本發(fā)明涉及提高石蠟病理組織切片的檢測(cè)特異性敏感性并大幅降低抗體使用量的方法，是一種石蠟病理切片組織水凝膠支撐脂質(zhì)清除的處理方法。
背景技術(shù)：
：石蠟病理組織切片是將病變的組織或臟器經(jīng)過各種化學(xué)品和包埋法的處理，使之支撐硬化，在切片機(jī)上切成薄片，粘附在玻片上，加以各種染色檢測(cè)手段，供在顯微鏡下檢查，以觀察病理變化，作出病理診斷，為臨床診斷和治療提供幫助。其中，染色手段不同，可分為細(xì)胞化學(xué)染色、免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色以及熒光原位雜交（fish）等。然而在石蠟病理組織切片中，組織細(xì)胞中脂質(zhì)分子具有阻礙光線和大分子滲透的作用，這導(dǎo)致傳統(tǒng)方法制作的病理切片在免疫組織染色及免疫熒光染色時(shí)需耗費(fèi)更多的抗體且同時(shí)信噪比較差。如果能無損傷保留細(xì)胞蛋白質(zhì)及各種遺傳物質(zhì)同時(shí)有效去除雙層脂質(zhì)分子，從而使光線和大分子能更好滲透到組織深層，實(shí)現(xiàn)提高染色效果并減少抗體的使用量，提高組織石蠟病理組織切片染色的敏感性、特異性。因此如何能在去除脂質(zhì)的同時(shí)保持組織結(jié)構(gòu)完整性和避免生物分子信息丟失成為技術(shù)難點(diǎn)。clarity技術(shù)的原理是采用一種透明水凝膠替代組織中的脂類，構(gòu)建起一個(gè)組織細(xì)胞骨架，支撐細(xì)胞組分中的蛋白質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)、dna、rna等物質(zhì)，從而達(dá)到減少脂質(zhì)分子阻礙光線和大分子滲透的目的。該技術(shù)最初的報(bào)道是運(yùn)用在動(dòng)物器官組織，主要是通過心臟灌流輸入動(dòng)物體內(nèi)，在多聚甲醛充分支撐蛋白質(zhì)、核酸之后，將組織樣品升溫至37℃，誘發(fā)丙烯酰胺、甲叉-丙烯酰胺聚合，在組織內(nèi)部形成水凝膠，完整保留蛋白質(zhì)和核酸的定位信息，再進(jìn)一步應(yīng)用陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（sds）溶液清除樣品中主要的散光物質(zhì)磷脂，最后通過折射率匹配，讓樣品和樣品間隙的折射率一致，從而使樣品的光學(xué)通透性大大增強(qiáng)。然而在石蠟病理切片組織中運(yùn)用clarity技術(shù)原理進(jìn)行水凝膠支撐脂質(zhì)清除處理，國(guó)內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種石蠟病理切片組織的水凝膠支撐和脂質(zhì)清除處理方法，將clarity技術(shù)原理與傳統(tǒng)石蠟切片檢測(cè)方法相結(jié)合，通過支撐組織中蛋白質(zhì)及各種遺傳物質(zhì)并清除組織中的脂質(zhì)成分，提高病理切片檢測(cè)的特異性和敏感性，并大幅降低抗體使用量。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種石蠟病理切片組織的水凝膠支撐和脂質(zhì)清除處理方法，包括以下步驟：s1.將石蠟病理組織切片進(jìn)行脫蠟，得切片；s2.將切片進(jìn)行抗原修復(fù)；s3.將步驟s2所得的切片完全浸沒于水凝膠中，在0~4℃下浸泡20~40h；s4.將步驟s3處理后的切片放入第一容器中，交替充入惰性氣體/氮?dú)?二氧化碳和抽真空，然后在第一容器充滿氮?dú)獾那闆r下，于35~40℃保溫2.5~6h，直至水凝膠凝固；s5.將步驟s4處理后的切片放入盛有清除液的第二容器中，置于搖床上，35~40℃下去除切片組織中的脂質(zhì)22~30h，最后將切片取出，完成透明化處理過程。優(yōu)選的，所述步驟s1包括以下子步驟：s1-1.將石蠟病理組織切片置于恒溫箱中，于55~65℃保溫30~60min；s1-2.將石蠟病理組織切片置于二甲苯中脫蠟8~15min，反復(fù)進(jìn)行3次；s1-3.用不同濃度乙醇梯度水化，無水乙醇、無水乙醇、80%乙醇、70%乙醇及60%乙醇各1~5min，得切片。優(yōu)選的，所述步驟s3中，水凝膠的制備方法為：質(zhì)量濃度40%丙烯酰胺、質(zhì)量濃度2%甲叉雙丙烯酰胺、0.1mpbs、ddh2o按體積比18~22:4~6:18~22:145~165混合，且每100ml的混合液體中還加有0.15~0.3g的va-044。更優(yōu)選的，所述步驟s3中，水凝膠的制備方法為：質(zhì)量濃度40%丙烯酰胺、質(zhì)量濃度2%甲叉雙丙烯酰胺、0.1mpbs、ddh2o按體積比10:2.5:10:77.5混合，且每100ml的混合液體中還加有0.25g的va-044。優(yōu)選的，所述步驟s4中，第一容器包括容器本體和y型氣管，所述y型氣管下端口與容器本體相連，兩個(gè)上端口分別設(shè)置有閥門，其中一個(gè)上端口與氮?dú)庠聪噙B，另一個(gè)上端口與真空泵相連。優(yōu)選的，所述步驟s4中，交替充入惰性氣體/氮?dú)夂统檎婵盏倪^程為：先充入惰性氣體/氮?dú)?二氧化碳1.5~3min，抽真空15~20min。優(yōu)選的，所述步驟s5中，清除液的制備方法為：硼酸、sds和ddh2o按照重量比12~13:39~42:1000混合，并用10m的naoh溶液調(diào)節(jié)ph至8.2~8.8。優(yōu)選的，所述步驟s3中，在容器充滿氮?dú)獾那闆r下，于37℃保溫2.5~6h；所述步驟s4中，搖床的溫度為37℃。優(yōu)選的，還包括s6.將切片通過免疫組織化學(xué)法染色或免疫熒光法染色。優(yōu)選的，清除液的制備方法為硼酸、sds和ddh2o按照重量比0.62:2:50混合，并用10m的naoh溶液調(diào)節(jié)ph至8.5。以上所述的石蠟病理切片組織的水凝膠支撐和脂質(zhì)清除處理方法，先對(duì)病理切片進(jìn)行脫蠟，以脫除蠟質(zhì)層的干擾，再對(duì)切片進(jìn)行抗原修復(fù)，使被封閉的抗原重新暴露或修正過來，然后將切片浸泡在水凝膠中，并使水凝膠成型，從而用水凝膠替代了病理組織中的脂質(zhì)成分，構(gòu)建起一個(gè)組織細(xì)胞骨架，最后通過清除液除去細(xì)胞脂質(zhì)，讓器官組織變得透明且更利于大分子滲透，從而降低抗體用量并提升成像效果。經(jīng)過以上處理，有效清除了組織中的脂質(zhì)成分，進(jìn)而達(dá)到降低染色背景、提高靶標(biāo)信號(hào)的目的，還具有減少抗體使用量、操作難度低、對(duì)設(shè)備要求低、操作容易等優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明能很好的與目前普遍應(yīng)用的病理檢測(cè)手段相結(jié)合，可以增加病理切片檢測(cè)的特異性和敏感性，提高臨床病理診斷準(zhǔn)確率，降低抗體使用量及大幅節(jié)省檢測(cè)費(fèi)用。附圖說明圖1為本發(fā)明的流程示意圖。圖2為本發(fā)明中第一容器的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3a為dapi熒光染色未透明化組織切片組顯微鏡下的結(jié)果。圖3b為dapi熒光染色透明化組織切片組顯微鏡下的結(jié)果。圖中，容器本體1，第一閥門2，y型氣管3，第二閥門4。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于以下實(shí)施例。切片分組：選擇人正常肝臟組織石蠟病理組織切片8張，其中透明化處理組和非透明化組各四張，所述的透明化處理組即將石蠟病理切片組織進(jìn)行過水凝膠固定和脂質(zhì)清除處理，所述的非透明化組即為石蠟病理組織切片。石蠟病理切片組織的水凝膠固定和脂質(zhì)清除處理方法包括以下步驟：s1.將石蠟病理組織切片進(jìn)行脫蠟，得切片：s1-1.將石蠟病理組織切片置于恒溫箱中，于60℃下保溫烘烤30min；s1-2.將石蠟病理組織切片置于二甲苯中脫蠟10min，反復(fù)進(jìn)行3次；s1-3.用不同濃度乙醇梯度水化，無水乙醇、無水乙醇、80%乙醇、70%乙醇及60%乙醇各5min，得切片。s2.將切片進(jìn)行抗原修復(fù)：s2-1.將石蠟病理組織切片浸泡在盛有0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液的高壓鍋中，高壓加熱枸櫞酸鈉緩沖溶液，壓力閥開始冒氣后等待5min，停止加熱，等緩沖液冷卻后，將切片取出；s2-2.把切片用pbs漂洗5min，其中pbs指磷酸鹽緩沖液，主要包含磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉以及氯化鉀，ph=7.4。s3.將步驟s2所得的切片置于盛有水凝膠的切片盒中，完全浸沒，放入4℃冰箱，浸泡24h；其中，水凝膠100ml的配置組成見表1：表1成分40%丙烯酰胺2%甲叉雙丙烯酰胺va-0440.1mpbsddh2o用量10ml2.5ml0.25g10ml77.5ml丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺為主要成型劑；pbs指磷酸鹽緩沖液；va-044引發(fā)劑是指化學(xué)名稱為偶氮二異丁咪唑啉鹽酸鹽，縮寫為aibi，別名va-044，是一種水溶性偶氮引發(fā)劑。其作用為誘導(dǎo)丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺交聯(lián)聚合，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如式(i)所示：式(i)浸泡完后將切片取出，小心去除組織周圍多余水凝膠。s4.將步驟s3處理后的切片放入第一容器中，交替充入惰性氣體/氮?dú)?二氧化碳和抽真空；如圖2所示，第一容器包括容器本體1和y型氣管3，y型氣管3下端口與容器本體1相連，兩個(gè)上端口分別設(shè)置有第一閥門2和第二閥門4，其中一個(gè)上端口通過第一閥門2與氮?dú)庠聪噙B，另一個(gè)上端口通過第二閥門4與真空泵相連。交替充入氮?dú)夂统檎婵盏倪^程為：打開第一閥門2，關(guān)閉第二閥門4，充入氮?dú)?min；關(guān)閉第一閥門2，打開第二閥門4，抽真空20min。其中，氮?dú)饪梢杂枚栊詺怏w或二氧化碳代替。然后打開第一閥門2，關(guān)閉第二閥門4，充入氮?dú)猓诘谝蝗萜鞒錆M氮?dú)獾那闆r下，于37℃保溫3h，直至水凝膠凝固；開啟第一容器，取出切片，小心去除組織外周的水凝膠；s5.準(zhǔn)備清除液：清除液50ml的配置組成見表2：表2然后再用10mnaoh調(diào)節(jié)ph至8.5，即得清除液。將步驟s4處理后的切片正面向上，放入盛有清除液的離心管中，置于37℃搖床上，去除切片組織中的脂質(zhì)24h，最后將切片取出，完成透明化處理過程。s6.將切片通過免疫組織化學(xué)法染色或免疫熒光法染色。將dapi抗體稀釋為濃度400ug/ml的工作液。按表3中所示不同一抗的稀釋濃度將樣本分成四組表3在樣本中滴加配置好的dapi稀釋液，室溫避光孵育10min，采用pbs洗3min兩次，然后熒光顯微鏡觀察，拍照，拍照分為手動(dòng)曝光組和自動(dòng)曝光組：a.手動(dòng)曝光組：設(shè)置參數(shù)iso100，曝光時(shí)間0.5秒，記錄各組染色后手動(dòng)曝光結(jié)果，并以陽性和陰性標(biāo)記。b.自動(dòng)曝光組：設(shè)置參數(shù)iso100，曝光時(shí)間自動(dòng)，記錄各組染色后自動(dòng)曝光結(jié)果及曝光所需時(shí)間，并以陽性和陰性標(biāo)記。結(jié)果見表4：表4注：表格中“+”表示陽性結(jié)果，“-”表示陰性結(jié)果該結(jié)果顯示，在手動(dòng)曝光條件下抗體稀釋5倍后透明化組仍可以得到陽性結(jié)果而非透明化組檢測(cè)不到。而在自動(dòng)曝光條件下，抗體稀釋125倍后仍可以檢測(cè)到陽性結(jié)果，但非透明化組在稀釋25倍時(shí)已無法檢出，且所有抗體濃度下透明化組自動(dòng)曝光所需時(shí)間均小于非透明化組。結(jié)合圖3所示，圖3a為dapi熒光染色未透明化組織切片組顯微鏡下的結(jié)果，圖3b為dapi熒光染色透明化組織切片組顯微鏡下的結(jié)果，圖3a和圖3b中的組織切片均按dapi工作液（400ug/ml）的初始濃度，25倍稀釋作染，圖片采集是使用奧林巴斯熒光倒置顯微鏡進(jìn)行采集（400x顯微放大，自動(dòng)曝光）。由對(duì)比結(jié)果可見，透明化組的dapi染色效果提升明顯，信號(hào)與背景清晰可分，信噪比良好。在檢測(cè)組織切片中細(xì)胞組織的多肽及蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的定性和定位觀察試驗(yàn)中，由于透明化組的切片進(jìn)行了脂質(zhì)清除處理，使抗體更容易穿透組織及細(xì)胞膜并與組織切片中的抗原結(jié)合，從而達(dá)到降低抗體使用量的目的，根據(jù)使用抗體的不同，透明化組的切片的抗體用量?jī)H為未透明化組的切片抗體用量的1/25~1/250。綜上所述，本實(shí)施例能無損傷的支撐組織中蛋白質(zhì)等遺傳物質(zhì)并有效清除了組織中的脂質(zhì)成分，進(jìn)而達(dá)到降低染色背景、提高靶標(biāo)信號(hào)的目的，還具有減少抗體使用量、操作難度低、對(duì)設(shè)備要求低、操作容易等優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明能很好的與目前普遍應(yīng)用的病理檢測(cè)手段相結(jié)合，可以增加病理切片檢測(cè)的特異性敏感性，提高臨床病理診斷準(zhǔn)確率，大幅節(jié)省檢測(cè)費(fèi)用。當(dāng)前第1頁12