本發(fā)明涉及納米熒光探針和干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種寬熒光光譜和mri雙影像功能微球示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前，骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)疏松性骨折等疾病已經(jīng)受到廣泛關(guān)注的全球性公共健康問(wèn)題，早期準(zhǔn)確的診斷、合理的治療以及治療效果監(jiān)測(cè)對(duì)預(yù)防或降低骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的脆性骨折至關(guān)重要。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)理尚不明確，一般認(rèn)為是由于骨穩(wěn)態(tài)平衡被打破，破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞數(shù)目和功能失衡，骨吸收大于骨形成，而最終引起骨質(zhì)疏松。骨質(zhì)疏松癥常伴間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化能力的下降，成骨細(xì)胞成骨能力降低。從而導(dǎo)致骨量減少，局部出現(xiàn)骨質(zhì)疏松性骨缺損。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)由新生兒臍帶分離培養(yǎng)，來(lái)源豐富，取材方便。體外培養(yǎng)、體內(nèi)植入均有多向分化潛能、增殖分化能力強(qiáng)、免疫原性低等特性，是骨組織工程中修復(fù)骨缺損的理想種子細(xì)胞。

近年來(lái)，尋求植入體內(nèi)的人間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記和示蹤方法，并且辨別受體中人間充質(zhì)干細(xì)胞的生存情況，仍然是當(dāng)今觀察和評(píng)估干細(xì)胞應(yīng)用于骨缺損修復(fù)的熱點(diǎn)研究問(wèn)題。大量研究表明將人間充質(zhì)干細(xì)胞植入活體內(nèi)，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，改善骨質(zhì)疏松部位的骨結(jié)構(gòu)，有效修復(fù)疾病、創(chuàng)傷導(dǎo)致的骨或軟骨缺損，在未來(lái)骨質(zhì)疏松癥的治療中有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

目前，具有優(yōu)良光學(xué)特性并且運(yùn)用于光學(xué)成像的納米材料包括金納米顆粒、量子點(diǎn)、多孔二氧化硅納米顆粒、納米碳管、聚合物熒光微球等，其中熒光微球示蹤的優(yōu)越性在于：穩(wěn)定形態(tài)結(jié)構(gòu)，粒徑分布集中(50-300nm)；穩(wěn)定而高效的發(fā)光效率；具有優(yōu)良的生物降解性和生物相容性；小分子熒光素體內(nèi)代謝率大大降低。因此，熒光微球示蹤在分子影像技術(shù)領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注和高度重視。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)是指在供體(donor)基團(tuán)受到激發(fā)后，偶極子介導(dǎo)的能量從供體轉(zhuǎn)向受體(acceptor)，光子未曾介入該過(guò)程，因此這一過(guò)程是非輻射性的。在供體分子被激發(fā)后，如果受體分子與供體分子距離合適(小于10nm)，處于激發(fā)狀態(tài)下的供體會(huì)將能量轉(zhuǎn)移給受體，誘使受體激發(fā)，在這個(gè)轉(zhuǎn)移過(guò)程中，不會(huì)涉及到光子的發(fā)射和重新吸收。常用的熒光素如香豆素、吖啶橙、羅丹明、藻紅蛋白之間能依次發(fā)生fret效應(yīng)，已被廣泛應(yīng)用于熒光探針等領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種寬熒光光譜和mri雙影像功能微球示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞及應(yīng)用，本發(fā)明的微球能提供寬熒光光譜和mri雙影像功能，減少動(dòng)物體內(nèi)應(yīng)用時(shí)的自體背景熒光的干擾，將所制微球與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，可對(duì)其進(jìn)行示蹤，并用于骨缺損、骨質(zhì)疏松性骨缺損的修復(fù)和治療。本申請(qǐng)中，熒光光譜即為公知的熒光發(fā)射光譜。

本發(fā)明提供了一種寬熒光發(fā)射光譜和mri雙影像功能微球示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)吞有寬熒光發(fā)射光譜和mri雙影像功能微球，寬熒光光譜和mri雙影像功能微球包括以下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的各組分：聚合物70-99.9％，熒光素0.05-20％，釓劑0.05-10％；聚合物為聚乙丙交酯-聚乙二醇共聚物或聚苯乙烯。微球的粒徑為50-300nm。

上述微球中，聚合物作為熒光素和釓劑的載體。優(yōu)選地，聚乙丙交酯-聚乙二醇共聚物的分子量為10000-100000g/mol，其中聚乙二醇的分子量為2000-5000g/mol，該材料生物相容性好，可降解。聚苯乙烯為交聯(lián)的聚苯乙烯微球，其表面還可帶有羧基或氨基。聚苯乙烯微球微球的粒徑為50-200nm，粒徑相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<10％。

進(jìn)一步地，微球表面還偶聯(lián)有修飾化合物，修飾化合物為聚精氨酸、聚賴氨酸、聚酰亞胺或聚乙二胺。聚精氨酸的的重復(fù)單元為9。聚酰亞胺的分子量可選擇25kg/mol。微球表面的修飾化合物可增加微球進(jìn)入干細(xì)胞的比例，提高微球標(biāo)記干細(xì)胞的熒光亮度。

進(jìn)一步地，熒光素為香豆素、吖啶橙、羅丹明、藻紅蛋白和吲哚菁綠中的兩種或三種。優(yōu)選地，熒光素為香豆素和吖啶橙的組合，吖啶橙、羅丹明和藻紅蛋白的組合，藻紅蛋白和吲哚菁綠的組合。熒光素之間能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)(fret)。

進(jìn)一步地，釓劑為釓-二乙三胺五乙酸(gd-dtpa)。釓劑具有mri成像功能。

進(jìn)一步地，當(dāng)聚合物為聚乙丙交酯-聚乙二醇共聚物時(shí)，寬熒光光譜和mri雙影像功能微球的制備方法包括以下步驟：

(1)將聚乙丙交酯-聚乙二醇共聚物和熒光素溶解于有機(jī)溶劑，作為油相，將釓劑溶于水，作為內(nèi)水相，將聚丙烯酸和聚乙烯醇溶于水，作為外水相；

(2)通過(guò)復(fù)乳法利用油相、內(nèi)水相和外水相制備微球，除盡油相的有機(jī)溶劑，得到寬熒光光譜和mri雙影像功能微球。

進(jìn)一步地，在步驟(1)中，有機(jī)溶劑為氯仿、二氯甲烷和二氯乙烷中的一種或幾種。在步驟(2)中，復(fù)乳法操作步驟如下：首先將油相、內(nèi)水相制成初乳，將初乳加入外水相制得水/油/水的復(fù)乳，待油相的有機(jī)溶劑揮發(fā)除盡，即得到熒光和mri雙影像功能微球。

進(jìn)一步地，當(dāng)聚合物為聚苯乙烯時(shí)，寬熒光光譜和mri雙影像功能微球的制備方法包括以下步驟：

將熒光素和釓劑溶于有機(jī)溶劑中，向其中加入聚苯乙烯微球，聚苯乙烯納米微球的粒徑范圍50-200nm，粒徑相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<10％；反應(yīng)24h后除掉有機(jī)溶劑，洗滌后，得到寬熒光光譜和mri雙影像功能微球。熒光素為吖啶橙、羅丹明、吲哚菁綠。有機(jī)溶劑為氯仿和異丙醇的混合物，二者體積比為1:3。洗滌時(shí)，采用酒精和水清洗微球直至上清液無(wú)明顯顏色

進(jìn)一步地，還包括以下步驟：通過(guò)氨酯化反應(yīng)，將微球與修飾化合物的氨基偶聯(lián)。

氨酯化反應(yīng)，可以通過(guò)偶聯(lián)劑edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺)輔助進(jìn)行。也可以通過(guò)戊二醛為交聯(lián)劑，將修飾化合物的氨基與含氨基的聚苯乙烯微球偶聯(lián)。

進(jìn)一步地，寬熒光光譜和mri雙影像功能微球示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法包括以下步驟：

將寬熒光光譜和mri雙影像功能微球與細(xì)胞培養(yǎng)液混合均勻，得到微球溶液，并在4℃下孵育24h后，加入到已貼壁的間充質(zhì)干細(xì)胞中，在37℃下培養(yǎng)1-4天，用純培養(yǎng)基洗滌，除去未進(jìn)入間充質(zhì)細(xì)胞的微球，得到寬熒光光譜和mri雙影像功能微球示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞。

進(jìn)一步地，微球溶液的濃度為0.2-1.0mg/ml。

本發(fā)明還公開(kāi)了上述寬熒光光譜和mri雙影像功能微球示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞在制備骨缺損修復(fù)和/或骨質(zhì)疏松疾病的示蹤劑和/或治療劑中的應(yīng)用。在應(yīng)用過(guò)程中，間充質(zhì)干細(xì)胞具有熒光和mri雙影像成像功能。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：

熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(fret)作為1.0-10.0nm距離范圍內(nèi)的光學(xué)分子尺，具有高分辨率、高靈敏度、簡(jiǎn)單方便等優(yōu)點(diǎn)。采用可發(fā)生fret效應(yīng)的熒光素組合，微球的熒光發(fā)射光譜變寬，利用供體熒光素的最佳激發(fā)波長(zhǎng)，通過(guò)fret效應(yīng)使受體熒光素發(fā)出更強(qiáng)的熒光，因自體熒光波長(zhǎng)距離激發(fā)光較近，基于fret效應(yīng)設(shè)計(jì)的熒光素組合可發(fā)出波長(zhǎng)更長(zhǎng)的熒光，從而削弱自發(fā)熒光的影響，降低體內(nèi)應(yīng)用時(shí)的背景熒光干擾，使微球熒光信號(hào)的體內(nèi)可分辨度提高。核磁共振(mri)已應(yīng)用于全身各系統(tǒng)的影像診斷。效果最佳的是顱腦，及其脊髓、心臟大血管、關(guān)節(jié)骨骼和軟組織等。mri進(jìn)行定性及半定量的診斷，可作多個(gè)切面圖，空間分辨率較高，優(yōu)于其他x線影像、二維超聲、核素及ct檢查。本發(fā)明的微球同時(shí)結(jié)合了熒光和mri影像的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明使用的間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)，在含有微球的培養(yǎng)液(mscm)中孵育2-4天后，微球被mscs吞噬且在細(xì)胞內(nèi)均勻分布，該細(xì)胞能夠用于體內(nèi)示蹤。與熒光素和釓劑直接進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記相比，熒光素和釓劑被聚合物負(fù)載后，微球具備低細(xì)胞毒性、粒徑分布均勻(160-220nm)、易吞噬、更加穩(wěn)定而高效地在體內(nèi)循環(huán)、良好的生物降解性和生物相容性、提高圖像信號(hào)比等特性，同時(shí)，更有利于發(fā)揮寬熒光發(fā)射光譜素本身優(yōu)良的熒光穿透特性，降低對(duì)生物組織的損傷。

本發(fā)明為寬熒光發(fā)射光譜素和釓劑在示蹤mscs方面提供了一種直觀簡(jiǎn)便、動(dòng)態(tài)無(wú)創(chuàng)的方案，能進(jìn)一步用于深入觀察和證實(shí)骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制，以及評(píng)估m(xù)scs在骨質(zhì)疏松性骨質(zhì)缺損修復(fù)中的應(yīng)用、骨質(zhì)疏松的分子影像領(lǐng)域具有廣泛的運(yùn)用前景。

上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說(shuō)明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說(shuō)明如后。

附圖說(shuō)明

圖1圖示了不同濃度微球溶液對(duì)細(xì)胞生存率的影響結(jié)果；

圖2為使用含本發(fā)明微球的培養(yǎng)液培育間充質(zhì)干細(xì)胞后，于單光子激光共聚焦顯微鏡下拍攝的熒光圖片；

圖3為實(shí)施例2中對(duì)照組于單光子激光共聚焦顯微鏡下拍攝的熒光圖片；

圖4圖示了本發(fā)明微球示蹤的間充質(zhì)干細(xì)胞注入大鼠顱骨后的ct掃描結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明使用的間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)為人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hucmscs)，該細(xì)胞能夠提供的強(qiáng)大自我更新能力和增值分化能力。

實(shí)施例1

本發(fā)明的寬熒光光譜和mri雙影像功能微球的制備方法，包括以下步驟：

(1)稱量5mg吖啶橙、10mg羅丹明和25mg聚乙丙交酯-聚乙二醇共聚物(plga-peg)混合，用1ml氯仿/異丙醇(體積比為1:3)溶液溶解，得到油相。準(zhǔn)備100μl100mg/ml的gd-dtpa造影劑水溶液作內(nèi)水相。

(2)將步驟(1)得到的油相和內(nèi)水相超聲混合5次，每次2s，(100w，bilon92-ii)，得到初乳劑。

(3)向步驟(2)的產(chǎn)物加入4ml聚乙烯醇(pva)水溶液(5wt％)，超聲混合5次(2s，100w)形成復(fù)乳劑。

(4)將步驟(3)的產(chǎn)物稀釋到聚丙烯酸(paa)水溶液中(5wt％，40ml)，室溫下過(guò)夜攪拌、避光揮發(fā)。

(5)用50ml高速離心管收集步驟(4)含微球溶液，先用無(wú)水乙醇清洗一次，高速離心(14500rpm，20min)，棄上清，超聲均勻，再加入純水清洗，高速離心(12000rpm，10min)，重復(fù)2-3次，最終所得沉淀即為寬熒光光譜和mri雙影像功能微球示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞。

(6)將步驟(5)得到的微球溶于純水，得到不同濃度的微球水溶液。

上述制備的微球中，包含以下含量的各組分：聚合物70％，熒光素20％，釓劑10％。

實(shí)施例2

(1)將hucmscs正常傳代培養(yǎng)，在普通細(xì)胞培養(yǎng)皿皿底鋪相應(yīng)規(guī)格爬片。

(2)將微球(如實(shí)施例1制備的微球)與mscm培養(yǎng)基混合，配成微球培養(yǎng)液(0.2-1mg/ml)，置于培養(yǎng)箱中(37℃，5％co2)孵育24h。

(3)24h后，間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁，吸除培養(yǎng)液，加入相同體積的培養(yǎng)液(0.2-1mg/ml)，置于培養(yǎng)箱(37℃，5％co2)，繼續(xù)培養(yǎng)2-4天，優(yōu)選2天。

微球?qū)scs細(xì)胞的毒性影響如圖1所示，對(duì)照組為純聚乙丙交酯-聚乙二醇共聚物微球，在1.0mg/ml濃度以下，對(duì)照組和熒光和mri雙功能微球組均未觀察到明顯毒性，濃度為2mg/ml時(shí)，兩組細(xì)胞死亡率明顯增加，因此使用時(shí)，微球濃度范圍在1mg/ml以下為宜。

(4)2-4天后，去除培養(yǎng)液，pbs清洗2遍后，浸沒(méi)在5％多聚甲醛中30min，再用pbs清洗兩遍，將皿底爬片，制成玻片標(biāo)本。

(5)利用nuance多光譜影像系統(tǒng)，紫外光激發(fā)，采集圖片。

(6)單光子激光共聚焦顯微鏡下觀察玻片標(biāo)本，選擇激發(fā)光波長(zhǎng)488nm，放射波長(zhǎng)接收范圍500-545nm(綠色green)和550-580nm(紅色red)，采集圖片，結(jié)果如圖2所示，圖2表明，微球的熒光素間發(fā)生了熒光能量共振轉(zhuǎn)移，采用488nm激光時(shí)，細(xì)胞具有極強(qiáng)的紅色熒光。同時(shí)以負(fù)載吖啶橙的微球被間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)吞后的干細(xì)胞組作為對(duì)照組，按上述方法拍攝熒光圖片(圖3)，其熒光亮度(紅光)很弱，與對(duì)照組相比，本發(fā)明的干細(xì)胞的紅色熒光強(qiáng)5-10倍。結(jié)合熒光照片數(shù)據(jù)，微球的濃度在0.2mg/ml以上為佳，可以觀察到較明顯的熒光信號(hào)。

因此，結(jié)合微球示蹤mscs的熒光強(qiáng)度和毒性數(shù)據(jù)，使用時(shí)，微球的濃度為0.2-1mg/ml為宜。

(7)雙光子激光共聚焦顯微鏡下觀察玻片標(biāo)本，激發(fā)波長(zhǎng)880nm，觀察攝片。

(8)取適量微球溶液注入玻璃細(xì)管中(直徑2mm，長(zhǎng)度10cm，液高2-3cm)，進(jìn)行mri掃描，對(duì)比信號(hào)強(qiáng)度。

(9)若步驟(7)(8)得到的熒光強(qiáng)度和信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到示蹤標(biāo)準(zhǔn)，將寬熒光光譜和mri雙影像功能微球標(biāo)記的hucmscs(5×10⁵-5×10⁶⁾注入大鼠局部骨缺損區(qū)域(顱骨)，雙光子共聚焦顯微鏡連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察，比較熒光/信號(hào)強(qiáng)弱和分布，mri掃描評(píng)估局部骨缺損修復(fù)狀況。結(jié)果如圖4，與對(duì)照組(control)相比，本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞骨缺損愈合更好，修復(fù)效果更佳。

實(shí)施例3

本發(fā)明的寬熒光光譜和mri雙影像功能微球示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

(1)稱量0.1mg吖啶橙、0.1mg羅丹明和25mg聚乙丙交酯-聚乙二醇共聚物混合，用1ml氯仿/異丙醇(體積比為1:3)溶液溶解，得到油相。準(zhǔn)備10μl1mg/ml的gd-dtpa造影劑水溶液作內(nèi)水相。

(2)將步驟(1)得到的油相和內(nèi)水相超聲混合5次，每次2s(100w，bilon92-ii)，得到初乳劑。

(3)向步驟(2)的產(chǎn)物加入4mlpva水溶液(5wt％)，超聲混合5次(2s，100w)形成復(fù)乳劑。

(4)將步驟(3)的產(chǎn)物稀釋到paa水溶液中(5wt％，40ml)，室溫下過(guò)夜攪拌、避光揮發(fā)。

(5)用50ml高速離心管收集步驟(4)含微球溶液，先用無(wú)水乙醇清洗一次，高速離心(14500rpm，20min)，棄上清，超聲均勻，再加入純水清洗，高速離心(12000rpm，10min)，重復(fù)2-3次，最終所得沉淀即為寬熒光發(fā)射光譜和mri雙影像功能微球示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞。

(6)將步驟(5)得到的微球溶于純水，得到不同濃度的微球水溶液。

上述制備的微球中，包含以下含量的各組分：聚合物99.9％，熒光素0.05％，釓劑0.05％。

實(shí)施例4

羧基化聚苯乙烯微球由bangslab公司提供，粒徑100nm，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(cv)約為5％；向氯仿/異丙醇(1/3)的溶液中加入聚苯乙烯，氯仿/異丙醇溶液中含有2-4mg/ml吖啶橙、2-4mg/ml羅丹明、2-4mg/ml吲哚菁綠和1-10mg/mlgd-dtpa，反應(yīng)24h并同時(shí)揮發(fā)溶劑，待溶劑完全揮發(fā)后，用酒精和水清洗微球直至上清液無(wú)明顯顏色，得到寬熒光發(fā)射光譜和mri雙影像功能微球。

上述制備的微球中，包含以下含量的各組分：聚合物97.5％，熒光素2％，釓劑0.5％。

同樣熒光素用量條件下，可以明顯觀察到聚苯乙烯微球的熒光亮度更高，因聚苯乙烯對(duì)熒光素有更強(qiáng)的吸附作用。同樣的，以聚苯乙烯制備的微球?qū)scs的毒性和以plga類聚合物制備的微球的毒性接近，而以聚苯乙烯制備的微球示蹤的mscs熒光信號(hào)提高1-2倍，但mri信號(hào)要弱20-50％。

實(shí)施例5

本發(fā)明的寬熒光發(fā)射光譜和mri雙影像功能微球示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

(1)稱量2mg吖啶橙、2mg羅丹明、2mg吲哚菁綠，與25mg聚乙丙交酯混合，再用1ml氯仿溶解，得到油相。準(zhǔn)備100μlgd-dtpa造影劑作內(nèi)水相。

(2)將步驟(1)得到的油相和內(nèi)水相超聲混合5次(2s，100w，bilon92-ii)，得到初乳劑。

(3)向步驟(2)的產(chǎn)物加入4mlpva水溶液(5wt％)，超聲混合5次(2s，100w)形成復(fù)乳劑。

(4)將步驟(3)的產(chǎn)物稀釋到paa水溶液中(5wt％，40ml)，室溫下過(guò)夜攪拌、避光揮發(fā)。

(5)用50ml高速離心管收集步驟(4)含微球溶液，先用無(wú)水乙醇清洗一次，高速離心(14500rpm，20min)，棄上清，超聲均勻，再加入純水清洗，高速離心(12000rpm，10min)，重復(fù)2-3次，最終所得微球沉淀溶于1ml純水。

(6)均勻抽取10μl步驟(5)溶液，烘干后稱量，計(jì)算得到步驟(5)微球溶液濃度，以聚乙丙交酯制備的寬熒光發(fā)射光譜和mri雙影像功能微球的濃度為1-2mg/ml。

(7)抽取100μl所制備的微球溶液，用純水稀釋成2ml，在納米粒度及zeta電位分析儀(zetasizernanozs90)測(cè)得微球粒徑，所制微球粒徑分布范圍為200-300nm。

實(shí)施例6

本發(fā)明不同濃度的微球?qū)?xì)胞生存率的影響情況的測(cè)試方法如下：

(1)96孔板每空接種5000個(gè)細(xì)胞。

(2)將實(shí)施例1所制得微球，用培養(yǎng)液稀釋成濃度分別為0.2、0.4、0.8、1、2mg/ml微球溶液，錫箔紙包裹，4℃冰箱過(guò)夜孵育。

(3)在不同濃度實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組中分別相應(yīng)的微球培養(yǎng)液和培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)24h、48h。

(4)用多功能酶標(biāo)儀(synergy2)測(cè)得od值，與空白對(duì)照相比，統(tǒng)計(jì)分析各組細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示2mg/ml微球溶液細(xì)胞生存率低于空白對(duì)照組。

圖1為不同濃度微球溶液對(duì)細(xì)胞生存率的影響結(jié)果，對(duì)照組為純聚乙丙交酯-聚乙二醇共聚物空白微球(沒(méi)有染料和釓劑)，在1.0mg/ml濃度以下，對(duì)照組和本發(fā)明的微球均未觀察到明顯毒性，濃度為2mg/ml時(shí)，兩組細(xì)胞死亡率明顯增加，因此微球的用量在1.0mg/ml濃度以下為宜。

本發(fā)明微球的示蹤情況測(cè)試方法如下：

(1)3月齡未孕雌性sd大鼠6只行去勢(shì)手術(shù)切除雙側(cè)卵巢，術(shù)后飼養(yǎng)3個(gè)月。

(2)sd大鼠3.6％水合氯醛麻醉后，切開(kāi)股骨外皮膚，暴露骨膜，用直徑為3mm的打孔電鉆在股骨皮質(zhì)上，緩慢勻速鑿出深度1mm的圓形骨缺損區(qū)域。

(3)將寬熒光發(fā)射光譜和mri雙功能微球標(biāo)記好的hucmscs取5×10⁵-5×10⁶個(gè)細(xì)胞，用30μlpbs重懸，1ml注射器抽取后注入到股骨皮質(zhì)圓形缺損區(qū)域，縫合皮膚。

(4)小動(dòng)物熒光影像系統(tǒng)、micro-ct、mri定期掃描骨缺損部位的骨質(zhì)修復(fù)狀況。

通過(guò)連續(xù)觀察骨缺損區(qū)域的熒光變化和骨修復(fù)情況，綜合多種影像手段，可以闡明示蹤干細(xì)胞對(duì)骨缺損區(qū)域的修復(fù)過(guò)程，得出干細(xì)胞修復(fù)骨缺損的修復(fù)機(jī)制。

圖4圖示了本發(fā)明微球示蹤的間充質(zhì)干細(xì)胞注入大鼠顱骨后的ct掃描結(jié)果，與對(duì)照組(control，未做任何處理)相比，本發(fā)明微球示蹤mscs組骨缺損處骨小梁結(jié)構(gòu)更為致密，骨間隙變窄，骨密度增高，修復(fù)后骨缺損區(qū)域面積僅為對(duì)照組的20-40％左右，證明該組對(duì)于骨缺損修復(fù)效果更佳。

實(shí)施例7

此外，微球表面還可以連接一些修飾化合物，修飾化合物為聚精氨酸、聚賴氨酸、聚酰亞胺或聚乙二胺。修飾化合物能夠提高微球的干細(xì)胞內(nèi)吞量。具體修飾方法如下：

向?qū)嵤├?或4制備的微球溶液中加入聚精氨酸、聚酰亞胺或聚乙二胺，通過(guò)氨酯化反應(yīng)，修飾化合物表面的氨基與微球表面的羧基反應(yīng)后連接到微球表面。氨酯化反應(yīng)，可以通過(guò)偶聯(lián)劑edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺)輔助進(jìn)行。也可以通過(guò)戊二醛為交聯(lián)劑，將修飾化合物的氨基與含氨基的聚苯乙烯微球偶聯(lián)。將最終所得的微球與間充質(zhì)干細(xì)胞用實(shí)施例2中的方法進(jìn)行培養(yǎng)，得到寬熒光光譜和mri雙影像功能微球示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞。與未修飾組化合物的微球相比，修飾了化合物的微球示蹤的間充質(zhì)干細(xì)胞的熒光強(qiáng)度可增加50-100％，mri亮度可增加30-100％。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。