并不殺滅細(xì)菌從而避免了選擇性壓力導(dǎo)致的耐藥，這為從根本上解決細(xì)菌的抗藥性問(wèn)題提供了全新的研究思路。

我國(guó)中藥和天然藥物資源極其豐富，藥用植物近萬(wàn)種，為抗菌藥物發(fā)現(xiàn)提供了重要的物質(zhì)來(lái)源基礎(chǔ)。目前已在植物中分離鑒定了一些有效的qsi，例如從傘形科植物中發(fā)現(xiàn)的法卡林二醇，從補(bǔ)骨脂中分離的補(bǔ)骨脂素，從佛手中發(fā)現(xiàn)的佛手苷內(nèi)酯等。藥用植物源的qsi相此于化學(xué)合成抗菌藥物，具有低毒、廉價(jià)、不良反應(yīng)及副作用相對(duì)較小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)。從天然藥物中發(fā)掘靶向群感效應(yīng)的抗菌藥效物質(zhì)，不僅具有切實(shí)的可行性，而且有利于經(jīng)典中藥煥發(fā)出新的生命力。

然而，現(xiàn)有從中藥中獲取qsi的策略和方法都同時(shí)存在著嚴(yán)重的瓶頸。從篩選策略上看，基于中藥成分復(fù)雜多樣的特點(diǎn)，從中獲取qsi一般必需先經(jīng)過(guò)提取分離鑒別得到單體化合物，然后對(duì)每一個(gè)單體進(jìn)行藥效學(xué)篩選驗(yàn)證。顯然，這種“先分離鑒別，后篩選驗(yàn)證”的策略不僅耗時(shí)，效率低，而且費(fèi)用高昂。同時(shí)，由于中藥里qsi含量較少，分離純化困難，導(dǎo)致大部分僅能停留在粗提物上來(lái)考察抑制活性。因此，尋找更多高效的qsi，有效實(shí)現(xiàn)對(duì)bbf的抑制作用，成為了目前亟待解決的重要科學(xué)問(wèn)題。

現(xiàn)有技術(shù)中最新的qsi篩選方法主要集中于以下三類(lèi)：(1)天然的活性指示菌分析篩選法，基于qs系統(tǒng)能夠調(diào)控細(xì)菌某些色素基因的表達(dá)，直觀快速地篩選出qsi，雖然適合大量樣品的粗篩，方法也簡(jiǎn)便易行，但由于樣品有可能對(duì)菌體的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，因而不能排除干擾因素而導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果。(2)qsi選擇器(qsiselector，qsis)篩選法，通過(guò)自殺基因sacb模型進(jìn)行定性初篩，再利用luxcdabe，lacz，gfp等模型進(jìn)一步量化，從而避免了假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，已經(jīng)成功獲得了許多具qsi活性的合成化合物和天然提取物，但操作復(fù)雜，篩選成本高且不適合微量分析，例如cn105504002a。(3)計(jì)算機(jī)虛擬篩選法，篩選速度快、成本較低，有助于提高開(kāi)發(fā)新型藥物的效率；但準(zhǔn)確性需要進(jìn)一步考察，僅適用于初篩階段。

鑒于現(xiàn)有篩選策略和技術(shù)的局限性，嚴(yán)重阻礙了中藥qsi的闡明。因此，尋找其他高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的篩選方法意義重大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種方法簡(jiǎn)單、方向明確、能適應(yīng)高通量篩選的細(xì)菌生物膜抑制成分分離鑒定方法。

具體而言，本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案如下：

一方面，本發(fā)明提供一種細(xì)菌生物膜抑制成分的分離鑒定方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)色譜柱的原位聚合；

(2)受體蛋白的原位固定化；

(3)受體蛋白親和整體色譜柱的性能評(píng)價(jià)；

(4)將含有細(xì)菌生物膜抑制活性的樣品過(guò)親和整體色譜柱；

(5)親和純化洗脫液中細(xì)菌生物膜抑制活性的檢測(cè)。

其中，所述受體蛋白為群感系統(tǒng)中與生物膜形成相關(guān)的受體蛋白。

所述與生物膜形成相關(guān)的受體蛋白包括rhlr、qscr、lasr等，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式方式中所述受體蛋白為lasr。

本發(fā)明所述細(xì)菌生物膜抑制成分的分離鑒定方法，其步驟(1)包括：將hema、交聯(lián)劑、環(huán)己醇、正葵醇和aibn混合溶液裝入1ml玻璃片中，超聲脫氣后注入石英毛細(xì)管內(nèi)，兩端以硅膠塞封口，60℃下反應(yīng)12h；聚合反應(yīng)結(jié)束后，依次用甲醇、水反復(fù)沖洗除去未反應(yīng)物、殘留溶劑、低聚產(chǎn)物，即制備獲得poly(hema-co-edma)整體色譜柱。

本發(fā)明所述細(xì)菌生物膜抑制成分的分離鑒定方法，其步驟(2)包括：將步驟(1)的整體色譜柱活化引入活性伯氨基，將活化的整體色譜柱與受體蛋白衍生物反應(yīng)，所述受體蛋白的衍生物包括受體蛋白c端修飾的衍生物，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中所述受體蛋白衍生物為受體蛋白的n-羥基琥珀酸亞胺酯衍生物。

優(yōu)選的，所述整體色譜柱活化的步驟包括：將整體色譜柱基質(zhì)中的羥基氧化為醛基、然后與二胺進(jìn)行縮合反應(yīng)，引入活性伯氨基。

優(yōu)選的，所述群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白的n-羥基琥珀酸亞胺酯衍生物是通過(guò)以下方法制備獲得：將群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白與碳二亞胺(edc)、n-羥基硫代琥珀酰亞胺反應(yīng)生成琥珀酰亞胺酯衍生物。

本發(fā)明所述細(xì)菌生物膜抑制成分的分離鑒定方法，其步驟(3)所述性能評(píng)價(jià)包括群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白固定量的檢測(cè)、親和特異性評(píng)價(jià)。

本發(fā)明所述細(xì)菌生物膜抑制成分的分離鑒定方法，其步驟(3)中所述群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白固定量檢測(cè)包括：根據(jù)步驟(2)中蠕動(dòng)泵的流速和群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白溶液的濃度計(jì)算輸入至色譜柱的群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白總量；收集合并流出的洗脫液，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)g250在595nm處的吸光值，計(jì)算流出色譜柱的群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白總量。

本發(fā)明所述細(xì)菌生物膜抑制成分的分離鑒定方法，其步驟(3)中優(yōu)選使用(z)-4-溴-5-(溴亞甲基)-2(5h)-呋喃酮為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，驗(yàn)證親和整體色譜柱的親和特異性。

本發(fā)明所述細(xì)菌生物膜抑制成分的分離鑒定方法，其步驟(4)包括：以植物提取物為樣品鑒定對(duì)細(xì)菌生物膜形成的抑制作用，所述植物提取物為廣金錢(qián)草的醇提取物。

本發(fā)明所述細(xì)菌生物膜抑制成分的分離鑒定方法，其步驟(5)包括：用制備型hplc對(duì)親和純化洗脫液中的細(xì)菌生物膜抑制組分進(jìn)行檢測(cè)和分離，收集化合物峰驗(yàn)證其對(duì)細(xì)菌生物膜形成的抑制率。

本發(fā)明所述細(xì)菌生物膜抑制成分的分離鑒定方法，其hplc的條件為：使用c18色譜柱，以1％甲酸溶液和甲醇溶液為流動(dòng)相滴度洗脫，dad檢測(cè)器274nm處檢測(cè)。

第二方面，本發(fā)明提供一種用于分離鑒定細(xì)菌生物膜抑制成分的裝置，其包括串聯(lián)的群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白親和整體色譜柱、c18分離柱、二極管陣列檢測(cè)器、以及可選的esi-ms/ms。

本發(fā)明所述群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白親和整體色譜柱通過(guò)以下方法制備，(1)將hema、交聯(lián)劑、環(huán)己醇、正葵醇和aibn混合溶液裝入1ml玻璃片中，超聲脫氣后注入石英毛細(xì)管內(nèi)，兩端以硅膠塞封口，60℃下反應(yīng)12h；聚合反應(yīng)結(jié)束后，依次用甲醇、水反復(fù)沖洗除去未反應(yīng)物、殘留溶劑、低聚產(chǎn)物，即制備獲得poly(hema-co-edta)整體色譜柱。(2)將步驟(1)的整體色譜柱活化引入活性伯氨基，將活化的整體色譜柱與群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白的n-羥基琥珀酸亞胺酯衍生物4℃反應(yīng)過(guò)夜。

第三方面，本發(fā)明提供用于分離鑒定細(xì)菌生物膜抑制成分的裝置在分離鑒定細(xì)菌生物膜抑制成分中的用途。

本發(fā)明所述裝置在分離鑒定細(xì)菌生物膜抑制成分中的用途包括，將具有抗菌活性和/或qsi活性的植物醇提取物上樣所說(shuō)裝置，依次過(guò)群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白親和整體色譜柱、c18分離柱、二極管陣列檢測(cè)器、以及可選的esi-ms/ms，鑒定分離產(chǎn)物的細(xì)菌生物膜抑制成分。

與現(xiàn)有技術(shù)相此，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)本發(fā)明首次公開(kāi)了一種利用群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白親和整體色譜柱，特別是lasr親和整體色譜柱，分離鑒定qsi的方法及裝置，通過(guò)群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白ai信號(hào)途徑篩選細(xì)菌生物膜抑制劑。其方法相對(duì)于qsi選擇器(qsiselector，qsis)篩選法操作簡(jiǎn)單，技術(shù)要求較低；相對(duì)于天然的活性指示菌分析篩選法和計(jì)算機(jī)虛擬篩選法確定性更好，能有效避免產(chǎn)生大量假陽(yáng)性結(jié)果。

(2)群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白親和整體色譜柱，特別是lasr親和整體色譜柱，制備簡(jiǎn)單、耐受酸堿、性質(zhì)穩(wěn)定、柱效高、滲透性好、生物相容性佳等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)表面易于改性適合目標(biāo)蛋白的固定化；此外，由于整體柱易于實(shí)現(xiàn)毛細(xì)管微型化并聯(lián)用hplc，樣品消耗量較低。

(3)本發(fā)明將群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白親和整體色譜柱，特別是lasr親和整體色譜柱，與hplc-dad-esi-ms/ms串聯(lián)，能夠從粗提樣本中分離出作用于群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白的qsi候選化合物作為細(xì)菌生物膜抑制劑。另外，實(shí)際應(yīng)用中可以根據(jù)需要調(diào)節(jié)親和色譜的條件，如分離到的產(chǎn)物過(guò)多，可設(shè)置更為嚴(yán)格的親和條件，以保留與群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白親和力更高的化合物；如分離到的產(chǎn)物過(guò)少或沒(méi)有得到產(chǎn)物，可設(shè)置更為溫和的親和條件，以避免遺漏與群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白具有親和力的細(xì)菌生物膜抑制劑。

附圖說(shuō)明

圖1整體色譜柱原位聚合的分子反應(yīng)式

圖2poly(hema-co-edma)整體色譜柱的掃描電鏡圖

圖2a此例尺為50μm

圖2b此例尺為10μm

圖3lasr的原位固定化反應(yīng)示意圖

圖4lasr親和整體色譜柱的特異性檢測(cè)

圖5廣金錢(qián)草提取物中hplc-dad分析結(jié)果

圖6掃描電鏡下觀察細(xì)菌生物膜的形成情況，視野比例尺10μm

圖6a廣金錢(qián)草單體化合物實(shí)驗(yàn)組

圖6b陰性對(duì)照組

圖7原子力顯微鏡觀察菌落的堆積和形成情況

圖7a廣金錢(qián)草單體化合物實(shí)驗(yàn)組

圖7b陰性對(duì)照組

圖8廣金錢(qián)草lasr親和整體色譜柱洗脫液中8種單體化合物對(duì)細(xì)菌生物膜形成的抑制作用。

圖8a對(duì)atcc27853的生物膜抑制率；

圖8b對(duì)atcc9027的生物膜抑制率。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。

實(shí)施例1：poly(hema-co-edma)整體色譜柱的制備

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)hema、edma、環(huán)己醇、正葵醇和aibn聚合反應(yīng)(圖1)中各組分相對(duì)含量與聚合產(chǎn)物性狀之間的關(guān)系進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)掃描電鏡對(duì)不同組分含量所產(chǎn)生的毛細(xì)管柱進(jìn)行掃描，優(yōu)選出原位聚合反應(yīng)的最佳原料組成為：甲基丙烯酸羥乙酯(hema)與乙二醇二甲基丙烯酸酯(edma)此例為55∶45(v/v)；生孔劑占反應(yīng)混合物的54.35％(vol％)。

將hema、edma、環(huán)己醇、正葵醇和aibn混合溶液按上述優(yōu)選的此例裝入1ml玻璃瓶中，超聲脫氣后灌入合適長(zhǎng)度的預(yù)處理好的石英毛細(xì)管內(nèi)，然后兩端用硅膠塞封口，60℃下反應(yīng)12h，聚合反應(yīng)完畢后，依次用甲醇、水反復(fù)沖洗未反應(yīng)物、殘留溶劑或其他可能低聚物，即制備得到poly(hema-co-edma)整體柱，掃描電鏡結(jié)果表明所產(chǎn)生的poly(hema-co-edma)整體色譜柱的聚合度適中、孔徑大小合適、分布均勻(圖2)。

實(shí)施例2：lasr原位固定制備lasr親和整體色譜柱

將poly(hema-co-edma)整體色譜柱活化引入活性伯氨基，具體方法包括先用偏高碘酸鈉將poly(hema-co-edma)整體色譜柱基質(zhì)中游離的羥基氧化為醛基，然后再在na(cn)bh3的催化下與丁二胺進(jìn)行醛胺縮合引入游離的活性伯氨基。

取重組表達(dá)純化的lasr蛋白300μg溶解于1ml0.01m的pbs緩沖液中，加入10mg碳化二亞胺(edc)、15mgn-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-nhs)，混勻4℃反應(yīng)2h，生成lasr蛋白的氨基反應(yīng)性nhs酯。

分子篩除去游離的edc、sulfo-nhs，將lasr蛋白的氨基反應(yīng)性nhs酯衍生物加入帶有活性伯氨基的poly(hema-co-edma)整體色譜柱，4℃反應(yīng)過(guò)夜。0.01m的pbs緩沖液沖洗至無(wú)蛋白流出為止(圖3)。測(cè)量595nm吸光度，根據(jù)輸入蛋白總量和輸出蛋白量的差值，計(jì)算固定化lasr的量。

實(shí)施例3：lasr親和整體色譜柱的特異性評(píng)價(jià)

利用現(xiàn)有技術(shù)已知的lasr抑制劑對(duì)制備的親和整體柱進(jìn)行親和特異性測(cè)試，從而評(píng)價(jià)該柱的有效性。

使用現(xiàn)有技術(shù)已知的群體感抑制劑呋喃酮c31((z)-4-溴-5-(溴亞甲基)-2(5h)-呋喃酮)為陽(yáng)性對(duì)照，驗(yàn)證lasr親和整體色譜柱對(duì)細(xì)菌生物膜抑制劑的結(jié)合和保留能力。結(jié)果如圖4所示，在6分鐘時(shí)加入洗脫液1.2min后出現(xiàn)洗脫峰，表明呋喃酮c31能夠特異性結(jié)合到lasr親和整體色譜柱上，在洗滌步驟中不解離，洗脫步驟中從lasr親和整體色譜柱上解離。

使用本領(lǐng)域常用的載體蛋白質(zhì)bsa為陰性對(duì)照，驗(yàn)證lasr親和整體色譜柱對(duì)雜蛋白的非特異性結(jié)合能力。加入洗脫液后，未出現(xiàn)任何洗脫峰，表明bsa不能特異性結(jié)合到lasr親和整體色譜柱上，在洗滌步驟中即流出色譜柱，洗脫步驟中未產(chǎn)生任何洗脫峰。

實(shí)施例4：廣金錢(qián)草乙醇提取物的抑菌活性和抑制細(xì)菌生物膜形成的能力

根據(jù)傳統(tǒng)中藥材清熱解毒的功效以及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中細(xì)菌感染的機(jī)制，清熱解毒類(lèi)藥材通常具有抗菌消炎的作用。廣金錢(qián)草具有清熱利尿功能，然而至今尚未能純化出其中的抗菌活性成分。

將廣金錢(qián)草用70％乙醇回流提取3h，旋蒸濃縮獲得廣金錢(qián)草乙醇粗提取物，進(jìn)行細(xì)菌生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)和生物膜形成抑制實(shí)驗(yàn)。

細(xì)菌生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的二倍稀釋法測(cè)定。取13支無(wú)菌試管，第1管加1.8ml營(yíng)養(yǎng)肉湯，第2～13管每管各加1ml營(yíng)養(yǎng)肉湯；在無(wú)菌操作條件下，吸取稀釋好的藥物0.2ml加入到第1管，混勻后吸取1ml入第2管中，依次倍此稀釋至第13管，最后保持其濃度依次是512μg/ml、256μg/ml、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml。各管均加入供試菌液0.05ml，混勻之后置于37℃培養(yǎng)24h，在生長(zhǎng)對(duì)照管的細(xì)菌生長(zhǎng)狀況良好的前提下，以肉眼觀察藥物最低濃度管無(wú)菌生長(zhǎng)者，即為該受試藥物的mic。

細(xì)菌生物膜形成抑制實(shí)驗(yàn)依照細(xì)菌粘附到微量聚氯乙烯96孔板的能力進(jìn)行分析。將100μl含有0.2％酪蛋氨酸和甘油加入稀釋培養(yǎng)過(guò)夜的菌液(od600，0.05)，加入到96孔微量板的各孔中。然后每孔加入系列濃度(1/2mic、1/4mic、1/8mic、1/16mic)的測(cè)試樣品。30℃培養(yǎng)20h后，用蒸餾水洗滌2次、除去浮游生物細(xì)胞，然后加入125μl1％龍膽紫。室溫放置15min后，用蒸餾水小心洗滌3次，加入300μl95％乙醇以溶解染色的生物膜，對(duì)其溶液在630nm的吸光度進(jìn)行分析。平行測(cè)定三次。結(jié)果以生物膜抑制率(％)表示。吸光度值與生物膜的形成程度正相關(guān)。

生物膜抑制率(％)＝(od陰性組-od樣品組)/od陰性組×100％

抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明廣金錢(qián)草乙醇粗提物對(duì)銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度(mic)為32μg/ml，群體感抑制劑呋喃酮c31對(duì)所述銅綠假單胞菌的mic為2μg/ml。

細(xì)菌生物膜形成抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明廣金錢(qián)草乙醇粗提物對(duì)銅綠假單胞菌生物膜形成的抑制活性為：吸光度(630nm)為0.073±0.006，抑制率為80.84％；陽(yáng)性對(duì)照品呋喃酮c31對(duì)銅綠假單胞菌生物膜形成的抑制活性為：吸光度(630nm)為0.053±0.007，抑制率為86.09％。證實(shí)了該乙醇提取物具有qs抑制效果。

實(shí)施例5：廣金錢(qián)草乙醇提取物過(guò)lasr親和整體色譜柱洗脫液的hplc-dad分析結(jié)果(圖5)

將實(shí)施例4中制備的廣金錢(qián)草乙醇提取物過(guò)lasr親和整體色譜柱，收集洗脫液，將含蛋白的洗脫級(jí)分合并，進(jìn)行hplc-dad色譜分析。

優(yōu)化后的色譜條件為：以phenomenexgeminic18(250mm×4.6mm，5μmparticlesize)為色譜柱，1％甲酸溶液和甲醇(含0.1％磷酸)為流動(dòng)相梯度洗脫，dad檢測(cè)器在274nm處進(jìn)行檢測(cè)。

圖5所示的hplc-dad圖譜給出了廣金錢(qián)草提取液經(jīng)過(guò)lasr親和整體色譜柱后洗脫液中的12個(gè)單體化合物作為候選生物膜形成抑制劑。

實(shí)施例6：廣金錢(qián)草乙醇提取物過(guò)lasr親和整體色譜柱后候選單體化合物對(duì)細(xì)菌生物膜形成的抑制率和生物膜抑制情況

從實(shí)施例5所示12個(gè)單體化合物中取一個(gè)單體化合物，將經(jīng)培養(yǎng)有細(xì)菌生長(zhǎng)的生物膜載體用2.5％戊二醛固定，依次用50％，70％，90％，無(wú)水乙醇梯度脫水，然后用醋酸異戊酯置換，co2臨界點(diǎn)干燥，載體表面在真空條件下鍍金粉，電子掃描顯微鏡觀察，確認(rèn)生物膜形成。

圖6的結(jié)果表明，陰性對(duì)照組組細(xì)菌聚集、形成大量生物膜；實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌聚集度低、形成生物膜較少。

將耐藥細(xì)菌接種于lb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，收集菌液，5000r/min離心5min，用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次。洗后的細(xì)菌重新加入生理鹽水配成0.5麥?zhǔn)洗藵岫葮?biāo)準(zhǔn)(細(xì)菌數(shù)約為5×10^8-9cfu/ml)的菌懸液，再加生理鹽水稀釋50倍。對(duì)照組為mhb培養(yǎng)基，用藥組為溶解有活性化合物的mhb培養(yǎng)基，與藥物接觸15h。取1ml培養(yǎng)液，離心5min，棄去上清液，將收集的細(xì)菌樣本用雙蒸水洗滌兩次，去除表面浮游細(xì)菌，小心滴于蓋玻片，待水分自然風(fēng)干，用原子力顯微鏡觀察成像。

圖7的結(jié)果表明，陰性對(duì)照組由于大量生物膜的形成導(dǎo)致細(xì)菌聚集；實(shí)驗(yàn)組則由于生物膜的形成收到了抑制，導(dǎo)致菌體分散。

利用實(shí)施例4中所述的方法對(duì)8種進(jìn)行生物膜抑制實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。

圖8的結(jié)果表明，來(lái)自金錢(qián)草的8種化合物能夠抑制多種細(xì)菌生物膜的形成，且對(duì)細(xì)菌生物膜形成的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴(lài)。

綜合上述實(shí)施例的內(nèi)容可知，本發(fā)明所建立的基于lasr親和整體色譜柱的分離鑒定細(xì)菌生物膜抑制成分的方法，適用于天然藥物中抗菌活性成分的分離鑒定，獲得對(duì)細(xì)菌生物膜形成的抑制作用的單體化合物的效率高、方向明確、具有較好的可預(yù)期性。

上述說(shuō)明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書(shū)為準(zhǔn)。