本發(fā)明屬于流式細胞術的樣品前處理技術領域，更具體地說，涉及一種基于流式結(jié)合icp-ms單細胞蛋白檢測的樣本前處理方法，特別涉及人外周血樣本的前處理方法。
背景技術：
流式細胞術是一種采用激光束激發(fā)單行流動的細胞，對它的散射光和攜帶的熒光進行探測，從而完成對快速直線流動狀態(tài)中的單列細胞或生物顆粒進行逐個、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術，具有檢測速度快、測量參數(shù)多、采集數(shù)據(jù)量大、分析全面、分選純度高、方法靈活等特點，被廣泛應用于臨床醫(yī)學、細胞學、生物學、微生物學、制藥學、生殖學等領域。作為最普遍使用的單細胞技術之一，流式技術一直在生物學各研究領域都有著廣泛的應用。一直以來，流式技術是分析復雜細胞群體的重要手段，它可以實現(xiàn)對細胞進行多參數(shù)分析，從而區(qū)分不同種類的細胞；其所能檢測參數(shù)的多少，也決定了我們對于所研究群體異質(zhì)性的了解程度。
目前流式細胞術的樣品前處理方法基本都是進行熒光染料標記，具體前處理方法為：1)收集2×10^6個細胞，用1ml冷的pbs重懸，1500rpm離心5min，棄上清；
2)拍打混勻細胞團塊，隨后加入1ul熒光直標的cd45抗體，混勻，冰上避光孵育15min；
3)加入1mlpbs重懸細胞，1500rpm離心5min，棄上清；
4)加入1ml1％中性多聚甲醛(注：用pbs將4％的多聚甲醛稀釋為1％濃度使用即可)重懸細胞，避光固定15min，隨后1500rpm離心5min，棄上清；
5)加入1mlpbs重懸細胞，1500rpm離心5min，棄上清；
6)用1ml含0.09％皂素的pbs重懸細胞，冰上避光放置10min，1500rpm離心5min，棄上清；
7)加入1mlpbs重懸細胞，1500rpm離心5min，棄上清；
8)以200ulpbs重懸細胞，加入hsp70抗體，冰上避光放置30min，再用1ml冷的pbs重懸細胞，1500rpm離心5min，棄上清，洗去未結(jié)合的一抗；
9)加入1mlpbs重懸細胞，1500rpm離心5min，棄上清；
10)以200ulpbs重懸細胞，加入fitc標記的二抗，冰上避光放置40min后，再用1ml冷的pbs重懸細胞，1500rpm離心5min，棄上清，洗去未結(jié)合的二抗；
11)加入1mlpbs重懸細胞，1500rpm離心5min，棄上清；
12)以200ulpbs重懸細胞，避光備用；上機檢測，每樣品計數(shù)5000-50000個細胞。
熒光染料的標記與金屬標簽標記細胞的原理不同，處理方法也迥異。故現(xiàn)有標記方法進行前處理的樣本無法很好的應用于基于流式結(jié)合icp-ms進行人外周血樣本單細胞蛋白檢測。樣本前處理的方法研究阻滯，將嚴重影響新型檢測方法檢測技術的發(fā)展與應用。
技術實現(xiàn)要素：
1.要解決的問題
針對現(xiàn)有的流式細胞術樣品前處理方法無法適用于金屬標簽標記細胞檢測的問題，本發(fā)明提供一種基于流式結(jié)合icp-ms單細胞蛋白檢測的樣本前處理方法，將金屬元素標簽標記的抗體與細胞表面抗原結(jié)合，將標記好的細胞與作為內(nèi)參用于標準化的beads混合，前處理過程中區(qū)分死細胞與活細胞，以免出現(xiàn)死細胞數(shù)量過多影響實驗結(jié)果的分析與闡述，區(qū)分單細胞與細胞二聚體、三聚體甚至多聚體，能很好的滿足流式結(jié)合icp-ms單細胞蛋白檢測需求。
2.技術方案
為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術方案如下：
基于流式結(jié)合icp-ms單細胞蛋白檢測的樣本前處理方法，包括以下步驟：
(1)全血樣本的采集和運輸：采集全血樣本，樣本中添加抗凝劑，常溫保存運輸；
(2)pbmc細胞分離：采用ficoll淋巴細胞分離液對全血樣本中的細胞進行分離；
(3)細胞活性染色：采用順鉑對分離的細胞進行染色，染色時間控制在5-10min，染色結(jié)束后離心去上清液，對細胞進行重懸；
(4)細胞刺激：將細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15～30min，使細胞恢復“靜息”狀態(tài)，并根據(jù)適當?shù)拇碳の锛按碳し椒▽毎M行分組刺激；
(5)細胞固定：對步驟(3)中重懸的細胞進行pfa固定、凍存；
(6)表面抗體染色：將pfa固定、凍存的細胞融化后，重懸，加入細胞染色緩沖液，離心去除上清后，加入blockingmix重懸，常溫靜置后加入cocktail混勻；
(7)胞內(nèi)磷酸化蛋白染色：將表面抗體染色后的細胞用pbs和甲醇處理后，用cellstainingbuffer重懸，加入磷酸化抗體cocktail混勻，常溫孵育之后用cellstainingbuffer清洗去上清；
(8)單細胞標記：步驟(7)中染色后的細胞用pbs緩沖液重懸，滴加入含有金屬元素標記物的cellintercalation溶液進行標記，隨后分別用cellstainingbuffer和水進行清洗，最后將細胞重懸于含有eqbeads的水中保存。
更進一步地，所述步驟(1)中全血樣本常溫保存的溫度范圍為15-35℃。
更進一步地，步驟(2)中pbmc細胞分離的具體步驟為：用生理鹽水/pbs/hanks液將全血樣本1：1稀釋后，轉(zhuǎn)移至含1倍體積ficoll淋巴細胞分離液的離心管內(nèi)，離心，吸出中層白色的pbmc細胞轉(zhuǎn)移至新的離心管中，以無血清dmem/1640離心清洗后，再用無血清的dmem/1640重懸細胞沉淀。
更進一步地，步驟(4)中所述的刺激物為任何可以引起細胞蛋白和基因調(diào)控變化的藥物和激酶，包括但不限制于阿霉素、紫杉醇、干擾素、生長激素，刺激的方式為在細胞懸液中直接加入，目的是要刺激細胞發(fā)生變化，并進行后續(xù)的刺激物與被刺激細胞蛋白與基因變化的作用關系。
更進一步地，步驟(5)中細胞固定的具體步驟為：將步驟(3)中重懸的細胞加入等體積的2×固定液混勻，孵育后加入冰冷的cellstainingbuffer，然后離心分離，用凍存液重懸細胞。
更進一步地，步驟(6)的blockingmix溶液中包括fcreceptorblockingsolution和cellstaningbuffer，兩者的體積比為1:10；cocktail溶液中含有抗體。
更進一步地，步驟(7)中的胞內(nèi)磷酸化蛋白染色的具體步驟為：將表面抗體染色后的細胞用pbs混勻后放置冰上，然后加上預冷的甲醇混勻，放置冰上15min以上，離心棄上清，用cellstainingbuffer重懸，加入等體積的磷酸化抗體cocktail混勻。
更進一步地，步驟(8)中的金屬元素標記物為ir或者rh。
3.有益效果
相比于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果為：
(1)本發(fā)明將金屬元素標簽標記的抗體與細胞表面抗原結(jié)合，將標記好的細胞與作為內(nèi)參用于標準化的beads混合，以順鉑染色區(qū)分死細胞與活細胞，以免出現(xiàn)死細胞數(shù)量過多影響實驗結(jié)果的分析與闡述；
(2)本發(fā)明可用于制備基于流式結(jié)合icp-ms單細胞蛋白檢測的人外周血細胞樣本，用于單細胞水平多蛋白信號的檢測，本發(fā)明的方法處理方便，所用處理方法、試劑皆為常用方法、試劑，操作簡便；
(3)本發(fā)明采用同位素金屬標記法進行標記，克服了傳統(tǒng)的熒光標記法存在的熒光信號易猝滅、易漂白，且非特異性背景高等不足之處；
(4)本發(fā)明提供的方法可以在一個細胞上標記30-60種金屬，而現(xiàn)有技術只能在一個細胞上標記少量的金屬；
(5)本發(fā)明能夠通過金屬同時標記細胞表面蛋白、內(nèi)部蛋白、基因、mrna，而現(xiàn)有技術只能標記表面或者內(nèi)部蛋白。
附圖說明
圖1為本發(fā)明中前處理方法的流程示意圖；
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進一步進行描述。
實施例1
如圖1所示，基于流式結(jié)合icp-ms單細胞蛋白檢測的樣本前處理方法的步驟包括以下內(nèi)容：
(一)人外周血樣本的處理與凍存(提取單個核細胞-細胞活性染色-細胞刺激-細胞固定)
1.試劑準備。a.試劑平衡至常溫：ficoll淋巴細胞分離液；ca2+/mg2+freepbs；2×fixationsolution(3.2％pfainpbs)；人紅細胞裂解液(可選)；cellstainingbuffer(0.5％bsa+0.02％nan3inpbs)。b.需要預熱的試劑：fbsfreedmem/1640(37℃)。c.將以下試劑冰上放置：含有10％dmso的cellstainingbuffer；cellstainingbuffer；cisplatin5mm；
2.全血樣本的采集和運輸。血液標本采集是分析前質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)。推薦用肝素或者檸檬酸鹽作為抗凝劑，本實施例中采用肝素作為抗凝劑，按照醫(yī)院里的標準用量來使用；edta易與金屬標簽元素螯合影響抗體標記，故而edta抗凝全血中提取出的pbmc樣本可能需要額外的洗滌步驟。一般情況下，在4小時內(nèi)將全血樣本需要送達實驗室，常溫運輸；(22攝氏度最佳，不要低于15度或者高于35度)；
3.pbmc細胞分離。用生理鹽水/pbs/hanks液(三者的混合液，一般按照1:1:1的體積比混合后使用)將全血樣本1：1稀釋后，用一次性吸管緩緩將其加入含1倍體積ficoll淋巴細胞分離液的離心管內(nèi)，注意將離心管傾斜，不要晃動，以免擾動液面影響分層。常溫400g，剎車速度設為5，離心20min；吸出中層白色的pbmc細胞轉(zhuǎn)移至新的15ml離心管中。再以預熱的無血清dmem/1640，室溫下300g，5min離心清洗細胞一遍后，用1ml預熱的無血清的dmem/1640重懸細胞沉淀。若紅細胞太多，可用紅細胞裂解液處理，但對細胞活性影響較大，故若需對胞內(nèi)蛋白磷酸化檢測時謹慎使用。
4.細胞活性(順鉑)染色。短時間(5～10min)的處理過程中，順鉑無法進入活細胞內(nèi)部，因此胞內(nèi)順鉑信號很弱。而死細胞內(nèi)大量蛋白與順鉑共價結(jié)合，會呈現(xiàn)較強的信號，可以此來區(qū)分細胞活性。細胞密度調(diào)至1×107/ml以下，與1ul終濃度為5um的順鉑混勻，37度，孵育5min；加入2～5倍體積(本實施例中采用的是3倍體積)的常溫的cellstainingbuffer，混勻中止標記反應，常溫300g，離心5min，去上清后用常溫的cellstainingbuffer(固定用)重懸或預熱的培養(yǎng)基(刺激用)進行重懸。活性染色步驟中用到的所有cellstainingbuffer中都含有0.5％bsa+0.02％nan3。
5.細胞刺激。將細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min(一般根據(jù)需要來選擇培養(yǎng)的時間，15～30min均可)，使細胞恢復“靜息”狀態(tài)。并根據(jù)適當?shù)拇碳の锛按碳し椒▽毎M行分組刺激，本實施例中采用γ-干擾素作為刺激物，加入細胞溶液中混合均勻，然后用于細胞固定實驗，一般建議在細胞刺激之后2小時內(nèi)使用。
6.細胞固定。重懸混勻細胞懸液；加入等倍體積的2×固定液(含3.2％pfa的pbs)后立即用移液器吹打或渦旋振蕩混勻，以減少細胞形成二聚體。室溫孵育10min。加入4ml冰冷的cellstainingbuffer以減慢pfa固定反應。4℃，600g，離心5min。去上清。加入1ml凍存液(含10％dmso的cellstaningbuffer)重懸細胞，放置在冰上靜置用于后續(xù)染色或置于冰上靜置數(shù)分鐘后放入-80度冰箱凍存。樣本應注意避免反復凍融。在前處理過程中，通過在顯微鏡下，細胞計數(shù)的辦法，分析每1000個細胞里有多少二聚體、三聚體等。
(二)金屬標簽標記的抗體與細胞結(jié)合(細胞表面抗體染色-細胞內(nèi)磷酸化蛋白染色-單細胞標記)
1.表面抗體染色。對于用pfa固定、凍存的細胞，在冰上或者冷水浴中融化后，vortex重懸細胞，取1ml(106個)細胞溶液加入2mlcellstaningbuffer，600g5min離心去上清，加入50ulblockingmix(每份人pbmc(外周血單個核細胞)樣本：5ulfcreceptorblockingsolution+50ulcsb，取其中的50ul)重懸，常溫放置10min。每管加入50ulcocktail(單個樣品的各抗體用量均為1.1ul，總體積55ul，取其中的5ul，見下表)混勻，常溫30分鐘。加入2mlcellstainingbuffer，常溫500g離心5min，去上清并重復一次。
表1cocktail的組成成分
2.胞內(nèi)磷酸化蛋白染色。經(jīng)過前面的步驟之后，加入2mlpbs，500g離心5min，去上清。加入100ulpbs，輕輕votex混勻細胞，冰上放置3分鐘。加入1ml預冷的甲醇，立即用槍頭吹勻，冰上放置15min以上，加入2mlpbs，800g離心5分鐘，棄上清。加入2mlcellstainingbuffer，800g離心5min，棄上清。每個樣本用50ulcellstainingbuffer重懸，加入50ul磷酸化抗體cocktail(配制方法同表面抗體)，混勻，常溫孵育30分鐘。加入2mlcellstainingbuffer，800g離心5min，棄上清。
3.cellintercalation單細胞標記。加入2mlcellstainingbuffer，常溫500g離心5min，去上清。加入100ulpbs重懸細胞，邊振蕩邊逐滴加入1mlcellintercalation溶液(在fixandpermbuffer里加入終濃度為125nm的ir(銥元素)或者500nm的rh(銠元素)，每個樣品用量1ml)。分別用2mlcellstaingbuffe及2ml水，800g離心5min，清洗細胞1次及3次后，加入1ml含有10％eqbeads的水重懸，將樣本置于冰上。至此，樣本前處理已完成，可用于后續(xù)檢測。
基于金屬同位素標記流式結(jié)合icp-ms的單細胞蛋白檢測方法，其步驟為：
(1)樣品標記：按照前述的方法采用金屬元素標記的特異抗體，作為靶標表達水平的報告因子；其中用于標記的金屬元素，其原子質(zhì)量介于88-210da之間，常用于標記的金屬元素為鑭系金屬元素，本實施例中分別采用ir(銥元素)或者rh(銠元素)對細胞進行標記。
(2)霧化處理：用蠕動泵將標記后的樣品溶液均勻的送入霧化器進行霧化處理，去除其中的水分；霧化溫度為200℃左右，霧化器中的液體流道為氬氣環(huán)境，氬氣流速0.15l/min。
(3)plasma離子化：單細胞霧化懸滴進入plasma后被氣化、原子化、離子化，形成離子云；plasma內(nèi)溫度范圍為5000k。
(4)去除未離子化物質(zhì)及光子：利用偏轉(zhuǎn)電場及加速電場的結(jié)合去除離子云流中存在的未離子化的物質(zhì)及光子；
(5)icp-ms檢測：用icp-ms觀察單個細胞的原子質(zhì)量譜(icp-ms檢測全程在真空狀態(tài)下進行)，將原子質(zhì)量譜的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細胞表面和內(nèi)部的信號分子數(shù)據(jù)，并通過專業(yè)分析軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行分析，從而實現(xiàn)對細胞表型和信號網(wǎng)絡的精細觀察。
傳統(tǒng)流式細胞儀通過熒光染料標記抗體，繼而抗體與抗原結(jié)合，在鞘液包繞下，通過流動室，形成單細胞懸液，經(jīng)激光器，并將前向散射角、側(cè)向散射角、熒光激發(fā)信號燈信息經(jīng)由pmt傳遞給計算機分析。本實施應用金屬元素標簽代替熒光染料標簽，經(jīng)過nebulizer形成單細胞懸液，由plasmatorch將單細胞懸液離子化，并有tof進行檢測。由于本發(fā)明技術的使用，使得單細胞蛋白水平檢測結(jié)果數(shù)據(jù)量及數(shù)據(jù)維度激增，因而分析數(shù)據(jù)時，可以應用多種降維算法、聚類分析算法。
對于液體樣本的分析，在進入plasma離子化之前需要盡可能地除去其中的水分。因此nebulizer的作用即為將樣本霧化，隨后通過加熱至200-250℃左右的霧化室，進入plasma。nebulizer中心有一內(nèi)置毛細管，為樣本液體流道。毛細管管流道為氬氣環(huán)境。氬氣流速0.15-0.35l/min。當樣本流出nebulizer尖端時，氬氣流的剪切力使得樣本流形成微小水珠，即霧化。本發(fā)明用流式細胞原理分離單個細胞，即細胞進入單細胞懸浮培養(yǎng)霧化，經(jīng)由氬等離子體，共價鍵斷裂，產(chǎn)生自由原子，并完成充電過程。icptorch炬管主要有三層結(jié)構(gòu)，外層的叫做外管，其次是內(nèi)管，中間的是中心管。外管中通的是大流量的氬氣，叫做冷卻氣，冷卻氣提供給等離子體氣體源源不斷的ar原子，在等離子體中不斷的電離放熱，產(chǎn)生的ar離子在射頻線圈中振蕩碰撞，從而維持了很高的溫度，伴隨著大量離子留出等離子體，又有很多ar原子流入，從而達到了一種平衡。冷卻氣的流量大概為18l/min。在內(nèi)管中流動的氣體叫做輔助氣，也是氬氣，它的作用是給等離子體火焰向前的推力，實現(xiàn)不斷的電離，也很好的了中心管，以免過高的溫度使其熔化。輔助氣的流量為～1l/min。中心管中流出的是從霧室排出的樣品溶液的氣溶膠。
單細胞霧化水珠流出霧化室后即進入icp。icptorch的原理是當在感應線圈上施加高頻電場時，由于某種原因(如電火花等)在等離子體工作氣體中部分電離產(chǎn)生的帶電粒子在高頻交變電磁場的作用下做高速運動，碰撞氣體原子，使之迅速、大量電離，形成雪崩式放電，電離的氣體在垂直于磁場方向的截面上形成閉合環(huán)形的渦流，在感應線圈內(nèi)形成相當于變壓器的次級線圈并同相當于初級線圈的感應線圈耦合，這種高頻感應電流產(chǎn)生的高溫又將氣體加熱、電離，并在管口形成一個火炬狀的穩(wěn)定的等離子體焰矩。其特點如下：
(1)工作溫度高、同時工作氣體為惰性氣體(氬氣)，因此原子化條件良好，有利于難熔化合物的分解及元素的激發(fā)，對大多數(shù)元素有很高的靈敏度；
(2)由于趨膚效應的存在，穩(wěn)定性高，自吸現(xiàn)象小，測定的線性范圍寬；
(3)由于電子密度高，所以堿金屬的電離引起的干擾較??；
(4)icp屬無極放電，不存在電極污染現(xiàn)象；
(5)icp的載氣流速較低，有利于試樣在中央通道中充分激發(fā)，而且耗樣量也較少；
(6)采用惰性氣體(氬氣)作為工作氣體，因而光譜背景干擾少
單細胞懸滴進入plasma時，plasma內(nèi)溫度范圍為5000-10000k。因此進入plasma的單細胞懸滴被瞬間氣化、原子化、離子化，由此單細胞轉(zhuǎn)化為一團離子云。
離子化后的離子云流內(nèi)包含大量未離子化的物質(zhì)及光子等，若不濾除，易黏附于儀器結(jié)構(gòu)，引起檢測信號漂移。其中光子若抵達檢測器將被誤以為是待檢測離子，引起檢測結(jié)果準確度下降。因此，在進入tof檢測前，需去除其中的未離子化物質(zhì)及光子。利用偏轉(zhuǎn)電場及加速電場的結(jié)合即可實現(xiàn)。采樣錐作用是把來自等離子體中心通道的載氣流，即離子流大部分吸入錐孔，進入第一級真空室。采樣錐通常由ni、al、cu、pt等金屬制成。
檢測技術全程要求真空狀態(tài)。因為結(jié)合的質(zhì)譜技術要求離子具有較長的平均自由程，以便離子在通過檢測器時與另外的離子、分子、原子碰撞的幾率最低，真空度直接影響了離子傳輸效率、質(zhì)譜波形及檢測器壽命。
本發(fā)明應用四極管質(zhì)量分析器的原理篩選原子質(zhì)量。四極管的作用是基于在四根電極之間的空間產(chǎn)生一個隨時間變化的特殊的電磁場，只有給定荷質(zhì)比(m/z)的離子才能獲得穩(wěn)定的路徑而通過極棒，從另一端出射，其它離子將被過分偏轉(zhuǎn)，與極棒碰撞，并在極棒上被中和而丟失。通過四極管去除常見生物元素后，限定檢測的原子量的檢測范圍(88-210da)，分辨率極高。篩選檢測原子質(zhì)量較大的原子，濾除原子量小的元素，保留較寬的原子量檢測范圍的同時，由于該類元素在細胞內(nèi)的含量極低，所以信號的背景極低。金屬元素同位素的選擇不局限于鑭系金屬?？梢允窃淤|(zhì)量介于88-210da之間的且螯合物安全無毒可合成的任意元素。金屬標簽元素種類豐富，通道數(shù)量激增，信息量亦成倍增長。金屬標簽可以是通過金屬螯合物與抗體結(jié)合。
基于飛行時間(timeofflight)原理進行檢測。用感應耦合等離子質(zhì)譜(icp-ms)觀察單個細胞的原子質(zhì)量譜，原子的質(zhì)量與細胞表面和內(nèi)部的信號分子數(shù)據(jù)呈現(xiàn)一一對應的關系，即檢測到1個原子質(zhì)量信號就代表有一個細胞表面和內(nèi)部的信號分子，最后將原子質(zhì)量譜的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細胞表面和內(nèi)部的信號分子數(shù)據(jù)，并通過專業(yè)分析軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行分析，從而實現(xiàn)對細胞表型和信號網(wǎng)絡的精細觀察。
信號分子檢測通道數(shù)量的增加，可實現(xiàn)從單個樣本獲取更大的信息量，為單細胞蛋白質(zhì)組學的研究提供了新的手段。然而數(shù)據(jù)量及數(shù)據(jù)維度的激增使得原有傳統(tǒng)流式的數(shù)據(jù)分析圖無法很好地呈現(xiàn)數(shù)據(jù)結(jié)果。應用多種降維算法、聚類分析算法、分群算法等進行數(shù)據(jù)分析與可視化。目前已有大量相關算法文獻報道。如spade、drevi、accense、xshift、visne以及phenograp。