本發(fā)明涉及一種蝦夷扇貝中微囊藻毒素檢測(cè)方法，屬于生化分離
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體涉及一種利用攪拌棒吸附分離蝦夷扇貝中7種微囊藻毒素并利用超高效液相色譜-質(zhì)譜分析對(duì)其定性、定量分析的方法。
背景技術(shù)：
：微囊藻毒素(microcystins)為藍(lán)藻水華釋放的一類具有強(qiáng)烈致癌作用的肝毒素，其毒性較大，分布廣泛，目前已發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體多約80余種，其結(jié)構(gòu)由7個(gè)氨基酸組成，主要產(chǎn)自微囊藻(microcystisaeruginosa)、魚(yú)腥藻(anabaena)、念珠藻(nostocales)等浮游性藍(lán)藻，其中mc-lr最為常見(jiàn)。調(diào)查表明，我國(guó)60％的水體由于過(guò)多接納了氮和磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而出現(xiàn)了藍(lán)藻水華現(xiàn)象，該現(xiàn)象使水面湖靛堆積，大量消耗水中溶解氧致魚(yú)類窒息死亡，藻體死亡分解過(guò)程中釋放生物毒素類次級(jí)代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致水體污染，水生動(dòng)植物死亡。此外，已有研究證明，mcs進(jìn)入人體肝細(xì)胞后，能強(qiáng)烈地抑制蛋白磷酸酶(pp1、pp2a)的活性，誘發(fā)細(xì)胞角蛋白高度磷酸化，導(dǎo)致肝細(xì)胞微絲分解、破裂和出血。因此，mcs通過(guò)食物鏈傳遞到水生動(dòng)物中，并在水生動(dòng)物體中積累富集而導(dǎo)致的人體健康潛在風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。因此建立一種淡水魚(yú)肉中高效、準(zhǔn)確、靈敏的mcs分析檢測(cè)方法，對(duì)于水產(chǎn)品的質(zhì)量安全與相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作具有著重要意義。目前，對(duì)于各種生物體中mcs的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫(elisa)法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)、液相色譜(lc)法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)法等，其中l(wèi)c-ms/ms方法通量較大，定性能力強(qiáng)，更適用于復(fù)雜基質(zhì)中mcs的殘留檢測(cè)。攪拌棒吸附萃取(sbse)是一種新型的固相微萃取樣品前處理技術(shù)，具有固定相體積大、萃取容量高、無(wú)需外加攪拌子、可避免競(jìng)爭(zhēng)性吸附、能在自身攪拌的同時(shí)實(shí)現(xiàn)萃取富集等優(yōu)點(diǎn)。目前廣泛采用的涂層為非極性的聚二甲基硅氧烷(pdms)，這種涂層結(jié)構(gòu)致密，且高度疏水、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，適用于水相中非極性和弱極性化合物的萃取。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種靈敏度高的蝦夷扇貝中微囊藻毒素的檢測(cè)方法。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種蝦夷扇貝中微囊藻毒素檢測(cè)方法，包括如下步驟：1)、蝦夷扇貝樣品前處理：①、取1g待測(cè)蝦夷扇貝肉進(jìn)行勻漿；②、在漿液中加入10～20ml甲醇后于80±5℃超聲提取20～30min；③、將超聲提取所得物離心(冷凍離心機(jī)離心，即，控制溫度為3～5℃)，取出上層清液；④、以離心所得的沉淀替代步驟②中的漿液重復(fù)上述步驟②～步驟③的超聲提取和離心；⑤、將所有的上層清液合并后用氮?dú)獯蹈桑缓笥?～10ml水復(fù)溶，得樣品液；2)、hlb/pdms涂層攪拌棒的制備：①、將攪拌棒清洗后烘干；②、配制pdms溶膠：將100±5μl聚二甲基硅氧烷(pdms)、100±5μl甲基三甲氧基硅烷(mtms)、10±1μl聚甲基氫硅氧烷(pmhs)和100±5μl95％三氟乙酸(tfa)混合，得pdms溶膠；95％三氟乙酸為由95％三氟乙酸和5％水混合而得，％為體積％；③將步驟①所得的烘干攪拌棒浸入步驟②所得的pdms溶膠(浸入時(shí)間約為5～10min)，取出后在攪拌棒的表面裹上hlb微粒(親水親油平衡微粒，粒徑大小為10μl)，然后于60～80℃干燥(烘箱烘干)24～30h，得hlb/pdms涂層攪拌棒；3)、攪拌棒吸附萃取(攪拌棒吸附萃取樣品中微囊藻毒素)：先將hlb/pdms涂層攪拌棒在甲醇中浸泡20～30min(目的是去除表面的有機(jī)雜質(zhì)，有機(jī)雜質(zhì)指的是合成過(guò)程中使用的各種化合物)，然后置入5～10ml步驟1)所得的樣品液中，加酸調(diào)整ph值為3～7(即，使吸附萃取過(guò)程中萃取環(huán)境的ph值為3～7)，以600～1000rpm富集60～120min；然后取出hlb/pdms涂層攪拌棒放入含有100±20μl乙腈的離心管中超聲10～20min，使樣品中的mcs(微囊藻毒素)解吸附，所得到的解吸附溶液用于液相色譜-質(zhì)譜分析；說(shuō)明：上述用于調(diào)節(jié)ph值的酸是濃度為1～5mol/l的鹽酸溶液；4)、液相色譜-質(zhì)譜條件(利用超高效液相色譜-質(zhì)譜分析定性、定量分析樣品中微囊藻毒素)：色譜柱：watersxselecthsst3(2.1mm×150mm，3.5μm)，流動(dòng)相：a為含0.1％甲酸的乙腈溶液，b為含0.1％甲酸的水溶液；梯度洗脫程序：0～1min，75％b；1～5min，75％～5％b；5～9min，5％b；9～10min，5％～75％b；10～16min，75％b；上述％均為體積％；柱溫40℃，流速0.30ml/min，進(jìn)樣量10μl；離子源為電噴霧離子源，正源模式，離子源溫度500℃，電噴霧電壓5.5kv，霧化氣(gs1)壓力45psi，輔助氣(gs2)壓力65psi，氣簾氣(cur)壓力30psi，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(mrm)模式；7種微囊藻毒素的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)下表1；表1、7種微囊藻毒素的質(zhì)譜參數(shù)注：rr等字母表示微囊藻毒素多肽中兩種可變氨基酸；從而獲得步驟3)所得的解吸附溶液中7種微囊藻毒素的濃度，最終經(jīng)換算獲得蝦夷扇貝樣品7種微囊藻毒素的濃度。作為本發(fā)明的蝦夷扇貝中微囊藻毒素檢測(cè)方法的改進(jìn)：所述步驟1)中，重復(fù)上述步驟②～步驟③的超聲提取和離心的次數(shù)為1～3次。作為本發(fā)明的蝦夷扇貝中微囊藻毒素檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟1)中，超聲為20khz，130w，50％變幅。作為本發(fā)明的蝦夷扇貝中微囊藻毒素檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟2)的①為將攪拌棒依次浸入水、二氯甲烷、1mol/lnaoh和0.1mol/lhcl中清洗(每次浸入的時(shí)間至少為8h)，再用水沖洗，之后放入80～100℃烘箱烘干2～3h。作為本發(fā)明的蝦夷扇貝中微囊藻毒素檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟2)的③中，重復(fù)上述浸入pdms溶膠、取出后在攪拌棒的表面裹上hlb微粒，直至攪拌棒表面被hlb微粒完全包覆。作為本發(fā)明的蝦夷扇貝中微囊藻毒素檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)：步驟3)使用后的hlb/pdms涂層攪拌棒超聲清洗5～10min以便重復(fù)利用。在本發(fā)明步驟1)的樣品前處理中，利用電動(dòng)攪拌器均質(zhì)蝦夷扇貝樣品組織，用探頭式超聲(20khz，130w，50％變幅)提取。在本發(fā)明的步驟3)中，將富集后的攪拌棒取出后，用濾紙擦干表面再將其放入乙腈中超聲。本發(fā)明方法微囊藻毒素的提取效率高，有很好的特異性、準(zhǔn)確度以及重復(fù)性，靈敏度較高，可以對(duì)蝦夷扇貝樣品中的微囊藻毒素進(jìn)行良好的檢測(cè)，以確保公共衛(wèi)生安全。綜上所述，本發(fā)明的方法利用攪拌棒吸附分離蝦夷扇貝中7種微囊藻毒素并利用超高效液相色譜-質(zhì)譜分析對(duì)其定性、定量分析，能高效、精確地提取被測(cè)樣品中的微囊藻毒素，有良好的特異性、準(zhǔn)確度以及重復(fù)性，檢測(cè)靈敏度較高。附圖說(shuō)明下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖1為hlb/pdms涂層攪拌棒表面形貌；(a)為放大倍數(shù)為18倍的掃描電子顯微鏡圖片；(b)為放大倍數(shù)為100倍的掃描電子顯微鏡圖片；(c)為放大倍數(shù)為500倍的掃描電子顯微鏡圖片；圖2為7種微囊藻毒素的總離子流色譜圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。實(shí)施例1、一種蝦夷扇貝中微囊藻毒素檢測(cè)方法，依次進(jìn)行以下步驟：1)、樣品前處理：利用電動(dòng)攪拌器均質(zhì)蝦夷扇貝樣品組織，取1g樣品(蝦夷扇貝肉)進(jìn)行勻漿，加入10ml甲醇，加熱至80℃，并用探頭式超聲(20khz，130w，50％變幅)提取20min。之后用冷凍離心機(jī)離心(4℃、8000rpm離心15min)使固液分離，移出上層清液，并向沉淀中加入10ml甲醇重復(fù)上述的超聲提取、離心操作2次。將3次提取的上清液合并，用氮?dú)獯蹈?，并?0ml水復(fù)溶；得樣品液。2)、攪拌棒制備：①將攪拌棒依次浸入水、二氯甲烷、1mol/lnaoh和0.1mol/lhcl中清洗(每次浸入的時(shí)間至少為8h)，再用水沖洗，之后放入90℃烘箱烘干2h。所述攪拌棒是商品化的外涂層為聚二甲基硅氧烷(pdms)并內(nèi)封一磁芯的玻璃管(10mm×0.5mm)。②將100μl聚二甲基硅氧烷(pdms)、100μl甲基三甲氧基硅烷(mtms)、10μl聚甲基氫硅氧烷(pmhs)和100μl95％三氟乙酸(tfa)混合，制得pdms溶膠。上述95％三氟乙酸(tfa)是指三氟乙酸(tfa)與水按照95：5的體積比進(jìn)行混合。③將步驟①所得的攪拌棒浸入步驟②所得的pdms溶膠中7min，取出后在表面裹上hlb微粒(親水親脂平衡聚合物顆粒，粒徑大小為30μm)，重復(fù)上述浸入、表面包裹步驟直至攪拌棒表面被hlb微粒完全包覆，將其放入65℃烘箱烘干24h。得hlb/pdms涂層攪拌棒。hlb微粒，例如可選用watersoasishlb微粒(30μm)。3)、攪拌棒吸附萃取使用前，將hlb/pdms涂層攪拌棒在甲醇中浸泡20min以去除表面的有機(jī)雜質(zhì)。精確稱量5ml步驟1)所得的樣品液于eppendorf管中，將上述hlb/pdms涂層攪拌棒置于樣品液中，加酸(濃度為1mol/l的鹽酸溶液)調(diào)整ph值至5，以700～800rpm富集60～100min。將攪拌棒取出后，用濾紙擦干表面并將其放入含有100μl乙腈的離心管中超聲(探頭式超聲，20khz，130w，50％變幅)15min，使mcs解吸附，所得到的解吸附溶液可用于液相色譜-質(zhì)譜分析。hlb/pdms涂層攪拌棒需超聲清洗(200w，60hz)5min以便重復(fù)利用。4)、液相色譜-質(zhì)譜條件色譜柱：watersxselecthsst3(2.1mm×150mm，3.5μm)，流動(dòng)相：a為乙腈(含0.1％甲酸)，b為水溶液(含0.1％甲酸)，梯度洗脫程序?yàn)椋?～1min75％b25％a1～5min75％～5％b25％～95％a5～9min5％b95％a9～10min5％～75％b95％～25％a10～16min75％b25％a柱溫40℃，流速0.30ml/min，進(jìn)樣量10μl。離子源為電噴霧離子源，正源模式，離子源溫度500℃，電噴霧電壓5.5kv，霧化氣(gs1)壓力45psi，輔助氣(gs2)壓力65psi，氣簾氣(cur)壓力30psi，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(mrm)模式。7種微囊藻毒素的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。表2、7種微囊藻毒素的質(zhì)譜參數(shù)表3、7種微囊藻毒素的定量曲線方程和定量限說(shuō)明：上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中，x：質(zhì)量濃度(μg/l)；y：峰面積。y為實(shí)驗(yàn)所得峰面積，根據(jù)上表中的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算得到吸附溶液中該化合物的濃度x。因?yàn)榻馕绞窃?00μl乙腈中，所以換算公式為x(μg/l)*100(μl)/0.5(g)即可得到蝦夷扇貝樣品中該化合物濃度。實(shí)驗(yàn)一、步驟1)中，取7種微囊藻毒素原液以各0.1mg加入1ml乙腈中，混合均勻后得到微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品混合液，取該混合液10μl加入1g待測(cè)蝦夷扇貝肉勻漿；注：上述待測(cè)蝦夷扇貝肉是事先已確定的不含7種微囊藻毒素的樣品；步驟3)中，以800rpm富集100min。其余等同于實(shí)施例1。結(jié)果如表4：表4、7種微囊藻毒素的加標(biāo)回收率及精密度(n＝6)對(duì)比例1-1、將實(shí)驗(yàn)一步驟1)中的提取20min改成重復(fù)提取10min；其余等同于實(shí)驗(yàn)一。對(duì)比例1-2、將實(shí)驗(yàn)一步驟1)中的重復(fù)提取2次改成重復(fù)提取0次；其余等同于實(shí)驗(yàn)一。對(duì)比例2、將實(shí)驗(yàn)一步驟2)中的將攪拌棒浸入pdms溶膠中7min改成浸入3min；其余等同于實(shí)驗(yàn)一。對(duì)比例3-1、將實(shí)驗(yàn)一步驟3)中的提取環(huán)境ph值5改成7；其余等同于實(shí)驗(yàn)一。對(duì)比例3-2、將實(shí)驗(yàn)一步驟3)中的富集提取100min改成富集提取30min；其余等同于實(shí)驗(yàn)一。對(duì)比例4-1、將實(shí)驗(yàn)一步驟4)中的特征子離子m/z135.0改為m/z134.0；其余等同于實(shí)驗(yàn)一。對(duì)比例4-2、將實(shí)驗(yàn)一步驟4)中的特征子離子m/z135.0改為m/z136.0；其余等同于實(shí)驗(yàn)一。對(duì)比例4-3、將實(shí)驗(yàn)一步驟4)中mc-rr的去簇電壓72ev改為40ev，mc-yr的去簇電壓66ev改為35ev，mc-lr的去簇電壓42ev改為25ev，mc-la、mc-lf、mc-lw的去簇電壓37ev改為20ev，mc-ly的去簇電壓32ev改為20ev；其余等同于實(shí)驗(yàn)一。對(duì)比例4-4、將實(shí)驗(yàn)一步驟4)中mc-rr的去簇電壓72ev改為90ev，mc-yr的去簇電壓66ev改為85ev，mc-lr的去簇電壓42ev改為60ev，mc-la、mc-lf、mc-lw的去簇電壓37ev改為55ev，mc-ly的去簇電壓32ev改為50ev；其余等同于實(shí)驗(yàn)一。對(duì)比例4-5、將實(shí)驗(yàn)一步驟4)中mc-rr的碰撞電壓50ev改為25ev，mc-yr、mc-lw、mc-ly的碰撞電壓25ev改為15ev，mc-lr、mc-la、mc-lf的碰撞電壓20ev改為10ev；其余等同于實(shí)驗(yàn)一。對(duì)比例4-6、將實(shí)驗(yàn)一步驟4)中mc-rr的碰撞電壓50ev改為60ev，mc-yr、mc-lw、mc-ly的碰撞電壓25ev改為30ev，mc-lr、mc-la、mc-lf的碰撞電壓20ev改為25ev；其余等同于實(shí)驗(yàn)一。采用上述對(duì)比例所述方法所測(cè)得的各微囊藻毒素的回收率如表5所述。表5、各方法所述各微囊藻毒素回收率(％)綜上可見(jiàn)，本發(fā)明的蝦夷扇貝中微囊藻毒素檢測(cè)方法對(duì)于微囊藻毒素的提取效率高，有很好的特異性、準(zhǔn)確度以及重復(fù)性，靈敏度較高，可以對(duì)蝦夷扇貝樣品中的微囊藻毒素進(jìn)行良好的檢測(cè)，以確保公共衛(wèi)生安全。此外，本發(fā)明提出的hlb/pdms涂層攪拌棒吸附萃取及超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法具有很大的潛力，為相關(guān)分析檢測(cè)提供了新的思路。實(shí)驗(yàn)二、將如下表6所述的5種蝦夷扇貝按照實(shí)施例1所述方法進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果如下表6所示。表6、本發(fā)明方法對(duì)每種蝦夷扇貝中各微囊藻毒素含量的檢測(cè)結(jié)果(μg/kg)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)、將實(shí)驗(yàn)二中的5種蝦夷扇貝按照本行業(yè)所公認(rèn)的精度最高的國(guó)標(biāo)法進(jìn)行檢查，所得結(jié)果如表7所示。表7、國(guó)標(biāo)法對(duì)每種蝦夷扇貝中各微囊藻毒素含量的檢測(cè)結(jié)果(μg/kg)實(shí)驗(yàn)三、關(guān)于特異性：步驟1)中，取實(shí)驗(yàn)二中的蝦夷扇貝b組樣品，取7種微囊藻毒素原液與節(jié)球藻毒素原液以各0.1mg加入1ml乙腈中，混合均勻后得到8種毒素標(biāo)準(zhǔn)品混合液，取該混合液10μl加入上述樣品勻漿，步驟3)中，步驟3)中，以800rpm富集100min。其余等同于實(shí)施例1。所得結(jié)果見(jiàn)表8。表8、加入節(jié)球藻毒素后對(duì)于檢測(cè)微囊藻毒素含量的影響(μg/kg)最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12