本發(fā)明屬于生物體外診斷試劑制備領(lǐng)域。具體涉及一種細(xì)胞因子elisa標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法。

背景技術(shù)：

酶聯(lián)免疫吸附(elisa)作為國際公認(rèn)的蛋白定量金標(biāo)準(zhǔn)，具有靈敏度高，特異性好等特點(diǎn)。其中標(biāo)準(zhǔn)品是elisa試劑盒構(gòu)成的一個關(guān)鍵，標(biāo)準(zhǔn)品的保質(zhì)期直接影響到試劑盒的貨架期。目前elisa標(biāo)準(zhǔn)品的保存方法有甘油-20℃保存法和真空冷凍干燥法，此兩種方法對蛋白的穩(wěn)定性有一定的延長作用，但難以滿足試劑盒長時間的保存需求。從實(shí)際的經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同蛋白對于同一配方的凍干液表現(xiàn)出來的保存效果不同。而市面上一般的試劑盒的保存時間為半年，令使用受到限制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種細(xì)胞因子elisa標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法。該方法尤其對猴細(xì)胞因子elisa標(biāo)準(zhǔn)品的制備有優(yōu)勢，其制備的猴細(xì)胞因子elisa標(biāo)準(zhǔn)品具有較長的保質(zhì)期。

本發(fā)明的上述目的通過如下方案予以實(shí)現(xiàn)：

一種細(xì)胞因子elisa標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，包括如下步驟:

s1.對冷凍干燥的相關(guān)設(shè)備進(jìn)行預(yù)冷，預(yù)冷至4℃；

s2.將細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)蛋白用水溶解后，用凍干液稀釋至目標(biāo)濃度，得到標(biāo)準(zhǔn)濃度蛋白溶液；

s3.將s2.得到的標(biāo)準(zhǔn)濃度蛋白溶液分裝至已預(yù)冷西林瓶中，輕蓋上蓋子；

s4.將s3.盛有蛋白溶液的西林瓶放置在真空凍干機(jī)中至完全干燥，得到細(xì)胞因子elisa標(biāo)準(zhǔn)品；

s2.中，所述凍干液由以下按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)算的組分組成：

0.5～5％干酪素鈉，1～10％甘露醇，0.05～0.5％聚吡咯烷酮k30，余量為濃度0.01mol/l的磷酸緩沖液。

在標(biāo)準(zhǔn)品的凍干粉劑中，現(xiàn)存通常有兩種產(chǎn)品，一種是散的粉劑，一種是結(jié)合得相對緊密的粉劑，即凍干粉之間能形成一個良好的型狀，通常是餅型。而前者比較容易獲得，但在開蓋時容易使凍干粉飄出，后者則需要在賦型劑等作用下經(jīng)過配方的優(yōu)化獲得，并且可能出現(xiàn)塌陷等成型問題。

采用本發(fā)明的制備方法進(jìn)行凍干，能使凍干粉獲得很好的成型效果，并且產(chǎn)品外觀良好，不出現(xiàn)掛壁等不良現(xiàn)象。主要原因是利用了甘露醇、聚吡咯烷酮k30二者協(xié)同作用有助于蛋白的成膜，減少凍干粉在凍干后出現(xiàn)的掛壁現(xiàn)象，并且通過適量的k30顯著提高凍干粉的成型率。

磷酸緩沖液的ph值可以參考現(xiàn)有技術(shù)。最優(yōu)選地，所述磷酸緩沖液的ph值為7.4。

最優(yōu)選地，所述干酪素鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最優(yōu)選為1％。

最優(yōu)選地，所述甘露醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最優(yōu)選為5％。

現(xiàn)有技術(shù)中，為了確保凍干效果良好，通常不會在凍干瓶(西林瓶)中添加過多的蛋白溶液，因?yàn)槿绻芤后w積過多，液面高度過大，會使凍干變得困難，凍干效果變差。優(yōu)選地，s3.中，所述每瓶容積為3ml的西林瓶，加入1ml的所述標(biāo)準(zhǔn)濃度蛋白溶液。

本發(fā)明的制備方法對多種細(xì)胞因子都有很好的凍干效果。現(xiàn)有的elisa試劑盒產(chǎn)品中，細(xì)胞因子的產(chǎn)品甚少，所以對其保存方式和保存周期的研究并不多。而本發(fā)明的制備方法制備的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品，其保質(zhì)期可以達(dá)到兩年。

優(yōu)選地，所述細(xì)胞因子為猴細(xì)胞因子。

優(yōu)選地，所述猴細(xì)胞因子為猴細(xì)胞因子il-12或猴細(xì)胞因子il-23。

一種采用所述方法制備的細(xì)胞因子elisa標(biāo)準(zhǔn)品。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明的制備方法可以制備出保質(zhì)期長達(dá)兩年的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品。通過對凍干液配方的合理搭配，利用甘露醇、聚吡咯烷酮k30二者協(xié)同作用有助于蛋白的成膜，減少凍干粉在凍干后出現(xiàn)的掛壁現(xiàn)象，提高凍干粉的成型率。采用本發(fā)明的凍干液配方進(jìn)行凍干，能獲得很好的成型效果，并且產(chǎn)品外觀良好，不出現(xiàn)掛壁等不良現(xiàn)象。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋說明，但具體實(shí)施例并不對本發(fā)明作任何限定。除非特別說明，實(shí)施例中，所涉及的試劑、方法均為本領(lǐng)域常用的試劑和方法。

實(shí)施例1

凍干液制備：1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的干酪素鈉，5％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甘露醇，0.1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的聚吡咯烷酮k30(pvpk30)溶解于0.01mol/lph為7.4的磷酸緩沖液(pbs)。

其余實(shí)施例和對比例的配方見表1

表1

猴細(xì)胞因子il-12/23elisa標(biāo)準(zhǔn)品的制備，包括如下步驟：

s1.對冷凍干燥的相關(guān)設(shè)備，例如西林瓶、架子、托盤進(jìn)行預(yù)冷，預(yù)冷至4℃；

s2.將猴細(xì)胞因子il-12/23標(biāo)準(zhǔn)蛋白用水溶解后，配制成母液，母液采用各實(shí)施例或?qū)Ρ壤膬龈梢合♂屩聊繕?biāo)濃度，得到標(biāo)準(zhǔn)濃度蛋白溶液；

s3.將s2.得到的標(biāo)準(zhǔn)濃度蛋白溶液分裝至s1.已預(yù)冷的容積為3ml西林瓶中，每瓶內(nèi)裝入1ml蛋白溶液，輕蓋上蓋子；

s4.將s3.盛有蛋白溶液的西林瓶放置在真空凍干機(jī)中至完全干燥，得到猴細(xì)胞因子il-12/23elisa標(biāo)準(zhǔn)品。其中實(shí)施例1、4、5為猴細(xì)胞因子il-12，實(shí)施例2、3為細(xì)胞因子il-23。對比例1～5均為猴細(xì)胞因子il-12。

本實(shí)施例1～5所得猴細(xì)胞因子il-12/23elisa標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過37℃加速老化試驗(yàn)，可以放置14天，采用elisa實(shí)驗(yàn)測試其活性，損失率小于1％，根據(jù)阿倫尼烏斯公式結(jié)論，采用本發(fā)明制備的猴細(xì)胞因子il-12/23elisa標(biāo)準(zhǔn)品用于elisa試劑盒4℃可保存2年以上。

凍干前后蛋白活性測試：

采用elisa法對實(shí)施例1制備的猴細(xì)胞因子il-12/23elisa標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白活性進(jìn)行測試，每一個濃度測試5個樣品，對比凍干后，加速老化14天與凍干前活性比值。詳細(xì)結(jié)果見表2

表2

比較實(shí)施例與對比例得到的猴細(xì)胞因子elisa標(biāo)準(zhǔn)品的外觀、活性損失率和成型率，結(jié)果如表3所示：

表3

從實(shí)施例與對比例1、2、3、4、5對比可以看出，當(dāng)不選用本發(fā)明所述方法的配方時，制備的凍干粉的產(chǎn)品容易存在掛壁現(xiàn)象，外觀不佳，并且成型率出現(xiàn)明顯下降，凍干過程的活性損失率升高，保存時間縮短。

人細(xì)胞因子il-12/23elisa標(biāo)準(zhǔn)品的制備，包括如下步驟：

s1.對冷凍干燥的相關(guān)設(shè)備，例如西林瓶、架子、托盤進(jìn)行預(yù)冷，預(yù)冷至4℃；

s2.將人細(xì)胞因子il-12/23標(biāo)準(zhǔn)蛋白用水溶解后，配制成母液，母液采用各實(shí)施例或?qū)Ρ壤膬龈梢合♂屩聊繕?biāo)濃度，得到標(biāo)準(zhǔn)濃度蛋白溶液；

s3.將s2.得到的標(biāo)準(zhǔn)濃度蛋白溶液分裝至s1.已預(yù)冷的容積為3ml西林瓶中，每瓶內(nèi)裝入1ml蛋白溶液，輕蓋上蓋子；

s4.將s3.盛有蛋白溶液的西林瓶放置在真空凍干機(jī)中至完全干燥，得到人細(xì)胞因子il-12/23elisa標(biāo)準(zhǔn)品。其中實(shí)施例1、4、5為人細(xì)胞因子il-12，實(shí)施例2、3為人細(xì)胞因子il-23。對比例1～5均為人細(xì)胞因子il-12。

比較實(shí)施例與對比例得到的人細(xì)胞因子elisa標(biāo)準(zhǔn)品的外觀、活性損失率和成型率，結(jié)果如表4所示：

表4

可以看出，本制備方法也適用于其它細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品的制備。