本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)方法，具體涉及一種基于自制銀絲基底的食品中合成著色劑新紅的表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

合成著色劑因其色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉，成為食品工業(yè)常用的添加劑之一，它們主要是以苯、甲苯、萘等芳烴類化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過磺化、硝化、鹵化、偶氮化一系列有機(jī)反應(yīng)化合而成，大多具有一定的毒性。其中的偶氮類合成著色劑，在體內(nèi)可被還原為芳香胺類物質(zhì)，從而對(duì)dna造成損傷、使肝細(xì)胞生長(zhǎng)異常、影響酯酶同工酶的表達(dá)以及致突變作用等，因此多數(shù)偶氮類色素已被禁止添加到食物中。新紅為水溶性偶氮類合成著色劑，我國gb2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定了其使用限量為0.05g/kg-0.1g/kg，歐盟等國則嚴(yán)禁使用新紅。

目前，食品中新紅的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、極譜法、分光光度法等。但是，以上檢測(cè)方法前處理操作較為復(fù)雜、耗時(shí)，儀器成本昂貴，且所用溶劑、流動(dòng)相具有較大的毒性和腐蝕性等缺點(diǎn)，難于普及推廣。因此，探索快速、簡(jiǎn)便、高效的食品色素檢測(cè)方法，建立有效的安全監(jiān)控體系，具有非常緊迫的現(xiàn)實(shí)意義。

拉曼光譜和紅外光譜一樣同屬于分子振動(dòng)光譜，可以反映分子的特征結(jié)構(gòu)。但是拉曼散射效應(yīng)是個(gè)非常弱的過程，要對(duì)表面吸附物種進(jìn)行拉曼光譜研究幾乎都要利用某種增強(qiáng)效應(yīng)。自從表面増強(qiáng)拉曼效應(yīng)被人們發(fā)現(xiàn)之后，金屬納米顆粒就作為一類sers基底被廣泛的研究，懸浮液中的金屬納米顆粒是sers基底的最重要的材料之一，然而溶液中的納米顆粒聚集會(huì)帶來重復(fù)性差的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種食品中新紅的快速檢測(cè)方法。該方法直接采用自制的表面具有多孔納米銀結(jié)構(gòu)的表面增強(qiáng)拉曼基底對(duì)目標(biāo)物新紅進(jìn)行萃取和原位表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，便于攜帶、存放，可用于現(xiàn)場(chǎng)快速監(jiān)測(cè)。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種食品中新紅的快速檢測(cè)方法，其特征是，包括以下步驟：

(1)樣品制備：待測(cè)樣品經(jīng)超聲提取、陰離子固相萃取小柱凈化處理，提取物用水溶解后經(jīng)微孔膜過濾，得到待測(cè)液；

(2)表面增強(qiáng)拉曼基底的制備：將銀絲依次浸入有機(jī)溶劑、超純水、酸溶液中進(jìn)行表面處理；以經(jīng)表面處理的銀絲為工作電極，采用電化學(xué)池在-0.2v～0.2v電位范圍內(nèi)進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)使銀絲表面生成均一多孔納米銀，即得到具有均一多孔納米銀結(jié)構(gòu)的表面增強(qiáng)拉曼銀絲基底；

(3)測(cè)試：將表面增強(qiáng)拉曼銀絲基底浸入待測(cè)液中靜置萃取，然后置于載體上進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜測(cè)試；

(4)定性：經(jīng)表面增強(qiáng)拉曼光譜測(cè)試，與新紅的標(biāo)準(zhǔn)拉曼光譜數(shù)據(jù)對(duì)比，當(dāng)507，626，1113，1220，1280，1371，1492，1592cm^-1處存在明顯的新紅特征拉曼峰時(shí)，則樣品中含有新紅；

(5)定量：以1592cm^-1處的特征拉曼峰作為定量峰，根據(jù)新紅的拉曼光譜信號(hào)的響應(yīng)強(qiáng)度與含量的線性比例關(guān)系得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，從而對(duì)樣品中的新紅進(jìn)行快速定量檢測(cè)。

本發(fā)明步驟(1)中超聲提取為：將樣品置于離心管中，加入超純水，于50-70℃水浴超聲提取10-30min，于離心機(jī)中4000r/min離心5-15min，移取上清液用檸檬酸水溶液調(diào)試ph值至3-6，得待凈化溶液用于固相萃取。

上述樣品根據(jù)實(shí)際使用過程中的形態(tài)，一般可以分為固體樣品和飲料，對(duì)于不同的制品在超聲提取前需要經(jīng)過一定的預(yù)處理步驟，具體如下：a、待測(cè)樣品為固體：先粉碎、攪拌均勻；b、待測(cè)樣品為飲料：含二氧化碳的樣品需超聲除去二氧化碳，含果肉的樣品需搖勻。

所述步驟(1)的陰離子固相萃取小柱凈化處理為：

a、固相萃取小柱的組裝：取40-60μm陰離子交換填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上端再以聚乙烯篩板固定；

所述的陰離子交換填料為選自丙基乙二胺(psa)、聚酰胺(pa)、多胺化聚苯乙烯二乙烯苯共聚物(pwax)填料中的至少一種；

b、柱活化：將上述固相萃取小柱依次用ph值6-7的水、甲醇活化；

c、加樣淋洗：轉(zhuǎn)移上述待凈化液至固相萃取小柱，依次用ph值3-6的水、甲醇淋洗spe柱；

d、洗脫：低真空吹干spe柱，用氨化甲醇洗脫待分析成分并接收，收集液于50℃氮?dú)獯蹈桑盟ㄈ?，渦流混合后過0.22μm濾膜，供sers分析。

本發(fā)明步驟(2)的銀絲直徑為0.3-1mm，長(zhǎng)度為1-8cm。

本發(fā)明步驟(2)的有機(jī)溶劑為丙酮、正己烷或乙醇中的一種或幾種。

本發(fā)明步驟(2)的酸溶液為0.1m硝酸或鹽酸。

本發(fā)明步驟(2)的電化學(xué)池為三電極，銀絲為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鈦桶電極為輔助電極。優(yōu)選自制的三電極電化學(xué)池。

本發(fā)明包含有上述三電極電化學(xué)池的電化學(xué)制備裝置，包括鐵架臺(tái)、電化學(xué)池和與電化學(xué)池相連的電化學(xué)工作站，電化學(xué)池包括參比電極、輔助電極、工作電極、玻璃容器；其特征是，還包括用于固定電極的固定支架；在所述的鐵架臺(tái)上設(shè)置有用于控制工作電極在電化學(xué)池里的深度的升降機(jī)構(gòu)；

升降機(jī)構(gòu)包括齒輪、微型電機(jī)、控制器、升降桿、設(shè)置在升降桿上的高度傳感器、夾持架、操作屏；在升降桿上均勻設(shè)置有凹槽；所述的控制器的控制端與微型電機(jī)相連，微型電機(jī)的轉(zhuǎn)軸與齒輪相連，齒輪的齒牙與升降桿的凹槽相嚙合；夾持架與升降桿相固定；操作屏固定在鐵架臺(tái)上，高度傳感器和操作屏分別與控制器相連；

所述的輔助電極為鈦制成的筒壁狀電極，筒壁狀電極與電化學(xué)池的玻璃容器的內(nèi)壁緊密結(jié)合；在筒壁狀電極的頂部邊緣延伸出一把手(鈦制)，所述的把手與電化學(xué)工作站電連接。

進(jìn)一步地，所述的控制器包括stc11f60xe單片機(jī)。

進(jìn)一步地，在工作電極的頂部夾有一導(dǎo)電夾，導(dǎo)電夾通過銅絲與電化學(xué)工作站相連。

進(jìn)一步地，所述的固定支架和夾持架采用絕緣材料。

優(yōu)選的，所述步驟(2)表面增強(qiáng)拉曼基底的制備：將直徑為0.3-1.0mm的銀絲裁剪成1-8cm，依次浸入丙酮、乙醇、超純水、0.1m硝酸中進(jìn)行表面處理，最后超純水清洗、干燥備用；電化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用自制的三電極電化學(xué)工作池，銀絲為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，大面積鈦桶電極為輔助電極，0.1m鹽酸為電解液、在-0.2v～0.2v電位范圍內(nèi)以5-100mv/s的速度進(jìn)行10-20次電化學(xué)反應(yīng)，制備具有均一多孔納米銀結(jié)構(gòu)的表面增強(qiáng)拉曼銀絲基底，制備好的銀絲清洗、干燥備用；

所述步驟(3)萃取時(shí)間為1-5分鐘。

所述的載體為玻璃片或鈦片。

所述的儀器參數(shù)條件如下：拉曼光譜儀發(fā)射激光波長(zhǎng)為785nm，固定激光功率為100-200mw，掃描范圍2000～300cm^-1，積分時(shí)間為2-10s，每個(gè)點(diǎn)掃描5次取平均值。

所述步驟(4)標(biāo)準(zhǔn)拉曼光譜為：用gaussianw03程序理論計(jì)算、輔助標(biāo)準(zhǔn)樣品拉曼測(cè)試兩種手段獲取新紅的標(biāo)準(zhǔn)拉曼光譜。

本發(fā)明采用電化學(xué)粗糙法，將銀絲電極放置在電解質(zhì)溶液中并施加一定的電化學(xué)信號(hào)，使銀絲電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，進(jìn)而讓銀絲電極表面生成多孔納米銀，通過納米顆粒均勻分布在銀絲上，克服了溶液中的納米顆粒聚集會(huì)帶來重復(fù)性差的問題。同時(shí)本發(fā)明的輔助電極為鈦制筒壁狀結(jié)構(gòu)，與玻璃容器內(nèi)壁緊密貼合，且?guī)б话咽峙c電化學(xué)工作站電連接，可保證金屬電極表面的橫向、徑向均勻腐蝕，克服了傳統(tǒng)的輔助電極難以保證表面增強(qiáng)拉曼金屬基底軸向和徑向反應(yīng)的均勻性。本發(fā)明通過升降機(jī)構(gòu)自動(dòng)控制工作電極進(jìn)入液體的深度，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，減小誤差。本發(fā)明工作電極通過一導(dǎo)電夾與電化學(xué)工作站連接，能適應(yīng)多種狀態(tài)的工作電極，且代替了傳統(tǒng)電化學(xué)反應(yīng)中工作電極的液面以上部分，大大提高了粗糙金屬電極的產(chǎn)出率。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明采用自制的三電極電化學(xué)池，可以制得橫向、徑向均勻的多孔納米銀結(jié)構(gòu)的表面增強(qiáng)拉曼銀絲基底；由于多孔納米銀是在銀絲表面生成的，軸向徑向均勻可以保證檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性，克服了現(xiàn)有不使用載體時(shí)懸浮液中的納米顆粒聚集帶來的重復(fù)性差的問題；

(2)自制的穩(wěn)定、均一、多孔納米銀結(jié)構(gòu)的表面增強(qiáng)拉曼銀絲基底可對(duì)目標(biāo)物新紅進(jìn)行選擇性萃取和原位表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)，表面富集新紅色素的陽性萃取絲可穩(wěn)定保存6個(gè)月以上，便于復(fù)檢；

(3)理論計(jì)算輔助標(biāo)準(zhǔn)樣品拉曼測(cè)試多手段獲取新紅的標(biāo)準(zhǔn)拉曼光譜數(shù)據(jù)，以對(duì)實(shí)際樣品中目標(biāo)物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性、定量檢測(cè)。

本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，表面增強(qiáng)拉曼基底成本低，便于攜帶、存放，可用于現(xiàn)場(chǎng)快速監(jiān)測(cè)。

附圖說明

圖1為循環(huán)伏安曲線，其中(a)i-e曲線，(b)e-t曲線，(c)q-t曲線及(d)i-t曲線，掃描速度為25mv/s，掃描圈數(shù)為15次；

圖2為不同掃描速度制備的多孔銀納米結(jié)構(gòu)sem圖(插圖為粒徑統(tǒng)計(jì)直方圖)，其中(a)5mv/s，(b)10mv/s，(c)25mv/s，(d)50mv/s，(e)75mv/s，(f)100mv/s，掃描范圍-0.2～0.2v，循環(huán)數(shù)15次；

圖3為銀絲基底的xrd圖和eds圖，其中(a)為銀絲基底的xrd圖，(b)多孔銀絲的eds選區(qū)形貌圖，(c)選區(qū)內(nèi)元素eds光電子能譜圖；

圖4為新紅的分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化圖；

圖5為新紅的理論計(jì)算拉曼光譜(a)和固體標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)拉曼光譜(b)的比較；

圖6為銀絲基底萃取2.0×10^-5m新紅在萃取時(shí)間1分鐘的sers光譜圖；

圖7為銀絲基底萃取2.0×10^-5m新紅的吸附時(shí)間平衡趨勢(shì)圖；

圖8為不同濃度(自上往下濃度分別為：2×10^-4m、1×10^-4m、2×10^-5m、1×10^-5m、5×10^-6m、2.5×10^-6m、1×10^-6m、5×10^-7m、2.5×10^-7m、5×10^-8m)新紅標(biāo)準(zhǔn)溶液的sers圖譜；

圖9為sers1592cm^-1特征峰處監(jiān)測(cè)新紅的吸附曲線(5×10^-8-2×10^-4m)；

圖10為sers1592cm^-1特征峰的校準(zhǔn)曲線(1×10^-6-2×10^-5m)；

圖11為餅干樣品中新紅的sers圖譜；

圖12為水果糖樣品中新紅的sers圖譜；

圖13為電化學(xué)制備裝置結(jié)構(gòu)示意圖；

圖中：1、鐵架臺(tái)，11、玻璃容器，12、固定支架，2、參比電極，3、輔助電極，31、把手，4、工作電極，41、導(dǎo)電夾，411、銅絲，51、齒輪，52、升降桿，53、夾持架，54、操作屏，6、電化學(xué)工作站。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例，實(shí)施例不應(yīng)視作對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

如圖13所示，電化學(xué)制備裝置，包括鐵架臺(tái)1、電化學(xué)池和與電化學(xué)池相連的電化學(xué)工作站6，電化學(xué)池包括參比電極2、輔助電極3、工作電極4、玻璃容器11、用于固定電極的固定支架12；在所述的鐵架臺(tái)1上設(shè)置有用于控制工作電極在電化學(xué)池里的深度的升降機(jī)構(gòu)。

其中升降機(jī)構(gòu)包括齒輪51、微型電機(jī)、控制器、升降桿52、設(shè)置在升降桿上的高度傳感器、夾持架53、操作屏54；在升降桿52上均勻設(shè)置有凹槽；控制器的控制端與微型電機(jī)相連，微型電機(jī)的轉(zhuǎn)軸與齒輪51相連，齒輪的齒牙與升降桿的凹槽相嚙合；夾持架53與升降桿52相固定，操作屏54設(shè)置在鐵架臺(tái)上，高度傳感器和操作屏分別與控制器相連。手動(dòng)控制工作電極進(jìn)入液體的深度時(shí)，在固定的同時(shí)，工作電極浸入液體的長(zhǎng)度總會(huì)過高或過低，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確；通過升降機(jī)構(gòu)自動(dòng)控制工作電極進(jìn)入液體的深度，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，減小誤差。

固定支架和夾持架采用絕緣材料?？刂破靼╯tc11f60xe單片機(jī)。

輔助電極3為鈦制成的筒壁狀電極，筒壁狀電極與電化學(xué)池的玻璃容器的內(nèi)壁緊密結(jié)合；在筒壁狀電極的頂部邊緣延伸出一把手31，把手31與電化學(xué)工作站6電連接。輔助電極與玻璃容器內(nèi)壁緊密貼合，且?guī)б话咽峙c電化學(xué)工作站連接，可保證金屬電極表面的均勻腐蝕，確保了表面增強(qiáng)拉曼金屬基底軸向和徑向反應(yīng)的均勻性，克服傳統(tǒng)的輔助電極難以保證表面增強(qiáng)拉曼金屬基底軸向和徑向反應(yīng)的均勻性的問題。

在工作電極4的頂部夾有一導(dǎo)電夾41，導(dǎo)電夾41通過銅絲411與電化學(xué)工作站6相連；實(shí)際操作中可將導(dǎo)電夾加持在高出液面2-3mm處。本發(fā)明采用導(dǎo)電夾可以適應(yīng)多種工作電極，如紙片狀電極；工作電極通過一導(dǎo)電夾與電化學(xué)工作站連接，代替了傳統(tǒng)電化學(xué)反應(yīng)中工作電極的液面以上部分，大大提高了粗糙金屬電極的產(chǎn)出率。

工作過程為：將需要進(jìn)行反應(yīng)的工作電極4用導(dǎo)電夾41夾住，用夾持架53夾住銅絲411，通過操作屏54輸入工作電極需要進(jìn)入液體的深度；控制器控制微型電機(jī)的轉(zhuǎn)動(dòng)，微型電機(jī)控制齒輪51轉(zhuǎn)動(dòng)，齒輪51控制升降桿52的升降，從而控制工作電極浸入液體的深度。高度傳感器檢測(cè)升降桿52的升降高度，當(dāng)升降高度與設(shè)置的高度相等時(shí)，控制器控制微型電機(jī)停止轉(zhuǎn)動(dòng)。

1儀器與試劑

拉曼光譜儀：oceanopticsqe65pro拉曼光譜儀；感量為0.1mg的分析天平(瑞士梅特勒公司)；milli-q純水器(美國millipore公司)；jeoljsm-6700f冷場(chǎng)掃描電子顯微鏡；x射線能量色散譜(英國oxfordinstruments)；brukerd8x射線粉末衍射儀(德國布魯克)。

高純銀絲(直徑0.3-1.0mm，99.99％，)來源于北京有色金屬與稀土利用研究所；甲醇：色譜純(merk公司)；乙醇：色譜純(merk公司)；丙酮：色譜純(merk公司)；正己烷：色譜純(merk公司)；鹽酸、硝酸：分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；新紅標(biāo)準(zhǔn)品：92.0％，德國dr.ehrenstorfer。

2儀器條件

激光拉曼光譜儀測(cè)定條件：激光波長(zhǎng)785nm，激光最大強(qiáng)度200mw，掃描范圍2000～300cm^-1，積分時(shí)間5s，積分2次。每個(gè)樣品至少掃描5次，以得到準(zhǔn)確的拉曼光譜圖。

多孔銀納米結(jié)構(gòu)的電子顯微鏡形貌測(cè)定：5.0kv的加速電壓。

3樣品提取與凈化

3.1制備：

取具有代表性固體試樣500g粉碎、攪拌均勻密封標(biāo)識(shí)，待用。

3.2提?。?/p>

取步驟(1)樣品10g，置于50ml離心管中，加入25ml超純水，于50-70℃水浴超聲提取10-30min，于離心機(jī)中4000r/min離心5-15min，移取上清液用檸檬酸水溶液調(diào)試ph值至3-6，得待凈化溶液；

3.3凈化：

3.3.1固相萃取小柱的組裝：稱取40-80mg40-60μm陰離子交換填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上端再以聚乙烯篩板固定；

所述的陰離子交換填料為選自丙基乙二胺(psa)、聚酰胺(pa)、多胺化聚苯乙烯二乙烯苯共聚物(pwax)填料中的至少一種；

3.3.2柱活化：將上述固相萃取小柱依次用4-8mlph值6-7的水、4-8ml甲醇活化；

3.3.3加樣淋洗：轉(zhuǎn)移上述待凈化液8-15ml至固相萃取小柱，依次用4-8mlph值3-6的水、4-8ml甲醇淋洗spe柱；

3.3.4洗脫：低真空吹干spe柱，用4-8ml3％-6％的氨化甲醇洗脫待分析成分并接收，收集液于50℃氮?dú)獯蹈?，用水定容?.0ml，渦流混合后過0.22μm濾膜，供sers分析。

4表面增強(qiáng)基底的制備

將直徑為0.3-1.0mm的銀絲裁剪成1-8cm，依次浸入丙酮、乙醇、超純水、0.1m硝酸中4-8分鐘進(jìn)行表面處理，最后超純水清洗、干燥備用。電化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用自制的三電極電化學(xué)工作池，銀絲為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，大面積鈦桶電極為輔助電極，0.1m鹽酸為電解液、在-0.2v～0.2v電位范圍內(nèi)以5-100mv/s的速度進(jìn)行10-20次電化學(xué)反應(yīng)，制備具有均一多孔納米銀結(jié)構(gòu)的表面增強(qiáng)拉曼銀絲基底，制備好的銀絲清洗、干燥備用。

5基底表征

多孔銀納米結(jié)構(gòu)的形貌采用冷場(chǎng)掃描電子顯微鏡(sem，jeoljsm-6700f)以5.0kv的加速電壓進(jìn)行表征，銀納米結(jié)構(gòu)物相及結(jié)晶狀況分析采用x射線能量色散譜(eds，oxfordinstruments)和x射線粉末衍射儀(xrd，brukerd8)進(jìn)行。表面形貌利用原子力顯微鏡(afm,multimode,veecoinstruments)表征并進(jìn)行粒徑分析。

6標(biāo)準(zhǔn)拉曼光譜數(shù)據(jù)庫的建立

用gaussianw03程序?qū)π录t進(jìn)行逐步優(yōu)化并對(duì)最優(yōu)結(jié)構(gòu)進(jìn)行拉曼頻率的理論計(jì)算，得出理論特征譜圖；利用拉曼光譜儀對(duì)新紅固體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行掃描，得到固體標(biāo)品特征譜圖。

7測(cè)試

將表面增強(qiáng)拉曼基底浸入待測(cè)液中靜置萃取1-5分鐘后，置于鈦片上進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜測(cè)試。

7結(jié)果與討論

7.1電化學(xué)制備多孔銀層納米結(jié)構(gòu)

采用循環(huán)伏安法，以25mv/s掃描速度在-0.2～0.2v范圍，循環(huán)掃描15圈的i-e曲線，e-t曲線，q-t曲線及i-t曲，分別如圖1a、b、c、d所示。由圖1a可以觀察到，從-0.2到0.2v掃描過程中，在0.185v處出現(xiàn)銀的陽極氧化峰，回掃過程中在-0.095處出現(xiàn)銀離子的陰極還原峰。在這個(gè)連續(xù)掃描過程中，氧化和還原峰高逐漸增大，銀絲表面發(fā)生了連續(xù)的溶解和析出。隨著循環(huán)圈數(shù)的增加，工作電極的氧化還原電流及電荷量是逐漸增大(圖1cq-t曲線，和圖1di-t曲線)，當(dāng)循環(huán)圈數(shù)達(dá)到12圈以后，電流及電量變化趨于平穩(wěn)，證明銀絲表面的溶解析出和還原沉積過程達(dá)到平衡，電極表面積達(dá)到最大，粗糙化處理完成。

7.2多孔銀層納米結(jié)構(gòu)的表征

掃描速度是影響極化過電位的重要參數(shù)，過電位絕對(duì)值的高低直接決定界面電化學(xué)過程中電子傳遞的快慢。因此，掃描速度的快慢直接影響多孔銀納米結(jié)構(gòu)的尺寸和性質(zhì)。在此，考察了不同掃速下對(duì)銀納米結(jié)構(gòu)的形貌的影響，我們選取了掃描速度分別為5mv/s，10mv/s，25mv/s，50mv/s，75mv/s，100mv/s時(shí)，多孔銀納米結(jié)構(gòu)的sem結(jié)果如圖2所示，掃描電勢(shì)范圍為-0.2到0.2v，掃描圈數(shù)為15次的sem圖。隨著掃描速度的增大，多孔銀結(jié)構(gòu)中的銀納米顆粒的平均粒徑逐漸減小，根據(jù)插圖中的粒徑統(tǒng)計(jì)直方圖，最大平均粒徑依次為254.2nm，192.0nm，127.8nm，109.5nm，107.1nm，101.2nm。這個(gè)現(xiàn)象的原因可以歸結(jié)為，在相對(duì)較慢的掃描速度下(5mv/s)，電子傳遞速度較慢，可以保證納米顆粒成長(zhǎng)為大直徑的顆粒，而隨著掃速增大，電子傳遞速度加快，相同時(shí)間內(nèi)成核中心的數(shù)量增大才能保證電子交換的速度與電位增加的速度匹配，所以導(dǎo)致顆粒尺寸較小。但是，高的電子傳遞速度，甚至超過了擴(kuò)散傳質(zhì)的速度，因此銀離子還原的速度小于其銀原子氧化的速度，導(dǎo)致還原不充分，多孔銀納米結(jié)構(gòu)層出現(xiàn)不均勻。從圖2可以看出：在掃描速度為25mv/s時(shí)(圖2c)，多孔銀納米結(jié)構(gòu)粒度最好。

在圖3a的xrd圖譜中可以看到，衍射峰與ag(jcpdsno.04-0783)的峰相匹配，證明多孔納米結(jié)構(gòu)是有銀單質(zhì)的構(gòu)成，同時(shí)，可以清晰的識(shí)別(111)，(200)，(220)，(311)晶面的衍射峰，證明了納米結(jié)構(gòu)具有很好的結(jié)晶性。eds分析結(jié)果進(jìn)一步印證了，多孔納米結(jié)構(gòu)由ag元素組成。以上結(jié)果表面，采用電化學(xué)制備的多孔銀納米結(jié)構(gòu)主要由銀單質(zhì)構(gòu)成，粗糙化過程未造成多孔結(jié)構(gòu)表面產(chǎn)生氧化銀。

7.3理論拉曼光譜計(jì)算及振動(dòng)模式的歸屬

對(duì)新紅分子用gaussian03程序進(jìn)行逐步優(yōu)化并對(duì)最優(yōu)結(jié)構(gòu)進(jìn)行拉曼頻率的理論計(jì)算，分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化結(jié)果如圖4所示，計(jì)算結(jié)果文件及分子構(gòu)型通過gaussview5觀察和分析，分子結(jié)構(gòu)的理論拉曼光譜計(jì)算結(jié)果校正后與固體標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)拉曼光譜呈現(xiàn)高匹配度(圖5，表1)。

表1新紅的理論拉曼光譜(dft)和固體標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)拉曼光譜(nrs)主要峰的振動(dòng)模式歸屬

7.4定性定量方法的建立以及實(shí)際樣品檢測(cè)

7.4.1定性檢測(cè)

對(duì)新紅的定性檢測(cè)可選擇它的特征峰作為鑒定標(biāo)準(zhǔn)，507，626，1113，1220，1280，1371，1492，1592cm^-1處峰強(qiáng)度較高(圖6)，所以選定以上八個(gè)峰為定性峰。

7.4.2定量檢測(cè)

7.4.2.1新紅的sers響應(yīng)

納米結(jié)構(gòu)的差異會(huì)顯著影響吸附分子的sers響應(yīng)，因此，我們考察了新紅在不同掃速條件下制備的porousag上的sers響應(yīng)。新紅在不同掃速制備的porousag基底上的增強(qiáng)效果不同，其趨勢(shì)是隨著掃描速度的增加，增強(qiáng)效果逐漸增強(qiáng)，當(dāng)掃速為25mv/s時(shí)，增強(qiáng)效果達(dá)到最大值，然后隨著掃速的繼續(xù)增加而逐漸降低。本文采用25mv/s時(shí)得到的銀絲基底進(jìn)行方法學(xué)考察。

7.4.2.2萃取條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)中采用靜置直接萃取法，為了獲得最佳萃取效果，對(duì)平衡時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。為了選擇最佳萃取時(shí)間，我們考察了不同濃度新紅的sers特征峰強(qiáng)度與萃取時(shí)間的動(dòng)力學(xué)曲線。將porousag萃取絲浸入2.0×10^-5m的新紅萃取工作液中，間隔不同時(shí)間連續(xù)采集萃取絲上sers光譜，如圖7所示，新紅萃取時(shí)間超過1min后，特征峰強(qiáng)度不再增加趨于平衡，隨著萃取時(shí)間增長(zhǎng)有下降趨勢(shì)，選擇最佳萃取時(shí)間為1min。

7.4.2.3檢出限及線性

在最佳條件情況下，將porousag萃取絲浸入一系列濃度的新紅化合物進(jìn)行萃取1min，達(dá)到平衡后得到圖8的系列溶液sers光譜數(shù)據(jù)，由結(jié)果可見，當(dāng)新紅溶液的濃度降至5×10^-8m時(shí)1113，1220，1280，1371，1492，1592cm^-1等峰仍能看出有sers增強(qiáng)峰的存在，此濃度作為方法的檢出限。取1592cm^-1處的一系列sers峰來做峰強(qiáng)度與新紅濃度的平衡吸附曲線(圖9)和線性關(guān)系曲線(圖10)。

7.4.3實(shí)際樣品sers檢測(cè)與hplc方法的比對(duì)

選取餅干樣品，添加新紅、萘酚黃、酸性紫6b、喹啉黃、玫瑰紅b標(biāo)準(zhǔn)溶液按“3樣品提取與凈化”的實(shí)驗(yàn)步驟操作完畢后進(jìn)行上述原位萃取sers方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖11所示曲線，507，626，1113，1220，1280，1371，1492，1592cm^-1處的sers峰與新紅粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的拉曼峰基本是一致的，可以確認(rèn)本發(fā)明的sers檢測(cè)出餅干樣品中新紅的存在，其含量為4.69mg/kg，添加的萘酚黃、酸性紫6b、喹啉黃、玫瑰紅b未對(duì)目標(biāo)物新紅產(chǎn)生干擾。為了驗(yàn)證上述方法的準(zhǔn)確性，對(duì)上述樣品按照gb5009.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中合成著色劑的測(cè)定》方法進(jìn)行前處理后采用液相色譜法對(duì)其中新紅進(jìn)行檢測(cè)，比對(duì)結(jié)果見表2。

表2餅干樣品的檢測(cè)結(jié)果

由對(duì)比結(jié)果可以看出，sers檢測(cè)方法可以在保證準(zhǔn)確性的前提下，節(jié)省檢測(cè)時(shí)間、操作簡(jiǎn)便，相比液相色譜檢測(cè)方法避免有機(jī)流動(dòng)相的污染、節(jié)省檢測(cè)成本，sers增強(qiáng)基底可低成本自制且便于攜帶、適用于批量樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

實(shí)施例1：

水果糖樣品中新紅的快速檢測(cè)方法

1、樣品提取與凈化

1.1提取

取具有代表性試樣500g粉碎、攪拌均勻，然后添加新紅、偶氮玉紅標(biāo)準(zhǔn)溶液制作代表性陽性樣品，密封標(biāo)識(shí)，待用；

取樣品10g，置于50ml離心管中，加入25ml超純水，于60℃水浴超聲提取15min，于離心機(jī)中4000r/min離心10min，移取上清液用檸檬酸水溶液調(diào)試ph值至3-6，得待凈化溶液；樣品：

1.2凈化

1.2.1固相萃取小柱的組裝：稱取60mg40-60μmpwax混合型弱陰離子交換填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上端再以聚乙烯篩板固定；

1.2.2柱活化：將上述固相萃取小柱依次用6mlph值6-7的水、6ml甲醇活化；

1.2.3加樣淋洗：轉(zhuǎn)移上述待凈化液10ml至固相萃取小柱，依次用6mlph值4的水、6ml甲醇淋洗spe柱；

1.2.4洗脫：低真空吹干spe柱，用6ml5％的氨化甲醇洗脫待分析成分并接收，收集液于50℃氮?dú)獯蹈?，用水定容?.0ml，渦流混合后過0.22μm濾膜，供sers分析。

2.表面增強(qiáng)基底的制備

取直徑為0.7mm的銀絲裁剪成5cm，依次浸入丙酮、乙醇、超純水、0.1m硝酸中進(jìn)行表面處理，最后超純水清洗、干燥備用。電化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用自制的三電極電化學(xué)工作池，銀絲為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，大面積鈦桶電極為輔助電極，0.1m鹽酸為電解液、在-0.2v～0.2v電位范圍內(nèi)以25mv/s的速度進(jìn)行12次電化學(xué)反應(yīng)，制備具有均一多孔納米銀結(jié)構(gòu)的表面增強(qiáng)拉曼銀絲基底，制備好的銀絲清洗、干燥備用。

3測(cè)試：將表面增強(qiáng)拉曼銀絲基底浸入待測(cè)液中靜置萃取1分鐘，然后置于載體上進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜測(cè)試；

4結(jié)果：結(jié)果如圖12所示曲線，626，1113，1220，1280，1371，1492，1592cm^-1處的sers峰與新紅粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的拉曼峰基本是一致的，可以確認(rèn)本發(fā)明的sers檢測(cè)出水果糖樣品中新紅的存在，其含量為21.94mg/kg，添加的偶氮玉紅未對(duì)目標(biāo)物新紅產(chǎn)生干擾。為了驗(yàn)證上述方法的準(zhǔn)確性，對(duì)上述樣品按照gb5009.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中合成著色劑的測(cè)定》方法進(jìn)行前處理后采用液相色譜法對(duì)其中新紅進(jìn)行檢測(cè)，比對(duì)結(jié)果見表3。

表3水果糖樣品的檢測(cè)結(jié)果