本發(fā)明涉及一種基于一測多評定量法和指紋圖譜的舒血寧注射液質量控制方法。

背景技術：

舒血寧注射液，擴張血管，改善微循環(huán)。用于缺血性心腦血管疾病，冠心病，心絞痛，腦栓塞，腦血管痙攣等。原料為銀杏葉，輔料為：葡萄糖、乙醇，每2ml舒血寧注射液中含有銀杏葉提取物為7.0mg，其中含總黃酮醇苷1.68mg；含銀杏葉內酯0.28mg。

中藥指紋圖譜是指某種中藥材或中成藥中所共有的、具有特征性的某類或數(shù)類成分的色譜或光譜的圖譜。在現(xiàn)階段，中藥的有效成分絕大多數(shù)沒有明確的情況下，中藥指紋圖譜對于有效控制中藥材或中成藥的質量具有重要的意義。日本漢方藥主要生產企業(yè)在20世紀80年代就已經在企業(yè)內部采用高效液相指紋圖譜控制質量。德國、法國在對銀杏葉提取物聯(lián)合開發(fā)的過程中，發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物的醫(yī)療作用是提取物所得物質群的整體作用結果，而對這一個整體的質量控制，亦采用高效液相指紋圖譜方法。美國最近幾年也明確把指紋圖譜作為混合物群的質量控制方法。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)，作為中醫(yī)理論的實踐產物，中藥，尤其是復方中藥，其中所含的任一種成分都不能代表其整體療效。人們逐漸認識到，現(xiàn)行的參照西藥(合成藥)質量控制模式的質量標準不能恰當?shù)姆从持兴巸仍诘馁|量。從現(xiàn)行的質量控制模式向一種綜合的、宏觀的、可量化的鑒別與主要有效成分含量測定結合已是發(fā)展的趨勢。

《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求》要求將指紋圖譜檢測指標及持續(xù)性要求作為質量標準單列項目，是對現(xiàn)行中藥質量控制標準的有益補充。

一個理想的指紋譜圖不僅能達到定性鑒別的目的，色譜圖中大部分藥譜理應達到基線分離，對大部分成分應可進行定量分析。在沒有對照品的情況下，也可以已知標準品針對其他未知或無標準品的色譜峰進行定量。因此，中藥指紋圖譜是對現(xiàn)行中藥質量標準控制方法的提高。

目前對舒血寧注射液中黃酮醇苷類化合物質量標準的研究，僅停留在采用酸水解，測定槲皮索、山柰素、異鼠李素3個含量，折算成總黃酮醇苷的含量的方法上，對于黃酮醇苷類原型成分的控制為空白。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種測定舒血寧注射液中黃酮醇苷類化合物含量的方法。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種對舒血寧注射液中黃酮醇苷類化合物含量的測定方法的評價方法。

本發(fā)明還有一個目的在于提供一種舒血寧注射液指紋圖譜測定方法。

本發(fā)明的一個技術方案提供了一種測定舒血寧注射液中黃酮醇苷類化合物含量的方法，該方法使用的對照品包括：蘆丁(rutin)、山柰酚-3-o-蕓香糖苷(kgr)、異鼠李素-3-o-蕓香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-ol-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(qrcg)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)。

本發(fā)明的測定舒血寧注射液中黃酮醇苷類化合物含量的方法，該方法包括下述步驟：

(1)對照品溶液的制備：分別精密稱取蘆丁(rutin)、山柰酚-3-o-蕓香糖苷(kgr)、異鼠李素-3-o-蕓香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-ol-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(qrcg)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)對照品適量，加甲醇制成每1ml分別含75μg、70μg、60μg、35μg、75μg、75μg的溶液，作為對照品溶液；

(2)高效液相色譜檢測：分別精密吸取舒血寧注射液與對照品溶液各5-25μl，注入高效液相色譜儀；

其中，所述的液相色譜檢測的條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相a，以0.3％磷酸水溶液為流動相b，梯度洗脫，梯度洗脫過程中，流動相a、b的比例變化為：0-8min，a相13％，b相87％；8-17min，a相13％-16％，b相87％-84％；17-25min，a相16％，b相84％；25-34min，a相16％-20％，b相84％-80％；34-40min，a相20％，b相80％；40-70min，a相20％-37％，b相80％-63％；70-70.01min，a相37％-15％，b相63％-85％；流速0.5-1.5ml/min，檢測波長為360nm，柱溫45-48℃。

優(yōu)選地，其中所述的分別精密吸取舒血寧注射液與對照品溶液各10μl。

優(yōu)選地，其中所述的流速1.0ml/min，檢測波長為360nm，柱溫48℃，理論板數(shù)按蘆丁峰計算應不低于10000。

優(yōu)選地，其中所述的色譜柱為inertsilods-3c18，250×4.6mm、5μm柱；phenomenexgeminic18，5μm、110a、4.6×250mm；inertsilods-3，s-5μm、4.6×250mm中的一種。

黃酮醇苷類化合物含量結果：分別計算蘆丁(rutin)、山柰酚-3-o-蕓香糖苷(kgr)、異鼠李素-3-o-蕓香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-ol-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(qrcg)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)的總量(即計算6個黃酮醇苷的總量)以及山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-ol-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(qrcg)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)3者之和。

本發(fā)明的另一個技術方案提供了一種對舒血寧注射液中黃酮醇苷類化合物含量的測定方法的評價方法，該評價方法包括：依據(jù)相對保留時間確定黃酮醇苷類化合物的峰位置，結合峰面積與相對校正因子分別計算出各黃酮醇苷類化合物的含量。

本發(fā)明中的評價方法包括：相對校正因子重現(xiàn)性的考察和相對保留時間的考察。

本發(fā)明中所述的相對校正因子重現(xiàn)性考察包括：不同人員的考察、不同色譜柱的考察、不同儀器的考察。

本發(fā)明中相對校正因子的測定：多點相對校正因子的計算，分別精密吸取對照品溶液(含rutin0.1996mg/ml，kgr0.2184mg/ml，igr0.1757mg/ml，krg0.1085mg/ml，qrcg0.2258mg/ml，krcg0.2181mg/ml)2μl、4μl、6μl、8μl、10μl，注入液相色譜儀，以蘆丁為內標物質，計算相對校正因子；

不同人員的考察：不同實驗人員，配制相近濃度對照品溶液，比較相對校正因子，結果重現(xiàn)性良好，rsd<5％；

不同儀器的考察：采用方法學研究所用的3臺實驗儀器測定同一對照品溶液的相對校正因子，并比較相對校正因子，結果重現(xiàn)性良好，rsd<5％。

不同色譜柱的考察：采用方法學研究的3根色譜柱測定同一對照品溶液的相對校正因子，并比較相對校正因子，結果重現(xiàn)性良好，rsd<5％；

對相對校正因子影響較大的是實驗人員操作和不同儀器的誤差，因此本研究將測得的所有校正因子匯總，rsd<5％，故將平均值其作為相對較正因子的測定值。

本發(fā)明中所述的相對保留時間的考察包括：精密度實驗、穩(wěn)定性試驗、重復性實驗、耐用性試驗。

精密度試驗：精密吸取同一供試品溶液連續(xù)進樣6次，kgr、igr、krg、qrcg、krcg保留時間相對rutin保留時間的比值rsd小于2％；

穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、8、16、24小時，按照上述方法測定，結果表明，供試品溶液kgr、igr、krg、qrcg、krcg保留時間相對rutin保留時間的比值在24小時內基本穩(wěn)定，rsd小于2％；

重復性試驗：按本發(fā)明提供的測定方法，對同一批號樣品，6份進行測定，結果kgr、igr、krg、qrcg、krcg保留時間相對rutin保留時間的比值rsd小于2％；

耐用性試驗：將同一對照品溶液采用3根色譜柱、3臺儀器測定相對保留時間，測定方法相對保留時間穩(wěn)定，不同儀器、色譜柱比較rsd小于5％。

本發(fā)明中所述的相對保留時間的測試以蘆丁(rutin)對照品為參照，以其相應的峰為s峰，計算山柰酚-3-o-蕓香糖苷(kgr)、異鼠李素-3-o-蕓香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-ol-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(qrcg)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)的相對保留時間，其相對保留時間應在規(guī)定值的±5％范圍之內。

本發(fā)明再有一個技術方案提供了一種舒血寧注射液指紋圖譜測定方法，該方法采用高效液相色譜法，所述的液相色譜檢測的條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相a，以0.3％磷酸水溶液為流動相b，梯度洗脫，梯度洗脫過程中，流動相a、b的比例變化為：0-8min，a相13％，b相87％；8-17min，a相13％-16％，b相87％-84％；17-25min，a相16％，b相84％；25-34min，a相16％-20％，b相84％-80％；34-40min，a相20％，b相80％；40-70min，a相20％-37％，b相80％-63％；70-70.01min，a相37％-15％，b相63％-85％；流速0.5-1.5ml/min，檢測波長為360nm，柱溫45-48℃。

其中，所述的指紋圖譜測定方法，其特征在于各色譜譜相似度不低于0.90，各峰峰面積的rsd均<2％。

與傳統(tǒng)測定方法相比一測多評法解決了中藥多成分定量和多指標質量控制中存在的對照品缺乏問題，在降低檢測成本的同時實現(xiàn)了多指標同步質量控制反映中藥產品質量。而基于指紋圖譜的一測多評法優(yōu)勢在于只有既符合指紋圖譜相似度要求又符合含量要求雙重標準的產品才是合格產品，對于控制不同批次產品間的質量一致性具有重要意義。

本發(fā)明該方法以蘆丁為對照品通過一測多評法定量舒血寧注射液中黃酮醇苷類化合物山柰酚-3-o-蕓香糖苷、異鼠李素-3-o-蕓香糖苷、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-對羥基反式桂皮酰)葡萄糖苷、山柰酚-3-o-鼠李糖9-o-6-o-(對羥基反式桂皮酰)葡萄糖苷，并通過指紋圖譜控制舒血寧注射液批間質量穩(wěn)定性。本發(fā)明解決了舒血寧注射液多成分定量和多指標質量控制中存在的對照品缺乏問題，同時通過指紋圖譜控制產品批間質量穩(wěn)定性保障了舒血寧注射液的質量。本發(fā)明所提供的黃酮醇苷類化合物含量測定方法快速、簡單、靈敏度高、精密度高，穩(wěn)定性好。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中的混合對照品液相色譜圖；

圖2為本發(fā)明實施例1中的樣品液相色譜圖；

圖3為本發(fā)明實驗例1的樣品指紋圖譜自身比較(樣品1-10)。

具體實施方式

下述為實施例和實驗例中使用的儀器與試劑、試藥：

(1)儀器

高效液相色譜儀：waters2689高效液相色譜儀

(2)色譜柱

inertsilods-3，5μm、4.6×250mm

(3)對照品

①蘆丁(rutin)使用前不需干燥處理，供hplc法測定，含量為90.5％，由中國藥品生物制品檢定所提供(供含量測定用批號100080-200707)。

②山柰酚蕓香糖苷(kaempferolrutinoside，kgr)的純度為98.09％。

③異鼠李素蕓香糖苷(isorhmnetinrutinoside，igr)的純度為98.05％。

④山柰酚葡萄糖鼠李糖苷(kaempfero3-o-2″-glucosylrhamnoside，krg，0.0336mg/ml)的純度為96.97％。

⑤槲皮素對香豆?；咸烟鞘罄钐擒?quercetin3-o-2″-(6″-p-courrlaroyl)glucosylrhamnoside，qrcg)的純度為98.01％。

⑥山柰酚對香豆?；咸烟鞘罄钐擒?kaempfero13-o-2″-(6″-p-coumaroyl)glucosylrhamnosidc，krcg)的純度為89.41％。

(4)樣品

舒血寧注射液樣品編號依次為樣品1-13。

(5)試劑與試藥

乙腈為色譜純；磷酸為優(yōu)級純；其它試劑均為分析純；水為超純水。

實施例1

舒血寧注射液黃酮醇苷類化合物的含量檢測方法

(1)對照品溶液的制備：分別精密稱取蘆丁(rutin)、山柰酚-3-o-蕓香糖苷(kgr)、異鼠李素-3-o-蕓香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-ol-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(qrcg)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)對照品適量，加甲醇制成每1ml分別含75μg、70μg、60μg、35μg、75μg、75μg的溶液，作為對照品溶液；

(2)高效液相色譜檢測：分別精密吸取舒血寧注射液與對照品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀；

其中，所述的液相色譜檢測的條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相a，以0.3％磷酸水溶液為流動相b，梯度洗脫，梯度洗脫過程中，流動相a、b的比例變化為：0-8min，a相13％，b相87％；8-17min，a相13％-16％，b相87％-84％；17-25min，a相16％，b相84％；25-34min，a相16％-20％，b相84％-80％；34-40min，a相20％，b相80％；40-70min，a相20％-37％，b相80％-63％；70-70.01min，a相37％-15％，b相63％-85％；流速1.0ml/min，檢測波長為360nm，柱溫48℃，見圖1、2。

實施例2

舒血寧注射液黃酮醇苷類化合物的含量檢測方法

(1)對照品溶液的制備：分別精密稱取蘆丁(rutin)、山柰酚-3-o-蕓香糖苷(kgr)、異鼠李素-3-o-蕓香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-ol-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(qrcg)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-對羥基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)對照品適量，加甲醇制成每1ml分別含75μg、70μg、60μg、35μg、75μg、75μg的溶液，作為對照品溶液；

(2)高效液相色譜檢測：分別精密吸取舒血寧注射液與對照品溶液各25μl，注入高效液相色譜儀；

其中，所述的液相色譜檢測的條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相a，以0.3％磷酸水溶液為流動相b，梯度洗脫，梯度洗脫過程中，流動相a、b的比例變化為：0-8min，a相13％，b相87％；8-17min，a相13％-16％，b相87％-84％；17-25min，a相16％，b相84％；25-34min，a相16％-20％，b相84％-80％；34-40min，a相20％，b相80％；40-70min，a相20％-37％，b相80％-63％；70-70.01min，a相37％-15％，b相63％-85％；流速0.5ml/min，檢測波長為360nm，柱溫45℃。

實驗例1

舒血寧注射液指紋圖譜檢測方法測試結果

使用實施例2中的檢測方法，測定了13批次樣品的相似度，結果均符合現(xiàn)行標準規(guī)定的限度相似度不低于0.90，說明該廠家生產的舒血寧注射液樣品較為穩(wěn)定，測定結果見表1，指紋圖譜見圖3。

表1指紋圖譜測定結果

實驗例2

舒血寧注射液中六種黃酮醇苷的線性關系考察

分別精密吸取對照品溶液含rutin0.1996mg/ml，kgr0.2184mg/ml，igr0.1757mg/ml，krg0.1085mg/ml，qrgg0.2258mg/ml，krcg0.2181mg/ml各2μl、4μl、6μl、8μl、10μl，注入液相色譜儀，色譜測試條件按照實施例1中的測試條件，記錄色譜圖，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，計算回歸方程。結果見表2～8。

表2rutin線性關系考察

表3kgr線性關系考察

表4igr線性關系考察

表5krg線性關系考察

表6qrcg線性關系考察

表7krcg線性關系考察

表86種黃酮成分線性關系考察

實驗例3

精密度試驗

精密吸取同一樣品3，連續(xù)進樣6次，rutin、kgr、kgr、krg、qrcg、krcg峰面積的rsd小于2％，按實施例1方法測定，結果表明該方法精密度良好，見表9。又以第1次進樣所得指紋圖譜做為對照計算后5次進樣所得指紋圖譜的相似度，結果相似度均大于0.99，結果表明該方法精密度良好。

表9精密度試驗

實驗例4

穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一樣品3，分別于配制后0h、2h、4h、8h、16h、24h，按實施例1方法測定，結果表明，供試品溶液在24h內基本穩(wěn)定，峰面積的rsd小于2％，結果見表10，又以第0h進樣所得指紋圖譜做為對照計算之后進樣所得指紋圖譜的相似度，結果相似度均大于0.99，結果表明該方法穩(wěn)定性良好。

表10穩(wěn)定性試驗

實驗例5

重復性試驗

精密吸取同一樣品3，連續(xù)進樣6次，按實施例1方法測定，結果表明該方法測試血寧注射液中黃酮醇苷類化合物含量，見表11。又以第1次進樣所得指紋圖譜做為對照計算后5次進樣所得指紋圖譜的相似度，結果相似度均大于0.99，結果表明該方法重復性良好。

表11重復性試驗

實驗例6

準確度及范圍試驗

采用加樣回收法，①精密稱吸取已知含量的同一批樣品3(rutin含量為0.06251mg/ml，kgr含量為0.05612mg/ml，igr含量為0.05628mg/ml，krg含量為0.03717mg/ml，qrcg含量為0.08003mg/ml，krcg含量為0.07129mg/ml)0.5ml及混合對照品溶液(含rutin0.07760mg/ml，kgr0.07153mg/ml，igr0.05992mg/ml，krg0.03547mg/ml，qrcg0.07824mg/ml，qrcg0.07871mg/ml0.5ml，置同一2ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；②精密稱吸取已知含量的同一批樣品1.0ml及上述混合對照品1.0ml，混勻；③精密稱吸取上述混合對照品2.0ml，蒸干，精密加入同一批樣品2ml，使溶解，平行制備3份，依法測定，結果表明本方法具有良好的準確度。

實驗例7

耐用性考察

采用3批次樣品(樣品1、2、3)分別用3種色譜柱(①inertsilods-3，5μm、4.6×250mm，②phenomenexgeminic18，5μm、110a、4.6×250mm，③inertsilods-3，s-5μm、4.6×250mm)對其6種黃酮醇苷類化合物的含量進行了測定，結果見表12。

表12分別用3種液相色譜柱測定樣品1中黃酮醇苷類化合物含量的測定結果(mg/ml)

結果表明，上述6種成分使用不同品牌色譜柱，均能獲得較好的分離，且測定結果基本一致，說明本發(fā)明提供的測定方法有較好的耐用性。