本發(fā)明涉及免疫化學(xué)分析領(lǐng)域，主要涉及一種用于睪酮?dú)埩魴z測(cè)的試劑盒及其制備方法和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：睪酮又稱睪丸素、睪丸酮或睪甾酮，是一種天然存在的雄性激素，屬于類固醇激素，不僅對(duì)人體第二性征的形成有重要的促進(jìn)作用，還影響著蛋白質(zhì)的合成以及人體機(jī)能等諸多方面。由于睪酮具有促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)沉積和改善生產(chǎn)的作用，因此在畜牧業(yè)上被用作動(dòng)物飼料添加劑，用以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量。養(yǎng)殖場(chǎng)使用睪酮激素后，可以增產(chǎn)增收，提高經(jīng)濟(jì)效益。然而，養(yǎng)殖戶的不合理使用導(dǎo)致長(zhǎng)期攝入殘留在動(dòng)物體內(nèi)的睪酮類激素的消費(fèi)者出現(xiàn)內(nèi)分泌紊亂、性早熟等問題，并大大增加了致癌、致畸、致突變的風(fēng)險(xiǎn)。自1986年來，歐盟委員會(huì)就已禁止以促進(jìn)生長(zhǎng)為目的在肉食性動(dòng)物養(yǎng)殖中使用天然或人工合成的激素。我國(guó)農(nóng)業(yè)部在2003年(265)號(hào)公告中明文規(guī)定，不得使用不符合《獸藥標(biāo)簽和說明書管理辦法》規(guī)定的獸藥產(chǎn)品，不得使用《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其他化合物清單》所列21類藥物及未經(jīng)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)的獸藥，不得使用進(jìn)口國(guó)明令禁用的獸藥，畜禽產(chǎn)品中不得檢出禁用藥物。但事實(shí)上，養(yǎng)殖戶為了追求經(jīng)濟(jì)效益，將禁用藥物當(dāng)作添加劑使用的現(xiàn)象仍然相當(dāng)普遍。睪酮及睪酮類物質(zhì)均有很強(qiáng)的毒副作用，因此不能因其能提高產(chǎn)量從而增加收益而將其應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖，養(yǎng)殖戶應(yīng)嚴(yán)格遵守相關(guān)規(guī)定，嚴(yán)禁在肉食性動(dòng)物養(yǎng)殖中加入睪酮及睪酮類物質(zhì)。在畜牧業(yè)上常被用作動(dòng)物飼料添加劑以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量。睪酮的毒副作用很強(qiáng)，農(nóng)業(yè)部2002年235號(hào)將其列為不得檢出項(xiàng)目。目前檢驗(yàn)睪酮的常用方法有常規(guī)儀器分析法和免疫學(xué)檢測(cè)法。常規(guī)儀器分析法雖然在檢測(cè)睪酮及同類物質(zhì)方面具有較寬的線性范圍，但耗費(fèi)高，對(duì)實(shí)驗(yàn)者和實(shí)驗(yàn)條件的要求苛刻，前處理費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此難以推廣，不適于大量樣品的檢測(cè)。而免疫學(xué)檢測(cè)法相比常規(guī)儀器分析法具有操作簡(jiǎn)便及快速靈敏的優(yōu)點(diǎn)，因此應(yīng)用更為廣泛，而酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)是其中應(yīng)用最多的一種新型檢測(cè)技術(shù)。但目前國(guó)內(nèi)尚未見有關(guān)睪酮?dú)埩裘嘎?lián)免疫吸附分析技術(shù)的專利和文獻(xiàn)報(bào)道?，F(xiàn)有王艷輝等用固相萃?。咝б合嗌V法來測(cè)定睪酮含量的方法：樣品用甲醇提取，乙腈萃取，正己烷脫脂，c18柱固相萃取凈化后，經(jīng)hypersilodsc18(4.6mm×250mm,5μm)柱進(jìn)行分離，紫外檢測(cè)器測(cè)定，流動(dòng)相為甲醇：水＝55:45(v/v)。其缺點(diǎn)是樣品處理復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，對(duì)實(shí)驗(yàn)者操作儀器的要求較高，最低檢出限較大，檢出范圍較小。最關(guān)鍵的是，不能滿足目前食品安全檢測(cè)的快速篩查要求。現(xiàn)有袁宗輝等發(fā)明的能用于檢測(cè)甲睪酮的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法與試劑盒，其單克隆抗體是由保藏號(hào)為cctccno:c201493的雜交瘤細(xì)胞株mt9c10所分泌的。其缺點(diǎn)是只能檢測(cè)甲睪酮，不能檢測(cè)睪酮?，F(xiàn)有袁宗輝等發(fā)明的能用于檢測(cè)雄激素類藥物的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法與試劑盒，其單克隆抗體是由保藏號(hào)為cctccno:c201494的雜交瘤細(xì)胞株nt4d12所分泌的，可同時(shí)檢測(cè)諾龍、甲睪酮、睪酮、群勃龍四種雄激素類藥物。其缺點(diǎn)是會(huì)同時(shí)檢測(cè)出諾龍、甲睪酮、睪酮、群勃龍四種雄激素類藥物的總濃度，而不能對(duì)睪酮進(jìn)行單獨(dú)檢測(cè)，從而無法確定睪酮的濃度。因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于睪酮?dú)埩魴z測(cè)的試劑盒及其制備方法和檢測(cè)方法，采用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa法，定性或定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中睪酮?dú)埩?，旨在解決現(xiàn)有檢測(cè)方法和試劑盒無法準(zhǔn)確檢測(cè)出睪酮的殘留量的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種用于睪酮?dú)埩魴z測(cè)的試劑盒，其中，包括盒體，以及放置在盒體內(nèi)的固相載體、試劑和說明書，其中，在固相載體上包被有肟化產(chǎn)物與牛血清白蛋白相偶聯(lián)得到的完全抗原；所述試劑包括睪酮特異性單克隆抗體、辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗鼠抗體、濃縮洗滌液、睪酮系列標(biāo)準(zhǔn)溶液、顯色液、終止液；所述顯色液為3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液為硫酸溶液；所述濃縮洗滌液為含有吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。所述用于睪酮?dú)埩魴z測(cè)的試劑盒，其中，還包括甲醇-pbs溶液、叔丁基甲醚。一種如上所述的用于睪酮?dú)埩魴z測(cè)的試劑盒的制備方法，其中，包括以下步驟：(1)將睪酮肟化得到肟化產(chǎn)物；(2)將肟化產(chǎn)物與牛血清白蛋白相偶聯(lián)得到完全抗原；(3)用步驟(2)的完全抗原免疫小鼠得到睪酮特異性單克隆抗體；(4)用步驟(2)的完全抗原包被固相載體。所述的用于睪酮?dú)埩魴z測(cè)的試劑盒的制備方法，其中，步驟(1)具體包括以下步驟：將睪酮溶于無水吡啶，加入羧甲基羥胺半鹽酸鹽，置烘箱40-60℃下反應(yīng)3～4h，期間震蕩數(shù)次；反應(yīng)結(jié)束后真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除吡啶，用乙酸乙酯溶解殘余物，并加水洗數(shù)次；取上層油樣物，加入少量無水硫酸鈉干燥，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙酸乙酯，殘余物用乙醚重結(jié)晶；將肟化產(chǎn)物溶于甲醇中，經(jīng)過薄層層析純化，收集相應(yīng)rf條帶，溶解于甲醇，進(jìn)行抽濾，最后真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到純化產(chǎn)物；其中，睪酮與羧甲基羥胺半鹽酸鹽的摩爾比為1:1.5～2.5。所述的用于睪酮?dú)埩魴z測(cè)的試劑盒的制備方法，其中，步驟(2)采用碳二亞胺法進(jìn)行制備，具體包括以下步驟：a液：取純化后的t-cma、edc-hcl、nhs，加入dmf中，室溫下避光震蕩0.5～1.5h；b液：取bsa溶于含20％dmf的pbs緩沖液中，4℃下預(yù)冷；混合：一邊攪拌一邊將a液逐滴加入到b液中，4℃下反應(yīng)3-6h；反應(yīng)結(jié)束后，先用含20％dmf的pbs緩沖液透析反應(yīng)液，并逐漸降低dmf的含量，用蒸餾水透析1d，冷凍干燥保存即可；其中，a液中，t-cma、edc-hcl、nhs的質(zhì)量比例為4:2:1。b液中，bsa的濃度范圍為1～2％。所述的用于睪酮?dú)埩魴z測(cè)的試劑盒的制備方法，其中，步驟(4)具體包括以下步驟：用包被稀釋液稀釋t-bsa抗原，包被固相載體，置4℃下過夜，次日取出固相載體，恢復(fù)至室溫后傾去包被液，用pbst洗固相載體后拍干，每孔加入封閉液，37℃下封閉1h；取出固相載體，恢復(fù)至室溫后傾去封閉液，洗固相載體后拍干；其中，所述封閉液為牛血清白蛋白溶液，包被稀釋液為碳酸鹽緩沖液。一種采用如上所述的用于睪酮?dú)埩魴z測(cè)的試劑盒的檢測(cè)方法，其中，包括以下步驟：(a1)將所述的樣品經(jīng)過有機(jī)溶劑提取，離心和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理，再用混合溶劑溶解，得到待測(cè)產(chǎn)物；(a2)將步驟(a1)的待測(cè)產(chǎn)物采用上述試劑盒進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)。所述的檢測(cè)方法，其中，步驟(a1)具體包括以下步驟：取肉源組織均勻物，加入6ml乙腈溶液，充分振蕩2min；振蕩完畢在4000r/min以上，15℃條件下離心10min，取上清液4ml，在56℃條件下氮?dú)饬鞔抵镣耆稍铮蝗羧庠唇M織為豬肉，則在干燥后的固體物中加入1ml甲醇-pbs溶液混合振蕩30s，取50μl用于分析；若肉源組織為豬肝，則先加入2ml正己烷充分振蕩溶解，然后加入1ml去離子水混合振蕩30s，振蕩完畢在4000r/min以上，15℃條件下離心5min，去除上層液相；取50μl下層液相與50μl甲醇-pbs溶液混勻；取50μl用于分析。所述的檢測(cè)方法，其中，步驟(a2)具體可以包括以下步驟：s1、工作液配制：洗滌液：將濃縮洗滌液用去離子水稀釋，配制洗滌液；甲醇-pbs溶液：取甲醇與0.01mpbs混合可得20ml/l的甲醇-pbs溶液；s2、測(cè)定步驟：編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置；加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔，再加入抗體工作液50μl/孔；用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中反應(yīng)30min；揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液250μl/孔充分洗滌4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干；顯色：每孔加入100μltmb顯色液，輕輕振蕩混勻25℃環(huán)境避光顯色15min；測(cè)定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處或雙波長(zhǎng)450/630nm處測(cè)定每孔o(hù)d值。有益效果：本發(fā)明的用于睪酮?dú)埩魴z測(cè)的試劑盒及其制備方法和檢測(cè)方法，采用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa法，定性或定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中睪酮?dú)埩簟Ｆ洳捎酶咛禺愋缘牟G酮單克隆抗體，具有高特異性，高靈敏度，高精確度，高準(zhǔn)確度等特點(diǎn)，檢測(cè)范圍寬，假陽(yáng)性率低，檢測(cè)結(jié)果可靠準(zhǔn)確，組織最低檢測(cè)限為0.4μg/kg，適用于動(dòng)物源性食品中睪酮?dú)埩魴z測(cè)；可以在較短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大量樣品，排除大量陰性樣品。由于樣品處理簡(jiǎn)便易行，檢測(cè)又無需昂貴的儀器設(shè)備，因此比較適合在基層檢驗(yàn)檢疫單位推廣使用?？捎糜趧?dòng)物源性食品中睪酮?dú)埩袅康拿嘎?lián)免疫檢測(cè)，與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明的方法和試劑盒具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)快速，使用簡(jiǎn)便和檢測(cè)成本低廉等突出優(yōu)點(diǎn)。附圖說明圖1是本發(fā)明完全抗原紫外圖譜。圖2是本發(fā)明完全抗原sds-page電泳圖。圖3是本發(fā)明睪酮抗體與睪酮標(biāo)準(zhǔn)品的間接競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)曲線。圖4是本發(fā)明建立的酶聯(lián)免疫方法的重復(fù)度結(jié)果。圖5是本發(fā)明建立的酶聯(lián)免疫方法的精密度結(jié)果。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供一種用于睪酮?dú)埩魴z測(cè)的試劑盒及其制備方法和檢測(cè)方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明所提供一種用于睪酮?dú)埩魴z測(cè)的試劑盒，包括盒體，以及放置在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板、試劑和說明書，其中，在酶標(biāo)板的微孔內(nèi)包被有肟化產(chǎn)物與牛血清白蛋白相偶聯(lián)得到的完全抗原；所述試劑包括睪酮特異性單克隆抗體、辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗鼠抗體、濃縮洗滌液、睪酮系列標(biāo)準(zhǔn)溶液、顯色液、終止液。其中，所述顯色液為3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺，其配置過程可以包括以下步驟:①底物a液：na2hpo4·12h2o9g，檸檬酸4g，edta0.2g，過氧化氫脲1.5g，五水硫代硫酸鈉5g，加蒸餾水至1000ml；②底物b液：檸檬酸4g，甘露醇5g，五水硫代硫酸鈉5g，tmb0.6g(10mldmf溶解)，加蒸餾水至1000ml；③使用時(shí)將底物a液和底物b液按1:1混合即可。所述終止液為硫酸溶液，其配置過程可以為：18mol/l濃硫酸100ml，緩慢滴加到蒸餾水至900ml。所述濃縮洗滌液為含有0.05％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，其配置過程可以為：nacl80g，kh2po42g，na2hpo4·12h2o29g，kcl2g，tween-205ml，加蒸餾水至1000ml，調(diào)至ph7.4。所述用于睪酮?dú)埩魴z測(cè)的試劑盒，還可以包括甲醇-pbs溶液、叔丁基甲醚；所述甲醇-pbs溶液、叔丁基甲醚用于處理待檢測(cè)物質(zhì)。本發(fā)明所提供的試劑盒以及酶聯(lián)免疫方法是采用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa法，定性或定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中睪酮?dú)埩?。其采用高特異性的睪酮單克隆抗體，具有高特異性，高靈敏度，高精確度，高準(zhǔn)確度等特點(diǎn)，檢測(cè)范圍寬，假陽(yáng)性率低，檢測(cè)結(jié)果可靠準(zhǔn)確，組織最低檢測(cè)限為0.4μg/kg，適用于動(dòng)物源性食品中睪酮?dú)埩魴z測(cè)；可以在較短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大量樣品，排除大量陰性樣品。由于樣品處理簡(jiǎn)便易行，檢測(cè)又無需昂貴的儀器設(shè)備，因此比較適合在基層檢驗(yàn)檢疫單位推廣使用。本發(fā)明中還提供所述試劑盒的制備方法，包括完全抗原和單克隆抗體的制備，包括以下步驟：(1)將睪酮肟化得到肟化產(chǎn)物；(2)將肟化產(chǎn)物與牛血清白蛋白相偶聯(lián)得到完全抗原；(3)用步驟(2)的完全抗原免疫小鼠得到特異性單克隆抗體；(4)用步驟(2)的完全抗原包被固相載體。所述固相載體是酶標(biāo)板，如可采用48或96孔酶標(biāo)板作固相載體。步驟(1)具體包括以下步驟：將睪酮溶于無水吡啶，加入羧甲基羥胺半鹽酸鹽，置烘箱40～60℃下反應(yīng)3～4h，期間需震蕩數(shù)次。反應(yīng)結(jié)束后真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除吡啶，用50～100ml乙酸乙酯溶解殘余物，并加適量水洗3～4次。取上層油樣物，加入少量無水硫酸鈉干燥，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙酸乙酯，殘余物用乙醚重結(jié)晶。將肟化產(chǎn)物(t-cma)溶于甲醇中，經(jīng)過薄層層析純化，收集rf約為0.1的條帶，溶解于甲醇，進(jìn)行抽濾，最后真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到純化產(chǎn)物。其中，睪酮與羧甲基羥胺半鹽酸鹽的摩爾比為1:1.5～2.5。步驟(2)采用碳二亞胺法進(jìn)行制備，具體包括以下步驟：a液：取純化后的t-cma、edc-hcl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)、nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)，加入dmf(二甲基甲酰胺)中，室溫下避光震蕩0.5～1.5h。b液：取bsa溶于含20％dmf的pbs緩沖液中，4℃下預(yù)冷。混合：一邊攪拌一邊將a液逐滴加入到b液中，4℃下反應(yīng)3～6h。反應(yīng)結(jié)束后，先用含20％dmf的pbs緩沖液透析反應(yīng)液，并逐漸降低dmf的含量，最后用蒸餾水透析1d，冷凍干燥保存即可。其中，a液中，在本實(shí)施例方案中采用t-cma、edc-hcl和nhs的質(zhì)量比為4:2:1。b液中，bsa的濃度范圍為1～2％。步驟(3)具體包括以下步驟：a、動(dòng)物的免疫：選用健康的6～8周齡的balb/c小鼠，以t-bsa為免疫抗原，第1次基礎(chǔ)免疫使用弗氏完全佐劑充分乳化，加強(qiáng)免疫以后改用不完全佐劑乳化。注射方式采用皮下多點(diǎn)注射，每只小鼠每次的免疫劑量為100μg。免疫前1周于尾靜脈采血留作陰性對(duì)照。第4次免疫后7d于尾靜脈采血用于制備血清，用采集的陽(yáng)性血清來建立直接elisa法，并進(jìn)行血清效價(jià)測(cè)定。第4次免疫后15d加強(qiáng)免疫，不再用免疫佐劑，劑量仍為100μg，于腹腔注射。b、雜交瘤細(xì)胞的制備:采用peg法將小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0細(xì)胞和免疫后小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，通過間接elisa法篩選融合后的雜交瘤細(xì)胞上清。陽(yáng)性微孔中的細(xì)胞通過有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆，以建立細(xì)胞株，通過傳代判定其穩(wěn)定性。c、單克隆抗體的制備純化選用健康的6～8周齡的balb/c小鼠，于腹腔處注射滅菌石蠟，10d后再于腹腔注射正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的制備的能穩(wěn)定分泌睪酮單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。7d后采集腹水，離心機(jī)12000r/min離心15min，棄去沉淀，采集上清液a。采用辛酸-硫酸銨法從采集的小鼠腹水中提純單克隆抗體，具體步驟：取適量上清液a，加入0.06mol/lph4.8的醋酸緩沖液，稀釋至2倍；按33μl/ml原始腹水的比例，30min內(nèi)一邊攪拌一邊逐滴加入正辛酸，4℃下靜置2h，再12000r/min離心20min，取上清液b并用濾紙過濾；加入1/10上清液b體積的0.1mol/lph7.4的pbs緩沖液，并用1mol/lnaoh調(diào)ph至7.4得上清液c；上清液c在4℃冰浴條件下，30min內(nèi)一邊攪拌一邊按277g/l的比例加入硫酸銨粉末，4℃下靜置至少2h；靜置后在4℃條件下12000r/min離心30min，棄去上清液，采集沉淀，溶于一定體積的pbs緩沖液，并于4℃條件下置于50～100倍的pbs緩沖液中進(jìn)行透析除鹽，時(shí)間為2～3d，期間每天都需更換3次透析袋。透析完畢后分裝，凍存于-20℃下備用。步驟(4)具體包括以下步驟：用包被稀釋液(0.05m碳酸鹽緩沖液，ph9.6)稀釋至最佳包被濃度115ng/ml的t-bsa抗原包被96孔可拆卸酶標(biāo)板，置4℃下過夜，次日取出酶標(biāo)板，恢復(fù)至室溫后傾去包被液，用pbst洗板3次(每次3min，后續(xù)洗滌程序相同)后在吸水紙上拍干，每孔加入200μl封閉液，37℃下封閉1h；取出酶標(biāo)板，恢復(fù)至室溫后傾去封閉液，洗板5次后拍干，組裝成試劑盒。其中，所述封閉液為牛血清白蛋白溶液，其配置過程可以為：10gbsa溶于1000mlpbst即可。本發(fā)明中還提供采用上述試劑盒檢測(cè)睪酮?dú)埩舻臋z測(cè)方法，包括以下方法：(a1)將所述的樣品經(jīng)過有機(jī)溶劑提取，離心和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理，再用混合溶劑溶解，得到待測(cè)產(chǎn)物；(a2)將步驟(a1)的待測(cè)產(chǎn)物采用上述試劑盒進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)。其中，所述有機(jī)溶劑是叔丁基甲醚；所述混合溶劑是甲醇－pbs溶液。步驟(a1)的處理方法具體可以包括以下步驟：取2±0.05g組織(豬肉、豬肝)均勻物，加入6ml乙腈溶液，充分振蕩2min。振蕩完畢在4000r/min以上，15℃條件下離心10min，取上清液4ml，在56℃條件下氮?dú)饬鞔抵镣耆稍?。干燥后的固體物根據(jù)組織不同有以下不同處理方法：豬肉樣本：加入1ml甲醇-pbs溶液混合振蕩30s，取50μl用于分析。豬肝樣本：先加入2ml正己烷充分振蕩溶解，然后加入1ml去離子水混合振蕩30s，振蕩完畢在4000r/min以上，15℃條件下離心5min，去除上層液相；取50μl下層液相與50μl甲醇-pbs溶液混勻；取50μl用于分析。步驟(a1)的處理方法還可以采用其他方法處理，具體可以包括以下步驟：稱取均勻后的組織樣本5g(精確至0.01g)置于50ml離心管中，加入5ml去離子水，20ml叔丁基甲醚，渦旋混勻器混勻1min，超聲波發(fā)生器中超聲波提取10min，之后8000r/min離心5min，取上層有機(jī)相于另一只50ml離心管；下層用20ml叔丁基甲醚分2次提取，合并有機(jī)相；將有機(jī)相40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，加甲醇-pbs溶液定容至10ml。取50μl用于分析。步驟(a2)具體可以包括以下步驟：s1、工作液配制：洗滌液：將濃縮洗滌液(20倍濃縮)用去離子水按照1:19稀釋(1份濃縮洗滌液+19份去離子水)，或按所需用量配制洗滌液。甲醇-pbs溶液：取甲醇與0.01mpbs混合可得20ml/l的甲醇-pbs溶液。s2、測(cè)定步驟：將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20-25℃)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃不要冷凍；編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置；加睪酮系列標(biāo)準(zhǔn)溶液/樣本50μl/孔到各自的微孔中，然后加辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗鼠抗體50μl/孔，再加入睪酮特異性單克隆抗體50μl/孔；用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中反應(yīng)30min；小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液250μl/孔充分洗滌4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干(拍干后未被消除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)；顯色：每孔加入100μltmb顯色液，輕輕振蕩混勻25℃環(huán)境避光顯色15min；測(cè)定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長(zhǎng)450/630nm，檢測(cè)在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))測(cè)定每孔o(hù)d值。以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。1.完全抗原的制備1.1標(biāo)準(zhǔn)品與試劑睪酮等標(biāo)準(zhǔn)品和生化試劑，均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備分析天平(sartoriusbs110s)，德國(guó)sartorius公司；微量加樣器，美國(guó)thermo公司；酸度計(jì)(hannaph211型)，意大利hanna公司；漩渦振蕩器(gl-8813型)，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；低溫冷凍大容量離心機(jī)(ankedl-4000b型)，上海安亭科學(xué)儀器廠；超低溫冰箱(sanyoultralowfreezer)，日本sanyo公司；酶標(biāo)儀(thermoscientificmultiskanfc)，美國(guó)thermo公司。1.3睪酮的肟化稱取289mg(約1mmol)睪酮溶于10ml無水吡啶，然后再加入219mg(約2mmol)羧甲基羥胺半鹽酸鹽，置烘箱50℃下反應(yīng)3～4h，期間需震蕩數(shù)次。反應(yīng)結(jié)束后真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除吡啶，用50～100ml乙酸乙酯溶解殘余物，并加適量水洗3～4次。取上層油樣物，加入少量無水硫酸鈉干燥，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙酸乙酯，殘余物用乙醚重結(jié)晶。將肟化產(chǎn)物(t-cma)溶于甲醇中，經(jīng)過薄層層析純化，收集rf約為0.1的條帶，溶解于甲醇，進(jìn)行抽濾，最后真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到純化產(chǎn)物。1.4t-bsa完全抗原的制備采用碳二亞胺法進(jìn)行制備。a液：取純化后的t-cma7mg、edc-hcl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)3.5mg、nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)4.4mg，加入500μldmf(二甲基甲酰胺)中，室溫下避光震蕩1h。b液：取bsa(牛血清白蛋白)20mg溶于4.5ml含20％dmf的pbs緩沖液中，4℃下預(yù)冷。一邊攪拌一邊將a液逐滴加入到b液中，4℃下反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后，先用含20％dmf的pbs緩沖液透析反應(yīng)液，并逐漸降低dmf的含量，最后用蒸餾水透析1d，冷凍干燥保存即可。所得完全抗原的紫外圖譜如圖1所示，通過圖1可得t的最大吸收波長(zhǎng)是317nm，bsa的最大吸收波長(zhǎng)是278nm，t-bsa的最大吸收波長(zhǎng)是249nm。相比可知免疫原在經(jīng)過偶聯(lián)后，其最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生藍(lán)移現(xiàn)象，可初步證明t與bsa偶聯(lián)成功，結(jié)合比為1:11。sds-page電泳圖如圖2所示，由圖可得bsa的條帶相比t-bsa的條帶較深且寬，向下移動(dòng)的距離稍遠(yuǎn)，表明t-bsa的遷移速率比bsa的遷移速率小，偶聯(lián)后免疫原的分子質(zhì)量比載體bsa的分子質(zhì)量大，證明偶聯(lián)抗原制備成功。2.單克隆抗體的制備2.1動(dòng)物的免疫選用健康的6～8周齡的balb/c小鼠，以t-bsa為免疫抗原，第1次基礎(chǔ)免疫使用弗氏完全佐劑充分乳化，加強(qiáng)免疫以后改用不完全佐劑乳化。注射方式采用皮下多點(diǎn)注射，每只小鼠每次的免疫劑量為100μg。免疫前1周于尾靜脈采血留作陰性對(duì)照。第4次免疫后7d于尾靜脈采血用于制備血清，用采集的陽(yáng)性血清來建立直接elisa法，并進(jìn)行血清效價(jià)測(cè)定。第4次免疫后15d加強(qiáng)免疫，不再用免疫佐劑，劑量仍為100μg，于腹腔注射。2.2雜交瘤細(xì)胞的制備采用peg法將小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0細(xì)胞和免疫后小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，通過間接elisa法篩選融合后的雜交瘤細(xì)胞上清。陽(yáng)性微孔中的細(xì)胞通過有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆，以建立細(xì)胞株，通過傳代判定其穩(wěn)定性。2.3單克隆抗體的制備純化選用健康的6～8周齡的balb/c小鼠，于腹腔處注射滅菌石蠟，10d后再于腹腔注射正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的制備的能穩(wěn)定分泌睪酮單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。7d后采集腹水，離心機(jī)12000r/min離心15min，棄去沉淀，采集上清液a。采用辛酸-硫酸銨法從采集的小鼠腹水中提純單克隆抗體，具體步驟：取適量上清液a，加入0.06mol/lph4.8的醋酸緩沖液，稀釋至2倍；按33μl/ml原始腹水的比例，30min內(nèi)一邊攪拌一邊逐滴加入正辛酸，4℃下靜置2h，再12000r/min離心20min，取上清液b并用濾紙過濾；加入1/10上清液b體積的0.1mol/lph7.4的pbs緩沖液，并用1mol/lnaoh調(diào)ph至7.4得上清液c；上清液c在4℃冰浴條件下，30min內(nèi)一邊攪拌一邊按277g/l的比例加入硫酸銨粉末，4℃下靜置至少2h；靜置后在4℃條件下12000r/min離心30min，棄去上清液，采集沉淀，溶于一定體積的pbs緩沖液，并于4℃條件下置于50～100倍的pbs緩沖液中進(jìn)行透析除鹽，時(shí)間為2～3d，期間每天都需更換3次透析袋。透析完畢后分裝，凍存于-20℃下備用。2.4抗體質(zhì)量評(píng)價(jià)抗體的效價(jià)：采用直接elisa法進(jìn)行測(cè)定，以od值為1.0左右的抗體稀釋倍數(shù)為陽(yáng)性。結(jié)果抗體效價(jià)為1:6.4×105?？贵w的靈敏度：采用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa法進(jìn)行測(cè)定，以抗體的ic50(抑制率為50％所對(duì)應(yīng)的藥物濃度)來判定抗體的靈敏度。t-bsa完全抗原的競(jìng)爭(zhēng)藥物是睪酮標(biāo)準(zhǔn)品，將t稀釋成0ng/ml、0.1024ng/ml、0.256ng/ml、0.64ng/ml、1.6ng/ml、4ng/ml、10ng/ml、25ng/ml系列濃度，測(cè)定其吸光度，將所得的標(biāo)準(zhǔn)品吸光度的平均值除以0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，再乘以100，繪制成一個(gè)以t濃度(ng/ml)為半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系的曲線圖，并計(jì)算ic50值。結(jié)果ic50為0.21ng/ml，表明靈敏度高?？贵w的特異性：采用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa法進(jìn)行測(cè)定，以抗體的交叉反應(yīng)率來判定抗體的特異性。將睪酮及與等藥物配制成不同濃度，測(cè)定各藥物的ic50值，每種藥物3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算交叉反應(yīng)率。結(jié)果見表1。表1本發(fā)明抗體的特異性競(jìng)爭(zhēng)藥物ic50(ng/ml)交叉反應(yīng)率(％)睪酮5.2100表睪酮＞2000＜0.319-去甲基睪酮＞2000＜0.3甲睪酮＞2000＜0.3勃地酮＞2000＜0.35α-二氫睪酮＞2000＜0.3群勃龍＞2000＜0.3綠司替勃＞2000＜0.3克倫特羅＞10000＜0.06乙烯雌酚＞10000＜0.06萊克多巴胺＞10000＜0.06雌二醇＞10000＜0.063.樣品的制備(1)處理方法一取2±0.05g組織(豬肉、豬肝)均勻物，加入6ml乙腈溶液，充分振蕩2min。振蕩完畢在4000r/min以上，15℃條件下離心10min，取上清液4ml，在56℃條件下氮?dú)饬鞔抵镣耆稍?。干燥后的固體物根據(jù)組織不同有以下不同處理方法。豬肉樣本：加入1ml甲醇-pbs溶液混合振蕩30s，取50μl用于分析。豬肝樣本：先加入2ml正己烷充分振蕩溶解，然后加入1ml去離子水混合振蕩30s，振蕩完畢在4000r/min以上，15℃條件下離心5min，去除上層液相；取50μl下層液相與50μl甲醇-pbs溶液混勻；取50μl用于分析。(2)處理方法二稱取均勻后的組織樣本5g(精確至0.01g)置于50ml離心管中，加入5ml去離子水，20ml叔丁基甲醚，渦旋混勻器混勻1min，超聲波發(fā)生器中超聲波提取10min，之后8000r/min離心5min，取上層有機(jī)相于另一支50ml離心管；下層用20ml叔丁基甲醚分2次提取，合并有機(jī)相；將有機(jī)相40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，加甲醇-pbs溶液定容至10ml。取50μl用于分析。4.酶聯(lián)免疫檢測(cè)(elisa)方法的建立4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線按照間接競(jìng)爭(zhēng)elisa法，以睪酮標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0ng/ml、0.1024ng/ml、0.256ng/ml、0.64ng/ml、1.6ng/ml、4ng/ml、10ng/ml、25ng/ml系列濃度進(jìn)行吸光度的測(cè)定。以睪酮標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，曲線在0.1024～25ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r＝0.9683。4.2重復(fù)度和精密度按照4.1方法，5組平行實(shí)驗(yàn)，每組每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔，以變異系數(shù)為指標(biāo)判定重復(fù)性和精密度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的重復(fù)度結(jié)果如圖3所示，5條曲線近乎重疊，表明重復(fù)性高。精密度結(jié)果如圖4所示，各濃度的變異系數(shù)均＜8％，表明精密度高。5.酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制備5.1酶標(biāo)板的制備用稀釋至最佳包被濃度的t-bsa抗原包被96孔可拆卸酶標(biāo)板，置4℃下過夜，次日取出酶標(biāo)板，恢復(fù)至室溫后傾去包被液，用pbst洗板3次(每次3min，后續(xù)洗滌程序相同)后在吸水紙上拍干，每孔加入200μl封閉液，37℃下封閉1h；取出酶標(biāo)板，恢復(fù)至室溫后傾去封閉液，洗板5次后拍干，組裝成試劑盒。5.2試劑盒的配套試劑每個(gè)試劑盒中應(yīng)配備有：96孔可拆卸微量測(cè)試孔(12條×8孔)1個(gè)；睪酮標(biāo)準(zhǔn)溶液(1ml/瓶)8瓶，濃度分別為0ng/ml、0.1024ng/ml、0.256ng/ml、0.64ng/ml、1.6ng/ml、4ng/ml、10ng/ml、25ng/ml；酶標(biāo)記物(7ml/瓶)1瓶；抗體工作液(7ml/瓶)1瓶；tmb顯色液(7ml/瓶)1瓶；終止液(7ml/瓶)1瓶；20×濃縮洗滌液(40ml/瓶)1瓶；說明書1份。5.3所用試劑的配制(1)封閉液：10gbsa溶于1000mlpbst即可；(2)終止液：18mol/l濃硫酸100ml，緩慢滴加到蒸餾水至900ml；(3)顯色液：①底物a液：na2hpo4·12h2o9g，檸檬酸4g，edta0.2g，過氧化氫脲1.5g，五水硫代硫酸鈉5g，加蒸餾水至1000ml；②底物b液：檸檬酸4g，甘露醇5g，五水硫代硫酸鈉5g，tmb0.6g(10mldmf溶解)，加蒸餾水至1000ml；③使用時(shí)將底物a液和底物b液按1:1混合即可。(4)洗滌緩沖液pbst：nacl80g，kh2po42g，na2hpo4·12h2o29g，kcl2g，tween-205ml，加蒸餾水至1000ml，調(diào)至ph7.4。6.酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的測(cè)定程序6.1工作液配制洗滌液：將40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用去離子水按照1:19稀釋(1份濃縮洗滌液+19份去離子水)，或按所需用量配制洗滌液。甲醇-pbs溶液：取20μl甲醇與980μl0.01mpbs混合可得20ml/l的甲醇-pbs溶液。6.2測(cè)定步驟：(1)將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20-25℃)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。(2)取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃不要冷凍。(3)編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。(4)加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔，再加入抗體工作液50μl/孔。用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。(5)小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液250μl/孔充分洗滌4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干(拍干后未被消除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。(6)顯色：每孔加入100μltmb顯色液，輕輕振蕩混勻25℃環(huán)境避光顯色15min。(7)測(cè)定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長(zhǎng)450/630nm，檢測(cè)在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))測(cè)定每孔o(hù)d值。7.本發(fā)明試劑盒的考核7.1靈敏度在同等條件下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液，本實(shí)驗(yàn)自制試劑盒測(cè)定6次，同類試劑盒測(cè)定5次，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算ic50值。比較最低檢出限量。對(duì)比結(jié)果見表2，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)自制的試劑盒靈敏度相比較高。表2靈敏度比較7.2精密度在同等條件下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液，本實(shí)驗(yàn)自制試劑盒每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液8個(gè)復(fù)孔，同類試劑盒5個(gè)復(fù)孔，比較兩種試劑盒的板內(nèi)變異系數(shù)。對(duì)比結(jié)果見表3，結(jié)果表明兩種試劑盒的變異系數(shù)均＜10％，本實(shí)驗(yàn)自制試劑盒的精密度與本匯寶試劑盒相比兩者水平相當(dāng)。表3精密度比較7.3準(zhǔn)確度在豬肉、豬肝空白樣品中添加0.4μg/kg、1μg/kg、5μg/kg的睪酮，每個(gè)濃度重復(fù)5次，分別用本實(shí)驗(yàn)自制試劑盒和同類試劑盒測(cè)定回收率。對(duì)比結(jié)果見表4，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)自制試劑盒的回收率為92％～116.75％，本匯寶試劑盒的回收率為91.6％～127.5％，對(duì)比結(jié)果可得本實(shí)驗(yàn)自制試劑盒的回收率較高。另外自制試劑盒在測(cè)定空白組織時(shí)，測(cè)定結(jié)果分別為0.01μg/kg和0.06μg/kg，而本匯寶試劑盒的測(cè)定結(jié)果分別為0.01μg/kg和0.08μg/kg，對(duì)比可得自制試劑盒的準(zhǔn)確度更高。表4準(zhǔn)確度比較綜上所述，本發(fā)明所提供的用于睪酮?dú)埩魴z測(cè)的試劑盒及其制備方法和檢測(cè)方法，通過間接競(jìng)爭(zhēng)elisa法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并驗(yàn)證了重復(fù)度和精密度。組裝的試劑盒與市面上其他同類試劑盒進(jìn)行了對(duì)比考核，結(jié)果顯示試劑盒成功有效，且靈敏度，精密度和準(zhǔn)確度都很高。因此，此方法與試劑盒具備操作簡(jiǎn)便，高效靈敏，性能穩(wěn)定，成本低廉，應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)，適用于測(cè)定動(dòng)物源性食品中睪酮?dú)埩粑锏臍埩袅?。?yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的舉例，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12