本發(fā)明涉及一種花瓣細胞中鈣離子測定方法。
背景技術(shù)：
鈣離子作為一種非常重要的信號分子,不僅調(diào)節(jié)植物細胞內(nèi)的多種生理活動,還參與細胞對外界環(huán)境的響應(yīng)過程。鈣離子信號主要通過細胞質(zhì)和細胞器中鈣離子分布以及濃度的變化而產(chǎn)生。植物中,多種生物或非生物脅迫作用都會導(dǎo)致細胞質(zhì)鈣離子濃度的瞬間變化,觸發(fā)鈣響應(yīng)的下游反應(yīng)。
目前，對于花瓣中鈣信號的研究較少，對于其信號作用還不清楚。花瓣作為植物重要的器官，對于植物的繁殖以及觀賞價值具有重要意義；因此，研究花瓣細胞中的鈣信號具有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種花瓣細胞中鈣離子測定方法，其有效解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種花瓣細胞中鈣離子測定方法，所述方法包括如下步驟：
1)選擇盛開期花朵的花瓣，用鑷子輕輕撕取1cm2表皮，迅速浸泡在測試緩沖液中，用彩色石粒輕壓，浸泡30min，使表皮細胞離子跨膜交換達到平衡；
2)將浸泡后的表皮放入新的測試緩沖液中，然后置于非損傷微測系統(tǒng)的顯微鏡下；在顯微鏡下觀察表皮邊緣，尋找細胞結(jié)構(gòu)完整的區(qū)域，選擇形態(tài)良好的細胞作為測點；
3)將電極對準測點，距離細胞2μm，電極移動距離為30μm，5s記錄一個數(shù)據(jù)；
4)將冷光源放在屏蔽罩中，用可調(diào)光強的軟管led冷光源控制光強，照射測點，用照度計檢測光強，首先在黑暗條件下測定3min，黑暗條件下測試完成后打開冷光源設(shè)備開關(guān)，進行光照條件下的測定，設(shè)置100μmol/m2·s、300μmol/m2·s、600μmol/m2·s、1000μmol/m2·s、1500μmol/m2·s5個光強梯度，每個梯度分別測定7min，重復(fù)5次，并分別記錄不同光照強度下每次測定的測點內(nèi)鈣離子流速。
進一步，所述測試緩沖液的ph為5.8，其含有0.1mm的kcl，0.1mm的cacl2，0.3mm的mes。
本發(fā)明具有以下有益技術(shù)效果：
本發(fā)明通過非損傷微測技術(shù)測定不同光強下花瓣細胞中鈣離子流，鈣離子流速均為負值，表明花瓣表皮細胞中鈣離子體表現(xiàn)為內(nèi)流。在黑暗環(huán)境中，鈣離子流均處于較平穩(wěn)狀態(tài)，施加不同強度的光強，鈣離子的內(nèi)流表現(xiàn)出不同程度增大的趨勢，且光照越強，內(nèi)流的速度越大。通過該方法解決了現(xiàn)有技術(shù)中無法獲得花瓣細胞中鈣信號的作用的問題，為花的培養(yǎng)及繁殖提供了新思路。
附圖說明
圖1為花瓣細胞中鈣離子對光照強度的響應(yīng)圖。
具體實施方式
下面，參考附圖，對本發(fā)明進行更全面的說明，附圖中示出了本發(fā)明的示例性實施例。然而，本發(fā)明可以體現(xiàn)為多種不同形式，并不應(yīng)理解為局限于這里敘述的示例性實施例。而是，提供這些實施例，從而使本發(fā)明全面和完整，并將本發(fā)明的范圍完全地傳達給本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員。
本發(fā)明提供了一種花瓣細胞中鈣離子測定方法，該方法包括如下步驟：
1)選擇盛開期花朵的花瓣，用鑷子輕輕撕取1cm2表皮，迅速浸泡在測試緩沖液中，用彩色石粒輕壓，浸泡30min，使表皮細胞離子跨膜交換達到平衡；
2)將浸泡后的表皮放入新的測試緩沖液中，然后置于非損傷微測系統(tǒng)的顯微鏡下；在顯微鏡下觀察表皮邊緣，尋找細胞結(jié)構(gòu)完整的區(qū)域，選擇形態(tài)良好的細胞作為測點；
3)將電極對準測點，距離細胞2μm，電極移動距離為30μm，5s記錄一個數(shù)據(jù)；電極用來測定離花瓣不同距離兩個點的鈣離子濃度，最后轉(zhuǎn)化為鈣離子流動速度；
4)將冷光源放在屏蔽罩中，用可調(diào)光強的軟管led冷光源控制光強，照射測點，用照度計檢測光強，首先在黑暗條件下測定3min，黑暗條件下測試完成后打開冷光源設(shè)備開關(guān)，進行光照條件下的測定，設(shè)置100μmol/m2·s、300μmol/m2·s、600μmol/m2·s、1000μmol/m2·s、1500μmol/m2·s5個光強梯度，每個梯度分別測定7min，重復(fù)5次，并分別記錄不同光照強度下每次測定的測點內(nèi)鈣離子流速。
測試緩沖液的ph為5.8，其含有0.1mm的kcl，0.1mm的cacl2，0.3mm的mes。
如圖1所示，通過非損傷微測技術(shù)測定不同光強下百合花瓣細胞中鈣離子流，ca2+流速均為負值，表明百合花瓣表皮細胞ca2+總體表現(xiàn)為內(nèi)流。在黑暗環(huán)境中，ca2+流均處于較平穩(wěn)狀態(tài)(圖中陰影部分)，施加不同強度的光強，ca2+的內(nèi)流表現(xiàn)出不同程度增大的趨勢，且光照越強，內(nèi)流的速度越大。100μmol/m2·s光照下，ca2+平均內(nèi)流速度較黑暗條件下增幅在100pmol/cm2·s以內(nèi)，變化不明顯。而光強從0μmol/m2·s增加到300μmol/m2·s時，ca2+平均流速由增加了近一倍。當(dāng)分別施加600、1000、1500μmol/m2·s照度時，內(nèi)流均迅速增加。當(dāng)受到600μmol/m2·s光強照射后，與黑暗處理相比，ca2+內(nèi)流速度增加了一倍。但隨著光強增加到1000和1500μmol/m2·s，ca2+內(nèi)流速度雖然也呈現(xiàn)增加的趨勢，但是與600μmol/m2·s光強處理沒有明顯差異。并且在600、1000、1500μmol/m2·s照度下，ca2+內(nèi)流的速度達到最大后又逐漸回落。
本技術(shù)：
中的屏蔽罩是非損傷微測系統(tǒng)的一部分，用于屏蔽外界電流的影響。非損傷微測系統(tǒng)的用來測定離子流的成熟系統(tǒng)；本申請的主要目的是解決了在研究光對花瓣組織生理生化的影響中，作為早期信號的鈣離子流的測定方法。本發(fā)明通過非損傷微測技術(shù)為研究花瓣中鈣離子對光信號的響應(yīng)規(guī)律，及其信號作用提供了新思路。
上面所述只是為了說明本發(fā)明，應(yīng)該理解為本發(fā)明并不局限于以上實施例，符合本發(fā)明思想的各種變通形式均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。