本發(fā)明涉及醫(yī)學檢測技術領域，特別涉及一種穩(wěn)定的β2微球蛋白溶液、其制備方法及應用。
背景技術：
β2微球蛋白(β2-microglobulin，簡稱β2-mg)是由瑞典科學家berggard1968年首次從尿中分離純化出來，分子量11800，等電點5.7，因電泳在β2區(qū)帶而得名。β2-mg是一種小分子球狀結構蛋白，存在于有核細胞的表面，與mhci和cd1等蛋白質復合物結合在一起，對于蛋白質的運輸和免疫反應的識別具有重要的作用。β2-mg可從細胞中排出以單體的形式存在于血液和尿液中，通常以較低的濃度水平存在。糖尿病患者或者高血壓患者常常出現(xiàn)腎臟損傷的并發(fā)癥，腎臟回收和代謝功能下降，血液和尿液中β2-mg會出現(xiàn)異常上升。因此，糖尿病和高血壓患者血液和尿液中的β2-mg含量的上升經(jīng)常預示著早期腎臟功能的損傷。血液中β2-mg的水平升高也可能是病毒性感染、骨髓瘤、骨髓增生等疾病導致。臨床上檢測血液或尿中的β2-mg濃度為臨床腎功能測定、腎移植成活、糖尿病腎病、重金屬鎘、汞中毒以及某些惡性腫瘤的臨床診斷提供早期、可靠和靈敏的指標。腦脊液中β2-mg的檢測對腦膜白血病的診斷也有特別的意義。
目前，β2-mg含量的測定主要采用免疫比濁法或膠乳增強免疫比濁法，試劑通常為液體雙試劑，在醫(yī)院即開即用。而β2-mg的校準品常常為凍干粉，需要添加生理鹽水現(xiàn)配現(xiàn)用。醫(yī)院檢驗科為非潔凈環(huán)境，配制試劑容易引入污染，造成蛋白質降解。而且，校準品溶解后，需要進行梯度稀釋制備至少6個濃度水平的溶液，用于多點定標。校準品經(jīng)生理鹽水多次稀釋后穩(wěn)定性很差，無法長期存放，下次定標時需重新進行配制，費時費力，且價格昂貴、浪費嚴重。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是克服上述技術缺陷，提供一種穩(wěn)定的β2微球蛋白溶液，該溶液應用于校準品的制備可長期存放，多次使用，提高臨床β2-mg含量的測定的效率，降低檢測成本。
本發(fā)明一種穩(wěn)定的β2微球蛋白溶液，包括檢測用濃度水平的β2微球蛋白、good’s緩沖液、氯化鈉、甘油、牛血清白蛋白、穩(wěn)定劑、防腐劑和蛋白酶抑制劑，所述good’s緩沖液ph值為7.5至9.0，所述氯化鈉濃度20～250mmol/l。作為一種優(yōu)選方式，good’s緩沖液為三羥甲基甲胺基丙磺酸(taps)或者4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes)。
作為一種優(yōu)選方式，所述甘油的體積百分比濃度為5％～25％。
作為一種優(yōu)選方式，牛血清白蛋白的濃度為0.5～5g/l。
作為一種優(yōu)選方式，所述穩(wěn)定劑為濃度范圍5～250mmol/l天冬氨酸鎂、5～250mmol/l甘氨酸、5～250mmol/l丙氨酸中的一種或一種以上。
作為一種優(yōu)選方式，防腐劑為質量百分比濃度為0.05％～0.2％的疊氮鈉，或者proclin300。
作為一種優(yōu)選方式，蛋白酶抑制劑為濃度為0.5～2mmol/l的苯甲基磺酰氟pmsf、濃度為0.5～5mmol/l的edta中的一種或兩種。
作為一種優(yōu)選方式，上述β2微球蛋白溶液中還含有表面活性劑，所述表面活性劑為終濃度為0.1～5mmol/l的膽酸鈉,或0.5-2％的脂肪醇聚氧乙烯醚aeo7。
作為一種優(yōu)選方式，上述β2微球蛋白溶液中還含有賦形劑，所述賦形劑為濃度為0.1～10g/l聚乙二醇peg6000。
上述β2微球蛋白溶液的制備方法，包括以下步驟：β2微球蛋白為人源，濃度根據(jù)質控和校準品的要求進行配制，按照配方組成稱量各組分，用純凈水溶解，溶液配制完成后用0.2μm孔徑濾膜過濾除菌，在無菌環(huán)境下(如生物安全柜中)分裝、封蓋，并在4℃條件下保存。
上述β2微球蛋白溶液用于組織樣品中β2微球蛋白含量檢測的校準品或/和質控品，多個濃度梯度成品組成一個診斷試劑盒標中的校準品或/和質控品。例如可以將β2微球蛋白溶液的濃度梯度設置為8mg/l、6mg/l、2mg/l、0.6mg/l、0.2mg/l等，可以放置4℃冰箱中穩(wěn)定保存一年，開瓶穩(wěn)定保存一個月。
本發(fā)明穩(wěn)定的β2微球蛋白溶液可改變現(xiàn)有β2微球蛋白的校準品和質控品凍干保存，使用時現(xiàn)用現(xiàn)配的局面，可有效降低產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，在使用時無需添加生理鹽水，簡化操作，更能降低引入污染而造成蛋白降解的風險。每個濃度的水平校準品從高值到低值都能保證穩(wěn)定1年以上，開瓶穩(wěn)定性達到一個月。每次定標結束后，冷藏可繼續(xù)使用，極大避免了試劑的浪費。
附圖說明
圖1為本發(fā)明β2微球蛋白溶液定標與朗道校準品(bm1362)定標結果比較。
具體實施方式
實施例1
1.以ph8.0的good’s緩沖液、nacl150mmol/l、甘油10％、牛血清白蛋白2g/l、疊氮鈉0.1％和β2-mg2.0mg/l作為基礎配方a，在基礎配方a基礎上增加穩(wěn)定劑等，考察在4℃條件下保存12個月后各配方中β2-mg測試值的改善效果。尿微量β2-mg的測定采用寧波瑞源生物科技有限公司的β2-微球蛋白測定試劑盒(膠乳增強免疫比濁法)，生化儀器采用奧林巴斯au400。根據(jù)說明書進行設置，主波長546nm，試劑r1240μl添加樣本3μl后混勻孵育5分鐘后加入r2混勻孵育10秒鐘讀取吸光度a1，3分鐘后讀取吸光度a2。以多點校準品濃度和相應吸光度變化值(δa＝a2-a1)建立標準曲線，再測試樣本值?；A配方a在12個月后β2-mg的剩余量為0.67mg/l,為初始值的33.5％。添加穩(wěn)定劑12個月后，β2-mg測試值相對于配方a的水平變化如表1所示。
表1：配方中穩(wěn)定劑等及濃度對β2-mg在溶液中，4℃條件下保存12個月穩(wěn)定性的影響。
在本實施例中對膽酸鈉、天冬氨酸鎂、丙氨酸、甘氨酸、pmsf、edta和peg6000對β2-mg在溶液中的穩(wěn)定性進行了考察。丙氨酸、甘氨酸等氨基酸被添加在很多蛋白質溶液中作為穩(wěn)定劑使用，pmsf能夠抑制配方中可能存在的蛋白酶，避免其對β2-mg的水解作用。edta同樣具有抑制蛋白酶的作用，同時也能螯合重金屬，避免重金屬對蛋白質的損傷。加入一定比例的聚乙二醇(peg6000)起到了穩(wěn)定試劑的作用。聚乙二醇是多羥基化合物，能形成很多氫鍵，有助于形成“溶劑層”，增加表面張力和溶液黏度，使蛋白質有效脫水而降低蛋白質水解作用。本實施例中含有peg6000的配方相對于不含peg6000，可以使β2-mg一年的穩(wěn)定性提高2.3-5.6％。天冬氨酸鎂中mg2+離子對于β2-mg的穩(wěn)定性具有重要的作用，采用天冬氨酸鎂可以讓β2-mg的一年穩(wěn)定性提高4.1-11.3％。
實施例2
以優(yōu)選配方：good’s緩沖液(pipes50mmol/l，ph8.0)、nacl150mmol/l、膽酸鈉0.5mmol/l、天冬氨酸鎂50mmol/l、丙氨酸50mmol/l、甘氨酸50mmol/l、甘油10％、牛血清白蛋白2g/l、pmsf1mmol/l、edta1mmol/l、疊氮鈉0.1％、peg60002g/l，β2-微球蛋白濃度分別為0.2mg/l、2mg/l和18mg/l進行穩(wěn)定性對比分析。
本實施例中對配制試劑的開瓶穩(wěn)定性、長效穩(wěn)定性進行考察。
一、使用寧波瑞源生物科技有限公司的β2-微球蛋白測定試劑盒(膠乳增強免疫比濁法)中定標液定標，對上述方法所配置3個濃度水平的樣本(濃度分別0.2mg/l、2mg/l和18mg/l)每次測定10次，取平均值，計算相對偏差。作為對比某廠家凍干粉加生理鹽水稀釋成18mg/l的濃度，并用生理鹽水繼續(xù)稀釋成2mg/l和0.2mg/l兩個濃度。
結果分析：根據(jù)檢測數(shù)據(jù)，計算測定值均值、相對偏差。
表2本發(fā)明優(yōu)選配方與生理鹽水溶解凍干粉的開瓶穩(wěn)定性檢測結果
表2結果顯示，用生理鹽水溶解的干粉在1個月后即出現(xiàn)明顯的下降，尤其是低值，由于生理鹽水的進一步稀釋，凍干粉中穩(wěn)定劑的比例相應下降，起不到穩(wěn)定作用而造成。而本發(fā)明方法制作的樣本表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，2個月內(nèi)無論高值還是中低值的變化都小于5％，而1個月內(nèi)只有不超過0.5％的下降，表明試劑在開瓶后非常穩(wěn)定，準確性良好，為測試人員提供了方便快捷的檢測試劑。
二、對本發(fā)明優(yōu)選配方長效穩(wěn)定性測試
對本發(fā)明優(yōu)選配方在低、中、高三個濃度(0.2mg/l、2mg/l和18mg/l)進行長期穩(wěn)定性考察，樣品在4℃保存。
表3本發(fā)明優(yōu)選配方穩(wěn)定性考察結果：
表3結果顯示，本發(fā)明穩(wěn)定的β2微球蛋白溶液一年內(nèi)表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，從低值到到高值，濃度的變化都不超過2％，完全滿足診斷試劑盒的技術要求(一般精密度允許5％的相對偏差)。
實施例3
β2-mg校準品的準確性分析
以本實施例以發(fā)明穩(wěn)定的β2微球蛋白溶液作為校準品定標，測試臨床100例血清，再以朗道校準品(bm1362)定標，測試該100例樣本。兩組結果進行比對，如圖1所示。本發(fā)明定標液與朗道定標液具有相同的準確性。