本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及與唐氏綜合征相關(guān)的母血標(biāo)志物及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

出生前診斷干預(yù)是降低唐氏綜合征(down’ssyndrome，ds)出生缺陷的重要手段，因此探索新的特異性無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷指標(biāo)具有非常重要的意義。唐氏綜合征額外的1條21號染色體可導(dǎo)致某些基因增強(qiáng)表達(dá)和某些正?；蜻^表達(dá)，造成一些重要的生化代謝不平衡，這些表達(dá)差異的特異性蛋白質(zhì)可以通過胎盤屏障進(jìn)入母體血液。

同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，itraq)技術(shù)是由absciex公司研發(fā)的一種體外同種同位素標(biāo)記的相對與絕對定量技術(shù)。itraq技術(shù)利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽n末端或賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)，經(jīng)高精度質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，可同時(shí)比較多達(dá)8種樣品之間的蛋白表達(dá)量，是近年來定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù)。itraq技術(shù)在差異蛋白質(zhì)種類和數(shù)量方面以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性方面，比傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法更具優(yōu)勢，它不僅可以發(fā)現(xiàn)胞漿蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白，還可檢測出低豐度蛋白、弱堿性蛋白、分子量小于10kd或大于200kd的蛋白，能實(shí)現(xiàn)對任何類型蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確鑒定，尤其適用于血清或血漿生化標(biāo)志物的篩選。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何輔助診斷胎兒唐氏綜合征。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了用于檢測tβ10蛋白的物質(zhì)、和/或、用于檢測ero1l蛋白的物質(zhì)、和/或、用于檢測nap1l1蛋白的物質(zhì)、和/或、用于檢測ogdhl蛋白的物質(zhì)在制備輔助診斷胎兒唐氏綜合征的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述產(chǎn)品可為試劑盒。

用于檢測tβ10蛋白的物質(zhì)、和/或、用于檢測ero1l蛋白的物質(zhì)、和/或、用于檢測nap1l1蛋白的物質(zhì)、和/或、用于檢測ogdhl蛋白的物質(zhì)在輔助診斷胎兒唐氏綜合征中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述應(yīng)用中，所述“用于檢測ogdhl蛋白的物質(zhì)”可為檢測所述ogdhl蛋白的濃度的物質(zhì)。所述“用于檢測nap1l1蛋白的物質(zhì)”可為檢測所述nap1l1蛋白的濃度的物質(zhì)。所述“用于檢測tβ10蛋白的物質(zhì)”可為檢測所述tβ10蛋白的濃度的物質(zhì)。所述“用于檢測ero1l蛋白的物質(zhì)”可為檢測所述ero1l蛋白的濃度的物質(zhì)。

上述應(yīng)用中，所述ogdhl蛋白可為a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白質(zhì)；

a2)在a1)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

a3)將a1)或a2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

上述應(yīng)用中，所述nap1l1蛋白可為b1)或b2)或b3)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；

b2)在b1)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

b3)將b1)或b2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

上述應(yīng)用中，所述tβ10蛋白可為c1)或c2)或c3)：

c1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白質(zhì)；

c2)在c1)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

c3)將c1)或c2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

上述應(yīng)用中，所述ero1l蛋白可為d1)或d2)或d3)：

d1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白質(zhì)；

d2)在d1)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

d3)將d1)或d2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種輔助診斷腹胎兒唐氏綜合征的產(chǎn)品。

本發(fā)明所提供的輔助診斷腹胎兒唐氏綜合征的產(chǎn)品，包括用于檢測tβ10蛋白的物質(zhì)、和/或、用于檢測ero1l蛋白的物質(zhì)、和/或、用于檢測nap1l1蛋白的物質(zhì)、和/或、用于檢測ogdhl蛋白的物質(zhì)。所述產(chǎn)品可為試劑盒。

上述產(chǎn)品中，所述“用于檢測ogdhl蛋白的物質(zhì)”可為檢測所述ogdhl蛋白的濃度的物質(zhì)。所述“用于檢測nap1l1蛋白的物質(zhì)”可為檢測所述nap1l1蛋白的濃度的物質(zhì)。所述“用于檢測tβ10蛋白的物質(zhì)”可為檢測所述tβ10蛋白的濃度的物質(zhì)。所述“用于檢測ero1l蛋白的物質(zhì)”可為檢測所述ero1l蛋白的濃度的物質(zhì)。

上述產(chǎn)品中，所述產(chǎn)品還可包括記載有判斷標(biāo)準(zhǔn)甲的載體和/或記載有判斷標(biāo)準(zhǔn)乙的載體和/或記載有判斷標(biāo)準(zhǔn)丙的載體和/或記載有判斷標(biāo)準(zhǔn)丁的載體；

所述判斷標(biāo)準(zhǔn)丙可為：如果待測母體血漿中所述tβ10蛋白的濃度大于對照血漿中所述tβ10蛋白的濃度，則所述待測母體的胎兒為或疑似為唐氏綜合征；如果待測母體血漿中所述tβ10蛋白的濃度在對照血漿中所述tβ10蛋白的濃度以下，則所述待測母體的胎兒不為或疑似不為唐氏綜合征；

所述判斷標(biāo)準(zhǔn)丁可為：如果待測母體血漿中所述ero1l蛋白的濃度大于對照血漿中所述ero1l蛋白的濃度，則所述待測母體的胎兒為或疑似為唐氏綜合征；如果待測母體血漿中所述ero1l蛋白的濃度在對照血漿中所述ero1l蛋白的濃度以下，則所述待測母體的胎兒不為或疑似不為唐氏綜合征；

所述判斷標(biāo)準(zhǔn)乙可為：如果待測母體血漿中所述nap1l1蛋白的濃度大于對照血漿中所述nap1l1蛋白的濃度，則所述待測母體的胎兒為或疑似為唐氏綜合征；如果待測母體血漿中所述nap1l1蛋白的濃度在對照血漿中所述nap1l1蛋白的濃度以下，則所述待測母體的胎兒不為或疑似不為唐氏綜合征；

所述判斷標(biāo)準(zhǔn)甲可為：如果待測母體血漿中所述ogdhl蛋白的濃度大于對照血漿中所述ogdhl蛋白的濃度，則所述待測母體的胎兒為或疑似為唐氏綜合征；如果待測母體血漿中所述ogdhl蛋白的濃度在對照血漿中所述ogdhl蛋白的濃度以下，則所述待測母體的胎兒不為或疑似不為唐氏綜合征；

所述對照血漿可為健康胎兒母體和/或非唐氏綜合征胎兒母體的血漿。

上述產(chǎn)品中，所述ogdhl蛋白可為a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白質(zhì)；

a2)在a1)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

a3)將a1)或a2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

上述產(chǎn)品中，所述nap1l1蛋白可為b1)或b2)或b3)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；

b2)在b1)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

b3)將b1)或b2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

上述產(chǎn)品中，所述tβ10蛋白可為c1)或c2)或c3)：

c1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白質(zhì)；

c2)在c1)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

c3)將c1)或c2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

上述產(chǎn)品中，所述ero1l蛋白可為d1)或d2)或d3)：

d1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白質(zhì)；

d2)在d1)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

d3)將d1)或d2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

所述tβ10蛋白和/或所述ero1l蛋白和/或所述nap1l1蛋白和/或所述ogdhl蛋白作為母血標(biāo)志物在開發(fā)診斷腹唐氏綜合征的試劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上文中，所述ogdhl蛋白的geneid號為55753。所述nap1l1蛋白的geneid號為4673。所述tβ10蛋白geneid號為9168。所述ero1l蛋白geneid號為30001。

上文中，所述檢測ogdhl蛋白的濃度具體可為檢測母體外周血的血漿中的ogdhl蛋白的濃度。所述檢測nap1l1蛋白的濃度具體可為檢測母體外周血的血漿中的nap1l1蛋白的濃度。所述檢測tβ10蛋白的濃度具體可為檢測母體外周血的血漿中的tβ10蛋白的濃度。所述檢測ero1l蛋白的濃度具體可為檢測母體外周血的血漿中的ero1l蛋白的濃度。

實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的發(fā)明人通過從胎兒蛋白整體水平篩選的唐氏綜合征母血標(biāo)志物，即tβ10蛋白和/或ero1l蛋白和/或nap1l1蛋白和/或ogdhl蛋白，可用于無創(chuàng)性產(chǎn)前篩查診斷唐氏綜合征，以解決目前唐篩使用的非特異性母血標(biāo)志物篩查效率低的狀況，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中的各個(gè)實(shí)驗(yàn)均是在患者的知情同意的前提下進(jìn)行的，且均簽署知情同意書，并經(jīng)深圳市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例1、ds胎兒的候選特異性標(biāo)記蛋白的獲得

以確診為唐氏綜合征的胎兒(以下簡稱ds胎兒)6例作為ds組，同時(shí)以健康胎兒6例作為對照組。先運(yùn)用itraq技術(shù)和串聯(lián)質(zhì)譜分析對ds胎兒和健康胎兒臍帶血的血漿全基因組蛋白進(jìn)行鑒定、比較和相對定量分析，得到胎兒“全蛋白質(zhì)組信息”；然后運(yùn)用在線工具wego(webgeneontologyannotationplot，網(wǎng)址為http://wego.genomics.org.cn)分析，將所有的蛋白質(zhì)劃分為分子功能、生物過程和細(xì)胞組成；最后對所有蛋白進(jìn)行g(shù)o富集分析，通過比較ds胎兒和健康胎兒臍帶血血漿中蛋白表達(dá)的差異，結(jié)合蛋白的臨床意義，得到ds胎兒的候選特異性標(biāo)記蛋白。具體步驟如下：

1、分別取6例ds胎兒(發(fā)育至18-22周)的臍帶血2ml，置于肝素抗凝管中，然后2000×g離心15min，收集血漿。

2、完成步驟1后，分別提取血漿中的總蛋白并檢測總蛋白的濃度。

3、完成步驟2后，取各個(gè)樣本的血漿(均含100μg總蛋白)，混合；然后使用proteominer蛋白富集試劑盒(bio-rad公司的產(chǎn)品)去除高豐度蛋白；最后加入適量胰蛋白酶消化，得到消化液。

4、完成步驟3后，取消化液，使用itraq試劑盒(abi公司的產(chǎn)品)進(jìn)行itraq116同位素標(biāo)記，得到標(biāo)記樣本甲。

5、按照上述步驟1-4，將“ds胎兒(發(fā)育至18-22周)”替換為“健康胎兒(發(fā)育至18-22周)”，將“itraq116同位素標(biāo)記”替換為“itraq114同位素標(biāo)記”，其它步驟均不變，得到標(biāo)記樣本乙。

6、完成步驟4和5后，將標(biāo)記樣本甲和標(biāo)記樣本乙混合，先進(jìn)行多維液相色譜分離，然后maldi-tof/tof質(zhì)譜鑒定，計(jì)算蛋白質(zhì)相對定量按平均報(bào)告離子比值(itraq116/itraq114)。

7、完成步驟6后，通過在線工具wego的數(shù)據(jù)庫查詢，建立唐氏綜合征蛋白組數(shù)據(jù)庫；通過scaffold定量分析，獲得唐氏綜合征疾病差異的蛋白組圖譜。

以多肽大于1和95％可信區(qū)間作為閾值，有506種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)，排除高豐度蛋白，平均報(bào)告離子比值(itraq116/itraq114)差異在1.5倍以上顯著差異的蛋白質(zhì)有18種(表1)。其中11種蛋白質(zhì)與健康胎兒比較表達(dá)上調(diào)，7種蛋白質(zhì)與健康胎兒比較表達(dá)下調(diào)。這18種蛋白質(zhì)即為ds胎兒的候選特異性標(biāo)記蛋白。

表1

實(shí)施例2、ds胎兒的候選特異性標(biāo)記蛋白在母體外周血中的westernblot驗(yàn)證

兔抗人ogdhl抗體、兔抗人nap1l1抗體、兔抗人tβ10抗體和兔抗人ero1l抗體均為abcam公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號分別為ab100928、ab178687、ab14338和ab81959。

以8例孕ds胎兒的孕婦作為ds組，同時(shí)以8例孕健康胎兒的孕婦作為對照組。

1、分別取8例孕ds胎兒的孕婦外周血5ml和8例孕健康胎兒的孕婦外周血5ml，置于肝素抗凝管中，然后2000×g離心15min，收集血漿。

2、完成步驟1后，分別提取血漿中的總蛋白。

3、將步驟1得到的總蛋白分別進(jìn)行westernblot，采用兔抗人ogdhl抗體作為一抗檢測ogdhl，采用兔抗人nap1l1抗體作為一抗檢測nap1l1，采用兔抗人tβ10抗體作為一抗檢測tβ10，采用兔抗人ero1l抗體作為一抗檢測ero1l。采用圖像分析軟件image-proplus對各個(gè)蛋白的條帶進(jìn)行光密度測定，比較ds組與對照組的iod(integrateopticaldensity)值。

8例孕ds胎兒的孕婦外周血的westernblot驗(yàn)證結(jié)果見圖1。

8例孕健康胎兒的孕婦外周血的westernblot驗(yàn)證結(jié)果見圖2。

結(jié)果表明，ogdhl、nap1l1、tβ10和ero1l在孕ds胎兒的孕婦外周血中的表達(dá)量均顯著高于孕健康胎兒的孕婦外周血，即ogdhl、nap1l1、tβ10和ero1l在孕ds胎兒的孕婦外周血中的表達(dá)量分別為孕健康胎兒的孕婦外周血中的表達(dá)量的1.527倍、2.188倍、14.776倍和11.100倍。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與ogdhl、nap1l1、tβ10和ero1l在ds胎兒臍帶血中的表達(dá)量顯著高于健康胎兒臍帶血中的表達(dá)量完全一致。

結(jié)果表明，母體外周血中ogdhl、nap1l1、tβ10和ero1l的濃度均與胎兒唐氏綜合征與否有密切聯(lián)系，可輔助診斷胎兒是否患有唐氏綜合征。因此，ogdhl、nap1l1、tβ10和ero1l均為與唐氏綜合征相關(guān)的母血標(biāo)志物。

<110>深圳市人民醫(yī)院

<120>與唐氏綜合征相關(guān)的母血標(biāo)志物及應(yīng)用

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