本發(fā)明屬于腫瘤診斷和分子靶向治療領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種跨膜蛋白tmem170b在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤(tumor)是目前危害人類健康最嚴(yán)重的一類疾病。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的產(chǎn)生是一個由基因突變逐漸積累的復(fù)雜過程，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)的發(fā)展，使得腫瘤治療進(jìn)入個體化時代，大大增加腫瘤治療的緩解率。因此找到特異性的靶點對于腫瘤早期診斷、治療及預(yù)后是目前制約腫瘤臨床療效的關(guān)鍵瓶頸。

乳腺癌是女性中一類具有高侵襲性、高致死率的惡性腫瘤。據(jù)世界衛(wèi)生組織(who)統(tǒng)計，全球每年約有130萬的女性罹患乳腺癌，且其中有超過50萬因發(fā)生轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)死亡。目前乳腺癌的治療手段主要為手術(shù)、化療和放療相結(jié)合，靶向藥物研發(fā)進(jìn)展比較緩慢，主要包括針對乳腺癌表面標(biāo)志物her2的抗體曲妥珠單抗、帕妥珠單抗，以及拉帕替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑，臨床治療費用高昂且患者收益有限。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的乳腺癌生物標(biāo)志物用于早期檢測或乳腺癌靶向治療，降低乳腺癌患者的死亡率，減少副作用。

肺癌是指發(fā)生于支氣管粘膜上皮的惡性腫瘤，也叫原發(fā)性支氣管肺癌。非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancer，nsclc)是肺癌最常見的組織學(xué)類型，約占肺癌總數(shù)的80-85％，可進(jìn)一步分為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌。近年來非小細(xì)胞肺癌發(fā)病率不斷增高，無論是在我國還是全球，都已成為致死率最高的腫瘤。

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤，在我國各種惡性腫瘤中居首位，其發(fā)病有明顯的地域性差別，在我國的西北與東部沿海地區(qū)胃癌發(fā)病率比南方地區(qū)明顯為高。據(jù)統(tǒng)計中國每年的死亡人數(shù)約有17萬，約占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的1/4。

腎癌又稱腎細(xì)胞癌，起源于腎小管上皮細(xì)胞，是最常見的腎臟實質(zhì)惡性腫瘤。全球每年約有208,500的新增病例，在我國發(fā)病率約4.5/10萬，目前對腎癌的病因了解并不清楚，且臨床治療發(fā)現(xiàn)腎癌患者多數(shù)對放化療均不敏感，多依賴于手術(shù)切除。因此提高早期診斷的準(zhǔn)確性，有助于腎癌患者進(jìn)行及時治療。

腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲是惡性腫瘤的重要特征，也是引起大多數(shù)腫瘤復(fù)發(fā)的元兇。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲是一個連續(xù)的、由多基因參與的動態(tài)過程，其中原癌基因與抑癌基因發(fā)揮同等重要的作用。大量原癌基因如pten、myc、ras、pik3ca、akt1在包括乳腺癌在內(nèi)的惡性腫瘤中的作用被深入揭示，而抑癌基因除tp53以外的研究鮮有報道。借助高通量篩選及大數(shù)據(jù)分析等生物信息學(xué)手段，發(fā)現(xiàn)具有重要功能的抑癌基因?qū)沂灸[瘤的發(fā)病機(jī)制、提出更全面的診療方案十分重要。

wnt信號通路是一類在多細(xì)胞真核生物中高度保守的信號通路，主要分為經(jīng)典wnt/β-catenin信號通路和非經(jīng)典wnt(調(diào)控細(xì)胞骨架的wnt/pcp通路，影響ca²⁺釋放的wnt/ca²⁺)。經(jīng)典wnt/β-catenin信號通路的異常激活與腫瘤發(fā)生、腫瘤細(xì)胞增殖分化、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等密切相關(guān)。β-catenin在核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄抑制因子p300等競爭性地與轉(zhuǎn)錄因子即t細(xì)胞因子/淋巴樣增強(qiáng)因子(tcf/lef)結(jié)合，并形成β-catenin/tcf/lef轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，在有關(guān)輔助激活因子的協(xié)同作用下，最終激活wnt信號的有關(guān)靶基因cd44、c-myc和cyclind，參與腫瘤細(xì)胞生長、分化、凋亡和轉(zhuǎn)移等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

1.要解決的問題

針對現(xiàn)有的乳腺癌等惡性腫瘤缺乏關(guān)系密切的標(biāo)志物，本發(fā)明提供一種腫瘤標(biāo)志物tmem170b蛋白及其在制備抑制腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用，本發(fā)明結(jié)合生物信息學(xué)手段、臨床腫瘤樣本以及生物功能實驗，發(fā)現(xiàn)與乳腺癌等惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系的新的標(biāo)志物。

2.技術(shù)方案

為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

tmem170b蛋白在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌(鱗癌和腺癌)、胃癌、腎癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常組織。

更進(jìn)一步地，所述的腫瘤主要為乳腺癌，所述的腫瘤細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞。

基于此，本發(fā)明提供一種腫瘤的生物標(biāo)志物，所述的生物標(biāo)志物為跨膜蛋白tmem170b，tmem170b蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列seqidno.1。

檢測生物標(biāo)志物表達(dá)的試劑在制備用于對上述惡性腫瘤進(jìn)行預(yù)后的工具中的用途，所述的生物標(biāo)志物包括跨膜蛋白tmem170b，所述的預(yù)后的方法包括：

從患有上述腫瘤的對象獲得測試樣品；

確定所述測試樣品中包括跨膜蛋白tmem170b的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平；和

分析所述表達(dá)水平以產(chǎn)生風(fēng)險評分，其中該風(fēng)險評分可用于提供對象的預(yù)后。

更進(jìn)一步地，所述的測試樣品是新鮮的、冷凍的或石蠟固定包埋的細(xì)胞。

更進(jìn)一步地，用于檢測生物標(biāo)志物表達(dá)水平的方法是免疫印跡。

抗tmem170b蛋白抗體用于制備上述腫瘤檢測用組合物的用途或制備含有抗tmem170b蛋白抗體的組合物檢測試劑。

促進(jìn)跨膜蛋白tmem170b的物質(zhì)在制備用于治療腫瘤藥物中的用途。

更進(jìn)一步地，所述的促進(jìn)跨膜蛋白tmem170b的表達(dá)的物質(zhì)為如下a或b：

a、一種核苷酸，其核苷酸序列為序列表中的seqidno.2；

b、含有a所述核苷酸的過表達(dá)質(zhì)粒載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或慢病毒。

tmem170b蛋白在制備具有如下至少一種功能產(chǎn)品中的應(yīng)用：

(1)抑制腫瘤細(xì)胞增殖；

(2)抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲；

(3)抑制腫瘤生長；

(4)阻止β-catenin從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位；

所述各功能均是通過所述的tmem170b蛋白抑制β-catenin從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中實現(xiàn)的。

tmem170b蛋白在制備篩選抗腫瘤藥物、惡性腫瘤診斷中的應(yīng)用。

3.有益效果

相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：

(1)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)跨膜蛋白tmem170b在腫瘤診斷預(yù)后和治療方面具有重要作用，可以作為腫瘤包括乳腺癌的生物標(biāo)志物；

(2)本發(fā)明通過表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析和臨床樣本組織芯片，發(fā)現(xiàn)跨膜蛋白tmem170b在乳腺癌組織的基因和蛋白表達(dá)水平顯著低于正常組織，且tmem170b表達(dá)高的患者預(yù)后顯著高于tmem170b低表達(dá)的患者，表明tmem170b可以作為一種新的乳腺癌標(biāo)志物，用于早期乳腺癌的輔助診斷和預(yù)后效果的判定；

(3)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)跨膜蛋白tmem170b在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于乳腺上皮細(xì)胞，tmem170b缺失表達(dá)后能夠明顯促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和克隆形成，以及體內(nèi)異種移植小鼠腫瘤模型的腫瘤生長及遠(yuǎn)端肺轉(zhuǎn)移；反之tmem170b過表達(dá)會顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、克隆形成和體內(nèi)腫瘤生長，這證明tmem170b對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要性，并提示其作為靶標(biāo)進(jìn)行藥物設(shè)計的潛能，例如促進(jìn)跨膜蛋白tmem170b表達(dá)的物質(zhì)(包括針對tmem170b的過表達(dá)質(zhì)粒載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或慢病毒等)可用于制備治療乳腺癌的藥物；

(4)本發(fā)明通過實驗證明tmem170b與β-catenin存在相互作用，tmem170b過表達(dá)能阻止β-catenin從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位，抑制下游靶點的表達(dá)，負(fù)調(diào)控wnt信號通路腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中的作用；tmem170b缺失表達(dá)會降低β-catenin質(zhì)核轉(zhuǎn)位，引起下游靶點的表達(dá)升高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移；

(5)本發(fā)明設(shè)計的實驗科學(xué)合理、可行有效，對tmem170b的功能研究深入系統(tǒng)；基于以上發(fā)現(xiàn)，tmem170b蛋白表達(dá)水平可作為一個新的生物標(biāo)志物來幫助包括乳腺癌在內(nèi)的惡性腫瘤的診斷和惡性程度的預(yù)測；本發(fā)明以tmem170b作為生物標(biāo)志物的靶向療法為腫瘤治療提供了新的思路。

附圖說明

附圖1為tmem170b基因在117對乳腺癌和正常組織中的表達(dá)量比較，數(shù)據(jù)來自tcga數(shù)據(jù)庫；

附圖2為tmem170b基因在人腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)量比較，數(shù)據(jù)來自tcga數(shù)據(jù)庫；

附圖3為tmem170b的表達(dá)與肺鱗癌(圖3a)、肺腺癌(圖3b)、胃癌(圖3c)、腺癌(圖3d)患者總生存率之間的相關(guān)性示意圖，數(shù)據(jù)來自tcga數(shù)據(jù)庫；

附圖4為tmem170b基因表達(dá)水平與乳腺癌總生存率的關(guān)系，數(shù)據(jù)來自tcga數(shù)據(jù)庫；

附圖5為tmem170b蛋白在乳腺癌組織和正常組織中的表達(dá)量比較；

附圖6為tmem170b基因在乳腺癌細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)量比較；

附圖7為tmem170b蛋白在乳腺癌細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)量比較；

附圖8為過表達(dá)tmem170b表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中tmem170b基因和蛋白表達(dá)量的影響；

附圖9為shrna干擾tmem170b抑制乳腺癌細(xì)胞mcf7中tmem170b基因和蛋白表達(dá)量的影響；

附圖10為干擾tmem170b表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響結(jié)果圖；

附圖11為干擾tmem170b表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響結(jié)果圖；

附圖12為干擾tmem170b表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響結(jié)果圖；

附圖13為干擾tmem170b表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞克隆形成數(shù)目的影響結(jié)果圖；

附圖14為過表達(dá)tmem170b抑制乳腺癌裸鼠移植瘤的生長結(jié)果圖；

附圖15為tmem170b過表達(dá)能顯著抑制mda-mb-231細(xì)胞遠(yuǎn)端肺轉(zhuǎn)移；

附圖16為shrna干擾tmem170b促進(jìn)乳腺癌裸鼠移植瘤的生長；

附圖17為shrna干擾tmem170b促進(jìn)mcf7細(xì)胞遠(yuǎn)端肺轉(zhuǎn)移；

附圖18為過表達(dá)tmem170b抑制β-catenin質(zhì)核轉(zhuǎn)位及下游靶點表達(dá)；

附圖19為shrna干擾tmem170b促進(jìn)β-catenin質(zhì)核轉(zhuǎn)位及下游靶點表達(dá)。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行描述。

實施例1

人乳腺癌與配對正常組織的表達(dá)譜芯片分析

腫瘤基因組圖譜(tcga)計劃由美國nationalcancerinstitute(nci)和nationalhumangenomeresearchinstitute(nhgri)于2006年聯(lián)合啟動的項目，利用大規(guī)模測序為主的基因組分析技術(shù)，針對36種癌癥進(jìn)行大規(guī)模實驗，tcga基因組分析中心(gcc)比對腫瘤和正常組織，尋找與各癌癥或者亞型相關(guān)的基因突變、擴(kuò)增或者缺失。為理解癌癥的分子機(jī)制，提高人們對癌癥發(fā)病分子基礎(chǔ)的科學(xué)認(rèn)識提供幫助。

tcga標(biāo)準(zhǔn)方法下載117對乳腺癌組織和正常組織的全基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)及臨床信息，統(tǒng)計分析采用r語言(3.1.1版本)軟件，需安裝及加載的程序包(heatmap，venndiagram，hist等)，然后用deseq和edger程序包進(jìn)行分析，找出差異表達(dá)的基因。判斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)癌/癌旁的表達(dá)量<-2，(2)p<0.05，(3)在乳腺癌中未被報道。

表1乳腺癌中表達(dá)下調(diào)的差異基因(n＝117)

結(jié)果見表1和圖1，芯片分析發(fā)現(xiàn)與正常組織比較，在乳腺癌組織中存在多條表達(dá)下調(diào)的基因。其中tmem170b在癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)，初步推定其可能在人乳腺癌組織中存在特異性表達(dá)，本發(fā)明通過以下實施例進(jìn)行驗證。

實施例2

tmem170bmrna在人腫瘤組織和配對正常組織中的表達(dá)水平分析

采用tcga標(biāo)準(zhǔn)方法下載504例肺鱗癌、585例肺腺癌、443例胃癌和537例腎癌組織樣本的表達(dá)譜數(shù)據(jù)及臨床信息，統(tǒng)計分析采用r語言(3.1.1版本)軟件，用deseq和edger程序包分析tmem170b基因在上述腫瘤組織和配對正常組織中的表達(dá)水平。

結(jié)果見圖2，芯片分析發(fā)現(xiàn)與配對正常組織比較，tmem170b在非小細(xì)胞肺癌(鱗癌和腺癌)、胃癌、腎癌的表達(dá)水平顯著降低，考慮可作為非小細(xì)胞肺癌(鱗癌和腺癌)、胃癌、腎癌的早期診斷指標(biāo)。

實施例3

tmem170bmrna表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌、胃癌、腺癌患者總生存率的關(guān)系

采用tcga標(biāo)準(zhǔn)方法下載504例肺鱗癌、585例肺腺癌、443例胃癌和537例腎癌患者的臨床隨訪患者生存信息，采用r語言軟件，安裝及加載survival程序包，繪制tmem170bmrna表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌、胃癌、腺癌患者總生存率的關(guān)系圖。

結(jié)果見圖3，tmem170b的表達(dá)與肺鱗癌(圖3a)、肺腺癌(圖3b)、胃癌(圖3c)、腺癌(圖3d)患者總生存率均存在顯著性相關(guān)性，tmem170b表達(dá)高的患者總生存率顯著高于tmem170b低表達(dá)的患者，由此推斷tmem170b作為非小細(xì)胞肺癌、胃癌、腺癌預(yù)后的一個良好指標(biāo)。

實施例4

tmem170bmrna表達(dá)水平與乳腺癌患者總生存率的關(guān)系

采用tcga標(biāo)準(zhǔn)方法下載1071例乳腺癌組織樣本的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)和臨床隨訪患者生存狀態(tài)，自行編寫python腳本提取tmem170b的mrna表達(dá)數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析采用r語言軟件，安裝及加載survival程序包，繪制tmem170bmrna表達(dá)水平與乳腺癌患者總生存率的關(guān)系圖。

結(jié)果見圖4，tmem170b的表達(dá)與乳腺癌病人的存活率存在相關(guān)性，tmem170b表達(dá)高的患者總生存率顯著高于tmem170b低表達(dá)的患者，進(jìn)一步證實tmem170b作為乳腺癌預(yù)后的一個新指標(biāo)。

實施例5

檢測tmem170b蛋白在乳腺癌組織和正常組織中的表達(dá)量

一、材料和方法

1.材料

另外選取45對人乳腺癌的癌組織和配對正常組織，對tmem170b蛋白的表達(dá)差異進(jìn)行免疫組化驗證。

2.方法

將臨床新鮮組織樣本進(jìn)行4％多聚甲醛固定，石蠟包埋切片放置在60℃恒溫箱中烘烤120min。依次二甲苯、100-30％梯度乙醇進(jìn)行脫蠟，自來水和雙氧水各1min進(jìn)行水化。微波修復(fù)程序：預(yù)熱5min，高火4min，中火5min；pbs洗3次各5min，5％bsa封閉30min；滴加一抗tmem170b，4℃過夜；pbs沖洗3次各5min。滴加二抗，37℃孵育30min；pbs洗3次各5min。dab顯色，自來水充分沖洗；蘇木素復(fù)染，自來水充分沖洗。脫水、透明各5～10min。中性樹脂封片，加蓋玻片(組織部位切勿殘留小氣泡)，自然晾干。

結(jié)果見圖5，tmem170b蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著低于正常組織。

實施例6

檢測乳腺癌細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞中的tmem170b基因表達(dá)--實時定量pcr

一、材料和方法

1.材料

乳腺癌細(xì)胞株mda-mb-231、mda-mb-435、bt474、mcf7和乳腺上皮細(xì)胞mcf10a均購自美國atcc細(xì)胞庫。

2.方法

2.1乳腺癌細(xì)胞和上皮細(xì)胞總rna的提取

按life公司的trizol說明書提取乳腺癌細(xì)胞和上皮細(xì)胞總rna，再用nanodropnd-1000核酸定量儀定量所提取的rna的純度和濃度，瓊脂糖質(zhì)檢確保提取rna的完整性。

2.2對樣品rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cdna

采用takara試劑盒primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)對提取的總rna反轉(zhuǎn)錄合成cdna。該試劑盒含gdnaeraserdnase，可有效去除混雜的基因組dna。

2.3實時定量pcr

根據(jù)tmem170b和β-actin的核酸序列設(shè)計特異性引物，采用takara試劑盒premixextaqtmii(tlirnasehplus)進(jìn)行pcr反應(yīng)，tmem170b的上游引物和下游引物分別為seqidno.3和seqidno.4，β-actin的上游引物和下游引物分別為seqidno5和seqidno.6。

反應(yīng)體系如下表：

表2pcr反應(yīng)體系

將上述組份混合均勻后按以下程序：95℃30s預(yù)變性，40個循環(huán)；95℃5s，60℃30s。

根據(jù)熔解曲線判斷反應(yīng)的特異性，由公式2^-δδct計算tmem170b的mrna表達(dá)量。結(jié)果見圖6，與乳腺上皮細(xì)胞mcf10a相比，四株乳腺癌細(xì)胞中的tmem170b顯著較低，其中具有高遷移能力的mda-mb-231細(xì)胞中的tmem170b表達(dá)量最低。

實施例7

檢測乳腺癌細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞中tmem170b蛋白的表達(dá)量--免疫印跡

收集80％匯合度時細(xì)胞，離心后棄上清，pbs潤洗兩次，棄上清。加入ripa裂解液，冰上裂解20min。12000g離心10min收集上清。加入1xsds上樣緩沖液，吹打混勻后煮沸變性5min。10％sds-page凝膠分離總蛋白，然后轉(zhuǎn)移到pvdf膜。5％bsa室溫封閉2h，與tmem170b抗體(abcam)4℃孵育過夜，tbst洗滌3次。二抗室溫孵育1h，tbst洗滌3次。ecl超敏化學(xué)發(fā)光液顯影，經(jīng)tannon成像系統(tǒng)成像。以β-actin作為內(nèi)參比較不同細(xì)胞中tmem170b蛋白的表達(dá)水平。

結(jié)果見圖7，與tmem170bmrna表達(dá)差異一致，在四種乳腺癌細(xì)胞系中tmem170b蛋白的表達(dá)量顯著低于乳腺上皮細(xì)胞。

實施例8

過表達(dá)tmem170b載體的制備和病毒轉(zhuǎn)染效率檢測

同時合成針對tmem170b的全長cdna(具體序列見seqidno.2)，導(dǎo)入pcdna3.1質(zhì)粒中。將上述質(zhì)粒同包裝質(zhì)粒pspax2和包膜質(zhì)粒pmd2.g共轉(zhuǎn)入293t細(xì)胞中以產(chǎn)生病毒，轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞的病毒上清，感染mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞。感染24h后，加入嘌呤霉素在乳腺癌mda-mb-231中篩選獲得穩(wěn)定促進(jìn)tmem170b基因表達(dá)的細(xì)胞株。收集mda-mb-231/pcdna-tmem170b細(xì)胞和mda-mb-231/pcdna-control細(xì)胞的總rna和蛋白，通過qpcr(具體方法同實施例6)和免疫印跡(具體方法同實施例7)的方法，比較mda-mb-231/pcdna-tmem170b細(xì)胞和mda-mb-231/pcdna-control細(xì)胞中tmem170b基因和蛋白的表達(dá)量的變化。

結(jié)果見圖8，過表達(dá)tmem170b使mda-mb-231細(xì)胞中tmem170b基因(圖8a)和蛋白(圖8b)的表達(dá)量顯著升高。

實施例9

干擾tmem170b表達(dá)的shrna載體的制備和病毒轉(zhuǎn)染效率檢測

按照shrna的設(shè)計規(guī)則，設(shè)計兩條tmem170b小分子干擾rna(序列分別為seqidno.7和seqidno.8)。將這兩個序列導(dǎo)入pglvh1/gfp-puro載體中。將上述質(zhì)粒同包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入293t細(xì)胞中以產(chǎn)生病毒，轉(zhuǎn)染24h后，收集細(xì)胞的病毒上清，感染mcf7乳腺癌細(xì)胞。感染48h后，加入嘌呤霉素在乳腺癌mcf7中篩選獲得穩(wěn)定干擾tmem170b基因表達(dá)的細(xì)胞株。收集mcf7/shrna-tmem170b細(xì)胞和mcf7/shrna-control細(xì)胞的總rna和蛋白，通過qpcr(具體方法同實施例6)和免疫印跡(具體方法同實施例7)的方法，比較mcf7/shrna-tmem170b細(xì)胞和mcf7/shrna-control細(xì)胞中tmem170b基因和蛋白的表達(dá)量的變化。

結(jié)果見圖9，干擾tmem170b能顯著降低mcf7細(xì)胞中tmem170b基因(圖9a)和蛋白(圖9b)的表達(dá)量。

實施例10

干擾tmem170b表達(dá)影響乳腺癌細(xì)胞增殖能力

mda-mb-231細(xì)胞表達(dá)對照pcrna和pcdna-tmem170b；mcf7細(xì)胞表達(dá)對照shrna和shrna-tmem170b。采用mtt法檢測干擾tmem170b表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖的活性的影響。乳腺癌細(xì)胞在37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至密度90％以上時用胰蛋白酶消化收集，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并在顯微鏡下計數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為3.0×10⁴個/ml，將細(xì)胞懸液接種到96孔板中，每孔100μl，并于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0h、24h、48h和72h后向96孔板中每孔加入20μl5mg/ml的mtt，繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸去培養(yǎng)基，每孔加入100μldmso溶解。用酶標(biāo)儀在檢測波長為570nm，參比波長為630nm處測定吸光值，并計算生長抑制率(proliferationinhibition，pi)。

試驗獨立重復(fù)3次，試驗得到的結(jié)果以mean±sd表示，并進(jìn)行統(tǒng)計t檢驗，*p＜0.05為顯著性差異，**p＜0.01為極顯著性差異。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)tmem170b表達(dá)后，mda-mb-231細(xì)胞的增殖速度明顯減弱(圖10a)；沉默tmem170b會導(dǎo)致mcf7細(xì)胞增殖速度加快(圖10b)。

實施例11

干擾tmem170b表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響

將乳腺癌細(xì)胞接種到transwell小室中，每孔100μl，在transwell下室加入0.6ml含10％fbs的完全培養(yǎng)基刺激細(xì)胞遷移，于5％co2，37℃培養(yǎng)24h。棄去孔中培液，用90％酒精常溫固定30min，0.1％結(jié)晶紫常溫染色10min，清水漂凈，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，顯微鏡下觀察并選擇四個視野拍照計數(shù)。按照公式計算遷移抑制率(migrationinhibitionrate，mir)：

其中ntest為測試組的細(xì)胞遷移數(shù)，ncontrol為空白對照組的細(xì)胞遷移數(shù)。試驗獨立重復(fù)3次，試驗得到的結(jié)果計算mean±sd，并進(jìn)行統(tǒng)計t檢驗，*p＜0.05為顯著性差異，**p＜0.01為極顯著性差異。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)tmem170b表達(dá)后，mda-mb-231細(xì)胞的遷移能力明顯減弱(圖11a)；沉默tmem170b會導(dǎo)致mcf7細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)(圖11b)。

實施例12

干擾tmem170b表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

將10mg/mlmatrigel用培養(yǎng)基以1:3稀釋，涂布于transwell小室膜上，室溫風(fēng)干。將培養(yǎng)到對數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞用胰蛋白酶消化，收集，用pbs洗滌兩次后用空白培養(yǎng)基重懸。將細(xì)胞濃度調(diào)整到1×10⁵個/ml。將細(xì)胞接種到transwell小室中，每孔100μl，在transwell下室加入0.6ml含10％fbs的完全培養(yǎng)基刺激細(xì)胞侵襲，于5％co2，37℃培養(yǎng)24h。棄去孔中培液，用90％酒精常溫固定30min，0.1％結(jié)晶紫常溫染色10min，清水漂凈，用棉簽輕輕擦掉上層未發(fā)生侵襲的細(xì)胞，顯微鏡下觀察并選擇四個視野拍照計數(shù)。按照公式計算侵襲抑制率(invasioninhibitionrate,iir)：

其中ntest為測試組的細(xì)胞侵襲數(shù)，ncontrol為空白對照組的細(xì)胞侵襲數(shù)。試驗獨立重復(fù)3次，試驗得到的結(jié)果計算mean±sd，并進(jìn)行統(tǒng)計t檢驗，*p＜0.05為顯著性差異，**p＜0.01為極顯著性差異。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)tmem170b表達(dá)后，mda-mb-231細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱(圖12a)；沉默tmem170b會導(dǎo)致mcf7細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)(圖12b)。

實施例13

干擾tmem170b表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞克隆形成數(shù)目的影響

將1.6％低熔點瓊脂糖與細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合制備0.8％的底層瓊脂，24孔板中每個孔0.5ml，4℃凝固5min。取對數(shù)期細(xì)胞，胰酶消化后吹散成單個細(xì)胞懸液，計數(shù)，并調(diào)細(xì)胞濃度為10000個/ml，將1.4％低熔點瓊脂糖與細(xì)胞懸液以1:1的體積比混合，制備0.7％的上層瓊脂，每孔加0.5ml(約2500cell/well)，混勻，4℃凝固5min。置于37℃，5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，計數(shù)直徑在50μm以上的克隆，計算細(xì)胞集落形成率。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)tmem170b表達(dá)后，mda-mb-231細(xì)胞的克隆形成數(shù)明顯減少(圖13a)；沉默tmem170b會導(dǎo)致mcf7細(xì)胞的克隆形成數(shù)明顯增多(圖13b)。

實施例14

過表達(dá)tmem170b抑制乳腺癌體內(nèi)腫瘤的生長和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移

將實施例8得到的2×10⁶mda-mb-231/pcdna-tmem170b細(xì)胞和mda-mb-231/pcdna-control細(xì)胞分別接種到6周齡雌性balb/c-nu裸鼠的右側(cè)第四個脂肪墊，每隔2天測量腫瘤的直徑，第35天結(jié)束實驗取出腫瘤組織拍照，并解剖主要器官心、肝、脾、肺、腎，進(jìn)行he染色觀察是否存在病理學(xué)變化。

裸鼠移植瘤體積大小見圖14a和14b，tmem170b過表達(dá)的mda-mb-231比對照細(xì)胞的腫瘤生長速度更慢，且腫瘤體積明顯減小。

he染色結(jié)果(圖15)發(fā)現(xiàn)tmem170b過表達(dá)能顯著抑制mda-mb-231細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)端肺轉(zhuǎn)移，對其它組織器官沒有副作用。

實施例15

shrna干擾tmem170b促進(jìn)乳腺癌體內(nèi)腫瘤的生長和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移

將實施例9得到的5×10⁶mcf7/shrna-tmem170b細(xì)胞和mcf7/shrna-control細(xì)胞分別接種到6周齡雌性balb/c-nu裸鼠的右側(cè)第四個脂肪墊，每隔2天測量腫瘤的直徑，第35天結(jié)束實驗取出腫瘤組織拍照，并解剖主要器官心、肝、脾、肺、腎，進(jìn)行he染色觀察是否存在病理學(xué)變化。

裸鼠移植瘤體積大小見圖16a和16b，tmem170b沉默的mcf7細(xì)胞比對照細(xì)胞的腫瘤生長速度更快，且腫瘤體積明顯縮小。

he染色結(jié)果(圖17)發(fā)現(xiàn)tmem170b沉默能顯著促進(jìn)mcf7細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)端肺轉(zhuǎn)移，對其它組織器官沒有副作用。

實施例16

過表達(dá)tmem170b抑制β-catenin質(zhì)核轉(zhuǎn)位及下游靶點表達(dá)--免疫印跡

收集80％匯合度時細(xì)胞，離心后棄上清，pbs潤洗兩次，棄上清。采用ripa裂解液收集mda-mb-231/pcdna-tmem170b細(xì)胞和mda-mb-231/pcdna-control的總蛋白，采用細(xì)胞漿蛋白和核蛋白抽提試劑盒(碧云天p0028)收集兩種細(xì)胞中的漿蛋白和核蛋白。加入1×sds上樣緩沖液，吹打混勻后煮沸變性5min。10％sds-page凝膠分離總蛋白，然后轉(zhuǎn)移到pvdf膜。5％bsa室溫封閉2h，分別與一抗(β-catenin、tcf4、cd44、c-myc和cyclind)4℃孵育過夜，tbst洗滌3次。二抗室溫孵育1h，tbst洗滌3次。ecl超敏化學(xué)發(fā)光液顯影，經(jīng)tannon成像系統(tǒng)成像。以β-actin作為漿蛋白內(nèi)參，以histoneh3作為核蛋白內(nèi)參，比較過表達(dá)tmem170b后對β-catenin質(zhì)核轉(zhuǎn)位及下游靶點表達(dá)的影響。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)tmem170b后，能顯著抑制β-catenin從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中(圖18a)，并能下調(diào)tcf4、cd44、c-myc和cyclind的表達(dá)(圖18b)。

實施例17

shrna干擾tmem170b促進(jìn)β-catenin質(zhì)核轉(zhuǎn)位及下游靶點表達(dá)--免疫印跡

收集80％匯合度時細(xì)胞，離心后棄上清，pbs潤洗兩次，棄上清。采用ripa裂解液收集mcf7/shrna-tmem170b細(xì)胞和mcf7/shrna-control細(xì)胞的總蛋白，采用細(xì)胞漿蛋白和核蛋白抽提試劑盒(碧云天p0028)收集兩種細(xì)胞中的漿蛋白和核蛋白。加入1×sds上樣緩沖液，吹打混勻后煮沸變性5min。10％sds-page凝膠分離總蛋白，然后轉(zhuǎn)移到pvdf膜。5％bsa室溫封閉2h，分別與一抗(β-catenin、tcf4、cd44、c-myc和cyclind)4℃孵育過夜，tbst洗滌3次。二抗室溫孵育1h，tbst洗滌3次。ecl超敏化學(xué)發(fā)光液顯影，經(jīng)tannon成像系統(tǒng)成像。以β-actin作為漿蛋白內(nèi)參，以histoneh3作為核蛋白內(nèi)參，比較shrna干擾tmem170b后對β-catenin質(zhì)核轉(zhuǎn)位及下游靶點表達(dá)的影響。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默tmem170b后，能顯著促進(jìn)β-catenin從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中(圖19a)，并能促進(jìn)下游靶點tcf4、cd44、c-myc和cyclind的表達(dá)(圖19b)。

sequencelisting

<110>南京安吉生物科技有限公司

<120>腫瘤標(biāo)志物tmem170b蛋白及其在制備抑制腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用

<160>8

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