本發(fā)明涉及微生物天然產(chǎn)物抗生素分離技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種放線菌jy-22抗真菌成分分離方法及其在復(fù)配劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

放線菌(actinomycesbovis)是一類重要的原核生物，主要呈菌絲狀生長并以孢子繁殖，大部分屬于革蘭氏陽性細菌,能產(chǎn)生大量抗生素，在工、農(nóng)、醫(yī)藥、食品、環(huán)境治理等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。據(jù)統(tǒng)計,從放線菌中發(fā)現(xiàn)的生物活性物質(zhì)已經(jīng)超過13700余種,占已發(fā)現(xiàn)天然活性物質(zhì)的40％以上，目前在醫(yī)、農(nóng)使用的抗生素達150多種，其中2/3來自放線菌，放線菌中鏈霉菌屬(streptomyces)在植物病害防治方面發(fā)揮巨大作用。

從土壤放線菌中研制新的生物農(nóng)藥是一種有效途徑，如井岡霉素，農(nóng)抗120和多種抗生素等9種，臨時登記的有生菌素、寧南霉素，都是開發(fā)成功的案例。近幾十年來，人們只研究和分離了1％-2％的土壤放線菌，對于土壤放線菌尚有較大的研究潛力，特別是放線菌抗真菌成分的研究和分離工藝。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一是提供放線菌jy-22抗真菌成分分離方法，該分離工藝可以得到純的抗菌物質(zhì)。

本發(fā)明通過以下技術(shù)手段解決上述技術(shù)問題：

放線菌jy-22抗真菌成分分離方法，包括如下步驟：

s1：jy-22菌株發(fā)酵液抗真菌成分的初步提取，取菌株jy-22發(fā)酵液離心并收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到濃縮發(fā)酵液，在濃縮發(fā)酵液中加入乙醇并沉降過夜，離心后取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到二次濃縮液，然后用石油醚萃取二次濃縮液，再用正丁醇萃取二次濃縮液，最后收集正丁醇部分旋轉(zhuǎn)蒸干，得到粗提浸膏；在濃縮發(fā)酵液中加入乙醇主要是為了除去發(fā)酵液中蛋白質(zhì)及多糖等部分雜質(zhì)，用石油醚萃取二次濃縮液是為了除去部分脂溶性物質(zhì)，正丁醇可以有效的萃取出活性成分,效果優(yōu)于二氯甲烷、乙酸乙酯。二次濃縮液后，相比一般的直接萃取活性物質(zhì)，本發(fā)明采取先用石油醚萃取除去了極性小的脂溶性雜質(zhì)，可以減少后續(xù)雜質(zhì)的分離難度。

s2：大孔樹脂d101富集活性物質(zhì)，將粗提浸膏用去離子水溶解后上樣于裝有大孔樹脂的玻璃柱，靜置吸附2-3h，依次用2-3倍柱體積的去離子水、濃度為30％-35％的乙醇、濃度為90％-95％的乙醇洗脫，流速控制在2bv/h，收集90-95％乙醇部分，60℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸干后用甲醇溶解得到粗提物a；將粗提物上樣于大孔樹脂吸附要優(yōu)于傳統(tǒng)的用大孔樹脂處理發(fā)酵液，由于發(fā)酵液雜質(zhì)較多，用大孔樹脂直接處理發(fā)酵液，會使得含有活性組分的收集液中雜質(zhì)含量提高，由于發(fā)酵液體積較大，直接吸附洗脫時造成活性物質(zhì)損失相比粗提物吸附洗脫較多。

s3：硅膠柱層析分離純化抗生素jy-22，用適量甲醇溶解粗提物a得到樣品一，然后按照200-300目硅膠與樣品一的質(zhì)量比例為1:1進行混勻伴樣，然后按照硅膠與樣品一的質(zhì)量比例為45：1進行裝柱，再以6-8份體積分數(shù)的甲醇、2-3份體積分數(shù)的氯仿、0.1-0.3份體積分數(shù)的氨水、剩下的以水補齊作為溶媒和流動相，然后用薄層板點板合并相同組分，再用抑菌圈法檢測活性，收集活性組分得到粗提物b；

s4：sephadexlh-20柱層析，用適量甲醇溶解粗提物b得到樣品二，將樣品二緩慢加入裝有聚糖凝膠lh-20的玻璃柱中，再用甲醇洗脫，薄層層析點板合并相同組分，抑菌圈檢測活性，收集活性組分一后用5-6份體積分數(shù)的甲醇、4-5份體積分數(shù)的水的混合液溶解，緩慢加入裝有葡聚糖凝膠lh-20的玻璃柱中，再用5-6份體積分數(shù)的甲醇、4-5份體積分數(shù)的水的混合液洗脫，用薄層層析點板合并相同組分得到粗提物c；

s5：高效液相色譜(hplc)制備分離，對粗提物c進行液相分離，以變化濃度的甲醇與水(0.5％濃氨水)作為流動相，流動相洗脫條件:0-30min70％-80％甲醇，30-40min90％-95％甲醇，c18柱作為固定相，200-400nm檢測，收集各個明顯單峰，抑菌圈檢測活性；

s6：高效液相色譜分析，shimadzulc-20ad型高效液相色譜儀用inertsilc18柱，洗脫劑選擇甲醇和去離子水(0.5％濃氨水)，流動相洗脫條件0-15min80％-85％甲醇，15-25min90％-95％甲醇，檢測波長220nm，進樣量12μl。

進一步，在s3步驟中的薄層板點板分析和抑菌圈法檢測活性中，具體操作方法為：在標記各個斑點后，在超凈工作臺中進行操作，用少量石油醚涂布薄層板后，刮取各個斑點的硅膠，將硅膠置于涂有真菌孢子懸浮液的pda培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)觀察抑菌圈，判斷是否具有活性。硅膠板直接刮取斑點檢測活性，可以快速判斷具有抑菌活性物質(zhì)的基本特性、在活性組分中的位置(rf值)和相對極性大??；由于所述活性物質(zhì)在石油醚中不溶解，則用石油醚涂布薄層硅膠板起到滅菌作用且不會出現(xiàn)斑點擴散移動，避免造成外界接觸過的硅膠板帶入雜菌污染，同時因石油醚易揮發(fā)也不會給試驗帶來誤差，該方法使得活性檢測簡便易行，縮短了整體試驗時間，判斷準確性提高。

進一步，在s2步驟中，大孔樹脂的預(yù)處理方法為：

用90％-95％乙醇浸泡大孔樹脂，不斷攪動使其充分溶脹，除去小的雜質(zhì)及顆粒后裝柱，再用90％-95％乙醇以2bv/h沖柱至流出乙醇不再混濁，之后再用去離子水以2bv/h的流速洗脫至流出液不再有白色且無乙醇味，用1mol/l-1.5mol/l2bv的hcl的溶液以4bv/h左右的流速通過樹脂并浸泡3h，用去離子水洗至流出液ph中性，再同樣用1mol-1.5mol的naoh的處理洗至ph中性。

進一步，在s3步驟中，裝柱前2d將200-300目硅膠按質(zhì)量比加入10％-15％去離子水密封每隔段時間混勻一次，裝柱采用濕法裝柱，采用以6-8份體積分數(shù)的甲醇、2-3份體積分數(shù)的氯仿、0.1-0.3份體積分數(shù)的氨水、剩下的以水補齊作為溶媒，硅膠與樣品比例＝45：1裝柱，待柱子沉降壓實完全后，將樣品均勻鋪在柱床表面，并覆蓋2-3cm厚的硅膠層，并用以6-8份體積分數(shù)的甲醇、2-3份體積分數(shù)的氯仿、0.1-0.3份體積分數(shù)的氨水、剩下的以水補齊作為洗脫劑洗脫，每100ml收集一份，薄層板點板合并相同組分，抑菌圈法檢測活性，確定活性組分。

進一步，s4步驟中，葡聚糖凝膠lh-20在裝柱前用甲醇洗脫充分溶脹，容器中甲醇體積大于凝膠體積，溶脹過程攪拌除去凝膠中的氣泡，避免過分攪拌破壞凝膠粒表面，靜置過夜，溶脹后裝柱，將甲醇與凝膠的混懸液加入100cm×1cm的玻璃柱中，使凝膠沉降均勻完全。

本發(fā)明的目的之二是提供放線菌jy-22抗真菌成分的復(fù)配生物農(nóng)藥，對多種有害真菌具有很好抑制作用。

本發(fā)明通過以下技術(shù)手段解決上述技術(shù)問題：

含有放線菌jy-22抗真菌成分的復(fù)配劑，所述復(fù)配劑按體積分數(shù)計，濃度為3mg/l-4mg/l的吡唑醚菌酯1-2份，濃度為120mg/l-130mg/l的放線菌jy-22粗提浸膏6-7份。該復(fù)配劑對棉花枯萎病菌、小麥紋枯病菌、柑橘青霉、馬鈴薯干腐病菌等多種有害真菌具有很好抑制作用，抑菌譜廣。

本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明提供了一種新的吸水鏈霉菌jy-22抗真菌活性物質(zhì)分離方法，該分離方法簡單、提取率高，為進一步開發(fā)應(yīng)用吸水鏈霉菌jy-22活性成分提供技術(shù)支持；(2)本發(fā)明提供了含有放線菌jy-22抗真菌成分的復(fù)配劑，該復(fù)配劑對棉花枯萎病菌、小麥紋枯病菌、柑橘青霉、馬鈴薯干腐病菌等多種有害真菌具有很好抑制作用，抑菌譜廣。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的工藝流程圖；

圖2是本發(fā)明實施例一中活性組分的硅膠層析tlc結(jié)果；

圖3是本發(fā)明實施例一中活性組分的sephadexlh-20tlc結(jié)果；

圖4是本發(fā)明實施例一中jy-22活性成分的hplc分析圖；

圖5是本發(fā)明實施例一中活性物質(zhì)的hplctlc結(jié)果；

圖6是本發(fā)明實施例二中jy-22粗提物不同溶劑系統(tǒng)的薄層展開效果圖。

具體實施方式

以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明進行詳細說明：

實施例一：

放線菌jy-22抗真菌成分分離方法，包括如下步驟：

s1：jy-22菌株發(fā)酵液抗真菌成分的初步提取：

取菌株jy-22發(fā)酵液，室溫下以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心并收集上清液，在原始ph條件下，在60℃中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮10倍得到濃縮發(fā)酵液，再向濃縮發(fā)酵液中加入95％乙醇，使乙醇含量占70％，再于4℃條件下沉降過夜，室溫下以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心去除沉淀得到上清液，再將剛得到的上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇得到二次濃縮液，然后用石油醚萃取二次濃縮液除去部分脂溶性物質(zhì)，再用正丁醇萃取二次濃縮液，收集正丁醇部分旋轉(zhuǎn)蒸干，得到粗提浸膏；

s2：大孔樹脂d101富集活性物質(zhì)：

首先對大孔樹脂做預(yù)處理，用95％乙醇浸泡大孔樹脂，不斷攪動使其充分溶脹，除去小的雜質(zhì)及顆粒后裝柱，再用95％乙醇以2bv/h的流速沖柱至流出乙醇不再混濁，之后再用去離子水以2bv/h的流速洗脫至流出液不再有白色且無乙醇味，用1mol/l2bv的hcl的溶液以4bv/h的流速通過樹脂并浸泡3h，用去離子水洗至流出液ph中性，再同樣用1mol的naoh的處理洗至ph中性。上述處理后的大孔樹脂用柱長60cm直徑4cm的玻璃柱，濕法裝柱，用去離子水平衡；

然后進行上樣與洗脫：將粗提浸膏用15ml去離子水溶解上樣，上樣時應(yīng)保持柱床表面平穩(wěn)，加樣完畢后關(guān)閉旋塞，靜置吸附2h，之后依次用2bv體積的去離子水、30％濃度的乙醇、95％濃度的乙醇洗脫，流速控制在2bv/h，除去去離子水洗脫部分與30％乙醇，收集95％乙醇部分，在60℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸干后用甲醇溶解得到粗提物a，并于4℃下保存；

s3：硅膠柱層析分離純化抗生素，用適量甲醇溶解粗提物a得到樣品一，然后按照200-300目硅膠與樣品一的質(zhì)量比例為1:1進行混勻伴樣，裝柱前2d將200-300目硅膠按質(zhì)量比加入15％去離子水密封每隔段時間混勻一次，揮干至無甲醇氣味后進行裝柱；

采用濕法裝柱，采用甲醇：氯仿：氨水：水＝8：2：0.2：水飽和作為溶媒，硅膠與樣品比例＝45：1進行裝柱，待柱子沉降壓實完全后，將樣品均勻鋪在柱床表面，并覆蓋2-3cm厚的硅膠層，再以甲醇：氯仿：氨水：水＝8：2：0.2：水飽和作為洗脫劑洗脫，100ml收集一份用薄層板點板合并相同組分(活性組分的硅膠層析tlc結(jié)果見圖2)，再用抑菌圈法檢測活性，具體操作方法為：在標記各個斑點后，在超凈工作臺中進行操作，用少量石油醚涂布薄層板后，刮取各個斑點的硅膠，將硅膠置于涂有真菌孢子懸浮液的pda培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)觀察抑菌圈，收集活性組分得到粗提物b；

s4：sephadexlh-20柱層析：

sephadexlh-20在裝柱前用甲醇洗脫充分溶脹，容器中甲醇體積大于凝膠體積，溶脹過程攪拌除去凝膠中的氣泡，避免過分攪拌破壞凝膠粒表面，靜置過夜，溶脹后將甲醇與凝膠的混懸液加入100cm×1cm的玻璃柱中，使凝膠沉降均勻完全；

用適量甲醇溶解粗提物b得到樣品二，將樣品二緩慢加入裝有sephadexlh-20的玻璃柱中，再用甲醇洗脫，流速6滴/min，每3ml收集一份，薄層層析點板合并相同組分，抑菌圈檢測活性，收集活性組分一后用甲醇：水＝6：4的混合液溶解，緩慢加入裝有葡聚糖凝膠lh-20的玻璃柱中，再用甲醇：水＝6：4的混合液洗脫，流速6滴/min，每1ml收集一份，用薄層層析點板合并相同組分得到粗提物c(活性組分的sephadexlh-20tlc結(jié)果見圖3)；

s5：高效液相色譜(hplc)制備分離，對粗提物c進行液相分離，以變化濃度的甲醇與水(0.5％濃氨水)作為流動相，流動相洗脫條件:0-30min75％甲醇，30-40min95％甲醇，c18柱作為固定相，220nm檢測，收集各個明顯單峰，抑菌圈檢測活性，得到抗真菌成分(jy-22活性成分的hplc分析圖見圖4)；

s6：高效液相色譜分析，對s5步驟中的活性峰進行分析高效液相檢測，shimadzulc-20ad型高效液相色譜儀用inertsilc18柱，洗脫劑選擇甲醇和去離子水(0.5％濃氨水)，流動相洗脫條件0-15min85％甲醇，15-25min95％甲醇。檢測波長220nm，進樣量12μl(活性物質(zhì)的hplctlc結(jié)果見圖5)。

在實施例一中，s1步驟獲得活性粗提浸膏中，分別對乙醇沉淀、石油醚提取液、正丁醇提取液及水相進行生物測定，具體操作方法為：通過在pda培養(yǎng)皿中央接種煙草赤星病菌，采用牛津杯碟法測定乙醇沉淀、石油醚提取液、正丁醇粗提浸膏及水相的抑菌活性，取上述去離子水溶解液各150μl加入牛津杯，7d后測抑菌半徑。檢測結(jié)果表明：從表一中可以看出，正丁醇部分抑菌圈半徑最大為:2.1cm，可見乙醇沉淀能夠有效除去發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)多糖等部分雜質(zhì)，保留活性組分，同時沉淀也表現(xiàn)出一定的抑菌性，可能由于在乙醇沉淀的時難免由于蛋白質(zhì)多糖沉淀吸附包裹部分活性組分，由此可以認為抑菌物質(zhì)的活性組分還是主要存在于正丁醇的粗提物中。

表一提取液和沉淀的抑菌活性

實施例二：

s1：操作同實施例一中的s1步驟；

s2：大孔樹脂d101富集活性物質(zhì)：首先對大孔樹脂做預(yù)處理，處理方法采用實施例一中s2步驟中的預(yù)處理方法，上述處理后進行上樣與洗脫，將粗提浸膏用15ml去離子水溶解上樣，上樣時應(yīng)保持柱床表面平穩(wěn)，加樣完畢后關(guān)閉旋塞，靜置吸附2h，之后依次用2bv體積的去離子水、30％濃度的乙醇、50％濃度的乙醇、70％濃度的乙醇、95％濃度的乙醇、丙酮洗脫，流速控制在2bv/h，每個梯度收集樣品并進行生物活性檢測。

由表二可以看出，隨著乙醇體積百分比增加抑菌圈增大，在乙醇體積達到70％時，洗脫圈直徑最大，95％乙醇抑菌圈直徑下降，0％及30％乙醇和丙酮抑菌圈為0；由此可以得出：在乙醇濃度為95％時能夠?qū)⒋罂讟渲琩101吸附的活性成分洗脫完全，達到最好洗脫效果，因此，將洗脫劑條件確定為：去離子水，濃度為30％的乙醇，濃度為95％的乙醇，每個濃度2bv體積，流速2bv/h洗脫，收集95％乙醇部分，旋轉(zhuǎn)蒸干。

表二不同體積分數(shù)乙醇洗脫液的抑菌圈直徑

實施例三：

s1：操作同實施例一中的s1步驟；

s2：操作同實施例一中的s2步驟；

s3：采用薄層層析(tlc)分析方法，用毛細管點樣粗提物a，點樣斑點直徑小于4mm，將樣品用展開劑在層析缸中上行展開，用碘顯色和紫外觀察判斷展開情況，其中展開劑系統(tǒng)的最優(yōu)選擇為甲醇：氯仿：氨水：水＝8.5：1.5：0.2：飽和，選擇展開效果相對較好的薄層板，在超凈工作臺中，用少量石油醚涂布薄層板后，刮取各個斑點的硅膠，將硅膠置于涂有真菌孢子懸浮液的pda培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)觀察抑菌圈，判斷是否具有活性,確定活性區(qū)域rf值。

通過薄層層析能夠進行硅膠柱層析之前預(yù)先判斷。本發(fā)明對多種展開劑系統(tǒng)進行試驗，由表三和圖6可見，當甲醇：氯仿：氨水：水＝8.5：1.5：0.2：飽和作為展開劑時，展開效果較為均勻，將薄層板硅膠層刮取，抑菌圈法檢測活性，顯示有活性組分的區(qū)域rf值在0.3左右，圖6中紅色小框區(qū)域，滿足硅膠柱層析條件，為最佳展開系統(tǒng)進行硅膠柱層析進行分離化合物的代謝產(chǎn)物。

表三不同溶劑系統(tǒng)的薄層展開結(jié)果

實施例四：

含有放線菌jy-22抗真菌成分的復(fù)配劑，所述復(fù)配劑最佳復(fù)配比為，濃度為4mg/l的吡唑醚菌酯2ml，濃度為125mg/l的放線菌jy-22粗提浸膏6ml。

從表四中可見，濃度為125mg/l的jy-22正丁醇粗提浸膏濃度、濃度為4mg/l的吡唑醚菌酯對煙草赤星病菌均有較佳的生長抑制效果。

表四兩種不同藥劑對煙草赤星病的室內(nèi)試驗結(jié)果

將125mg/l的jy-22正丁醇粗提物與4mg/l的吡唑醚菌酯25％乳油，以不同體積進行復(fù)配，聯(lián)合毒力測定結(jié)果見表五。數(shù)據(jù)顯示將v(吡唑醚菌酯)：v(jy-22正丁醇粗提物)＝1：6作為最佳復(fù)配比。

表五不同藥劑混配對煙草赤星病菌毒力回歸方程

以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當中。本發(fā)明未詳細描述的技術(shù)、形狀、構(gòu)造部分均為公知技術(shù)。