本發(fā)明涉及一種藥物含量檢測方法，尤其是一種丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液的含量檢測方法。
背景技術(shù)：
丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液是中國于20世紀(jì)60年代自主研發(fā)的中藥注射制劑,由丹參酮ⅱa磺酸鈉和輔料葡萄糖溶于注射用水中形成，臨床上用于冠心病、心絞痛、心肌梗死的輔助治療。丹參酮ⅱa磺酸鈉是丹參酮ⅱa經(jīng)過磺化而成的,其水溶性好,臨床起效快,能增加冠脈流量，能改善缺血區(qū)心肌的側(cè)枝循環(huán)及局部供血,改善缺氧心肌的代謝紊亂,提高心肌耐氧能力,抑制血小板聚集及抗血栓形成,縮小缺血心肌梗死面積,在一定劑量下還能增強(qiáng)心肌收縮力。丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為地方標(biāo)準(zhǔn),現(xiàn)國家食品藥品監(jiān)督管理局將其上升為國家標(biāo)準(zhǔn),標(biāo)準(zhǔn)中含量測定方法為分光光度法，盡管該方法具有許多優(yōu)點(diǎn)，但仍然在以下缺陷：1、專屬性較差：；2、忽略了對輔料葡萄糖的分析和測定。
定量質(zhì)子核磁共振(quantitativeprotonnuclearmagneticresonance,q1h-nmr)技術(shù)是一種日趨成熟的定量分析方法，現(xiàn)已在藥物、化學(xué)、食品、農(nóng)業(yè)以及軍事領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，可檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度，也可測定混合物中各種成分的含量，且定量核磁共振技術(shù)q1h-nmr于2010年收載在我國藥典附錄中。q1h-nmr用于藥物分析的最大優(yōu)勢在于可同時提供化合物結(jié)構(gòu)確證的定性信息和含量測定的定量信息。與hplc方法相比，該方法具有對樣品無破壞、操作簡便、所得結(jié)果重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。q1h-nmr常用定量方法為絕對定量法，即以含量已知的內(nèi)標(biāo)物與待測物制成混合溶液同時測定圖譜，通過二者峰面積的比值確定待測物的含量。在對混合物中的成分進(jìn)行定量分析時，其關(guān)鍵在于定量峰的選擇，選擇各個成分中完全獨(dú)立、無干擾的特征信號峰才可用于該化合物的含量測定。
本發(fā)明同時對丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液中的有效成分丹參酮ⅱa磺酸鈉和輔料葡萄糖進(jìn)行定性定量分析，對注射劑質(zhì)量控制方面具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液的含量檢測方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
一種丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液的含量檢測方法，基于核磁共振法(1h-nmr)對丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液中的丹參酮ⅱa磺酸鈉和葡萄糖同時進(jìn)行含量測定，具體步驟為：
(1)內(nèi)標(biāo)溶液的配制
稱取內(nèi)標(biāo)物tsp(3-三甲基硅基丙酸鈉-d4)溶解于容量瓶中，用d2o(重水)溶解并定容至刻度線；
(2)供試品溶液的制備
精密移取丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液樣品并加入上述內(nèi)標(biāo)溶液溶解，其中，每0.4ml丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液樣品加入0.1ml內(nèi)標(biāo)溶液，得供試品溶液，將所述供試品溶液轉(zhuǎn)移至5mm核磁管中，直接用于1h-nmr測試；
(3)1h-nmr指紋圖譜的測定
將核磁管置于核磁共振儀中，采用水峰抑制脈沖序列測定丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液樣品溶液的1h-nmr圖譜，其中測試參數(shù)及條件為：抑水峰序列zgcppr，觀測頻率400.13mhz，測定溫度300k，譜寬8223.7hz，90°脈沖寬度15μs，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)65536，掃描次數(shù)16次，延遲時間7s，接受增益128；
(4)樣品1h-nmr圖譜分析
依據(jù)1h-nmr圖譜及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，鑒定丹參酮ⅱa磺酸鈉和葡萄糖，采用mestrenova軟件對得到的1h-nmr圖譜依次進(jìn)行相位調(diào)整、基線校正、定標(biāo)，并對其質(zhì)子峰信號進(jìn)行歸屬；
(5)1h-nmr成分的含量測定
在上述實(shí)驗(yàn)條件下采集圖譜，以3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-d4鈉鹽(tsp)為內(nèi)標(biāo)化合物，對丹參酮ⅱa磺酸鈉和葡萄糖以及內(nèi)標(biāo)物tsp的定量峰分別進(jìn)行積分，按照1h-nmr內(nèi)標(biāo)法根據(jù)積分結(jié)果依照以下公式計(jì)算丹參酮ⅱa磺酸鈉和葡萄糖的濃度：
其中px和ptsp分別為化合物和tsp的濃度，ax和atsp分別是化合物定量峰和tsp甲基峰的積分面積，nx和ntsp分別代表化合物定量峰和tsp甲基峰的質(zhì)子個數(shù)，mx和mtsp分別是化合物和tsp的分子量。
優(yōu)選的，上述丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液的含量檢測方法，所述步驟(1)中稱取內(nèi)標(biāo)物tsp5.02mg溶解于10ml容量瓶中，所述內(nèi)標(biāo)溶液中含有2.90mmol·l-1tsp。
優(yōu)選的，上述丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液的含量檢測方法，所述步驟(4)中丹參酮ⅱa磺酸鈉和葡萄糖的信號進(jìn)行歸屬如下表1
表1丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液中2種化學(xué)成分的1h-nmr信號歸屬
上述丹參酮ⅱa磺酸鈉的結(jié)構(gòu)式為(ⅰ)所示結(jié)構(gòu)式，葡萄糖的結(jié)構(gòu)式為(ⅱ)所示結(jié)構(gòu)式，
本發(fā)明的有益效果是：
上述丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液的含量檢測方法，由于供試品為水溶性成分，故選擇重水為溶劑；將制劑樣品溶解于含內(nèi)標(biāo)物的重水中，不加其它任何處理，在特定測試參數(shù)及測定條件下，直接用于1h-nmr測試，操作簡單，無須經(jīng)過柱分離，真實(shí)反應(yīng)了注射液的常規(guī)狀態(tài)。
本發(fā)明所述方法可以有效解決丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液中丹參酮ⅱa磺酸鈉和輔料葡萄糖成分的定量分析問題，上述方法具有簡便易行、穩(wěn)定性好、精密度高、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)等特點(diǎn)，在全面檢測丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液質(zhì)量方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
附圖說明
圖1為丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液1hnmr譜
具體實(shí)施方式
為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
實(shí)施例1
丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液1h-nmr圖譜的建立
1.1儀器與試藥
brukeravanceⅲ400型超導(dǎo)核磁共振波譜儀(德國bruker公司)；mettlertoledoxp6十萬分之一天平(瑞士mettler公司)；5mm標(biāo)準(zhǔn)核磁樣品管(美國norell公司)；d2o(氘代度＞99.8％美國sigma-aldrich公司)；3-(三甲基甲硅烷)丙酸-d4鈉鹽(tsp，氘代度＞98％，美國sigma-aldrich公司)；丹參酮ⅱa磺酸鈉(中國食品藥品檢定研究院，批號：111605-201202)；葡萄糖(美國sigma-aldrich公司)；3批丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液(上海第一生化藥業(yè)有限公司，諾新康，批號：1507217，1506323，140642)
1.2丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液供試品溶液的制備
精密移取0.4ml丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液樣品，加入0.1mld2o(含內(nèi)標(biāo)tsp2.90mmol·l-1)，轉(zhuǎn)移至5mm核磁管中，直接用于1h-nmr測試；
1.31h-nmr圖譜的測定
將核磁管置于核磁共振儀中，采用水峰抑制脈沖序列測定丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液樣品溶液的1h-nmr圖譜，其中測試參數(shù)及條件為：抑水峰序列zgcppr，觀測頻率400.13mhz，測定溫度300k，譜寬8223.7hz，90°脈沖寬度15μs，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)65536，掃描次數(shù)16次，延遲時間7s，接受增益128。
1.4樣品1h-nmr圖譜分析
依據(jù)1h-nmr圖譜及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，鑒定丹參酮ⅱa磺酸鈉和葡萄糖，采用mestrenova軟件對得到的1h-nmr圖譜依次進(jìn)行相位調(diào)整、基線校正、定標(biāo)，根據(jù)質(zhì)子信號峰的化學(xué)位移值和偶合裂分情況，進(jìn)行歸屬，結(jié)果顯示δ2.69處的1位的亞甲基質(zhì)子信號峰與其它信號峰分離良好，被選為丹參酮ⅱa磺酸鈉的定量峰；δ4.65和5.25處1位次甲基質(zhì)子信號峰及δ3.25和3.55處2位次甲基質(zhì)子信號峰與其它信號峰分離良好，被選為葡萄糖的定量峰。
1.5方法學(xué)考察
精密度：取同一份丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液供試品溶液，在上述1h-nmr測試條件下連續(xù)測定6次，記錄定量峰積分面積，計(jì)算rsd值。
重復(fù)性：取同一批次丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液供試品溶液6份，測試1h-nmr圖譜，記錄定量峰積分面積，計(jì)算rsd值。
穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一份丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液供試品溶液，分別在0,2,4,8,10,12h，測試1h-nmr圖譜，記錄定量峰積分面積，計(jì)算rsd值。
加樣回收率：取同一批次丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液0.2ml,加水稀釋至0.4ml，共3份，然后分別精密加入0.35mg丹參酮ⅱa磺酸鈉、4.39mg葡萄糖，每份加入0.1ml內(nèi)標(biāo)溶液,配制供試品溶液，測定1h-nmr圖譜，記錄積分面積，計(jì)算回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表2。
表2定量核磁法方法學(xué)考察
通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)可以確定本發(fā)明所述方法的正確性和準(zhǔn)確性。
1.6定量核磁法測定不同批號丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液中丹參酮ⅱa磺酸鈉和葡萄糖的含量
精密移取0.4ml丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液樣品，按照“1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行測定。記錄樣品nmr圖譜，計(jì)算含量。結(jié)果見表3。
表3樣品含量測定
綜上,本發(fā)明建立了一種基于定量核磁共振技術(shù)的含量檢測方法，特別涉及到丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液的1h-nmr指紋圖譜，在一張圖譜上同時完成了對主成分丹參酮ⅱa磺酸鈉和輔料葡萄糖的定性、定量檢測，同時也彌補(bǔ)了分光光度法對上述成分檢測中專屬性較差、測定不到輔料葡萄糖的缺陷。
上述參照具體實(shí)施方式對該一種丹參酮ⅱa磺酸鈉注射液的含量檢測方法進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實(shí)施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。