本發(fā)明屬于流式單細胞蛋白檢測技術領域，具體地說，涉及一種蛋白標記技術，更具體地說，涉及一種基于金屬同位素標記流式結合icp-ms的單細胞蛋白檢測方法，本發(fā)明涉及在單細胞尺度上同時對至少37種以上的蛋白表達進行同時檢測的技術。

背景技術：

流式細胞術是一種采用激光束激發(fā)單行流動的細胞，對它的散射光和攜帶的熒光進行探測，從而完成對快速直線流動狀態(tài)中的單列細胞或生物顆粒進行逐個、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術，具有檢測速度快、測量參數(shù)多、采集數(shù)據(jù)量大、分析全面、分選純度高、方法靈活等特點，被廣泛應用于臨床醫(yī)學、細胞學、生物學、微生物學、制藥學、生殖學等領域。作為最普遍使用的單細胞技術之一，流式技術一直在生物學各研究領域都有著廣泛的應用。一直以來，流式技術是分析復雜細胞群體的重要手段，它可以實現(xiàn)對細胞進行多參數(shù)分析，從而區(qū)分不同種類的細胞；其所能檢測參數(shù)的多少，也決定了我們對于所研究群體異質性的了解程度。

流式細胞儀主要由4部分組成：液流系統(tǒng)、光學系統(tǒng)、電子系統(tǒng)、分析系統(tǒng)。它只能檢測懸浮的單細胞或微粒的信號，一般是將待測細胞或微粒進行熒光染色后制成懸液標本，在一定氣體壓力下將待測樣品壓入流動室(核心部件，由石英玻璃制成)，形成一個圓形的流束(即鞘流)，細胞在鞘流液約束下細胞成單行排列依次通過激光檢測區(qū)。在激光光源和流動室之間有兩個圓柱形透鏡，將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束(22μm×66μm)，使通過激光檢測區(qū)的細胞受照強度一致，最大限度的減少雜散光的干擾。細胞在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光，這些熒光信號的強度代表所測細胞膜表面抗原的強度或其細胞內核內物質的濃度，經(jīng)光電倍增管接收后可轉換為電信號，再通過模數(shù)轉換器，將連續(xù)的電信號轉換為可被計算機識別的數(shù)字信號，從而使計算機采集分析。檢測數(shù)據(jù)的顯示視測量參數(shù)的不同有多種形式可供選擇。對于雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù)，既可以單獨顯示每個參數(shù)的直方圖，也可以選擇二維的三點圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。

現(xiàn)代流式細胞術綜合了流體力學技術、激光技術、電子物理技術、光電測量技術、計算機技術、熒光化學技術及單克隆抗體技術，是多學科多領域技術進步的結晶。隨著現(xiàn)代科技的高速發(fā)展，為了滿足生命科學對細胞分析更高層次的要求，流式細胞技術仍然在快速發(fā)展，并已經(jīng)在檢測技術、分選技術及高通量分析等方面取得了許多突破。流式細胞儀性能的技術指標主要有熒光分辨率、熒光靈敏度、分析參數(shù)多少及分析、分選速度及純度等。目前隨著新的熒光色素分子的不斷發(fā)現(xiàn)，熒光標記技術的進步和流式細胞儀的多激光激發(fā)等技術的進展，多色熒光分析得到迅速發(fā)展，三色或四色流式細胞儀已常規(guī)應用于臨床檢驗中。應用多色流式細胞儀可同時檢測多個標記分子，減少試劑的重復使用、所需樣本量以及分析時間，從而降低檢測成本。多色熒光分析是流式細胞技術發(fā)展的一個重要方向。然而，如附圖1所示，熒光染料的開發(fā)目前已達瓶頸。同時，基于熒光標記的流式細胞術由于熒光光譜的重疊帶來的誤差，一些高端的流式細胞儀也只能夠同時測量10個熒光信號，在用于研究單細胞水平上的功能和特征時，受到限制。

icp-ms是一種靈敏度非常高的元素分析儀器，可以測量溶液中含量在ppb或ppb以下的微量元素。廣泛應用于半導體、地質、環(huán)境以及生物制藥等行業(yè)中。icp-ms全稱是電感藕合等離子體質譜，它是一種將icp技術和質譜結合在一起的分析儀器。icp利用在電感線圈上施加的強大功率的高頻射頻信號在線圈內部形成高溫等離子體，并通過氣體的推動，保證了等離子體的平衡和持續(xù)電離，在icp-ms中，icp起到離子源的作用，高溫的等離子體使大多數(shù)樣品中的元素都電離出一個電子而形成了一價正離子。

icp-ms所用電離源是感應耦合等離子體(icp)，它與原子發(fā)射光譜儀所用的icp是一樣的，其主體是一個由三層石英套管組成的炬管，炬管上端繞有負載線圈，三層管從里到外分別通載氣，輔助氣和冷卻氣，負載線圈由高頻電源耦合供電，產(chǎn)生垂直于線圈平面的磁場。如果通過高頻裝置使氬氣電離，則氬離子和電子在電磁場作用下又會與其它氬原子碰撞產(chǎn)生更多的離子和電子，形成渦流。強大的電流產(chǎn)生高溫，瞬間使氬氣形成溫度可達10000k的等離子焰炬。樣品由載氣帶入等離子體焰炬會發(fā)生蒸發(fā)、分解、激發(fā)和電離，輔助氣用來維持等離子體，需要量大約為1l/min。冷卻氣以切線方向引入外管，產(chǎn)生螺旋形氣流，使負載線圈處外管的內壁得到冷卻，冷卻氣流量為10-15l/min。最常用的進樣方式是利用同心型或直角型氣動霧化器產(chǎn)生氣溶膠，在載氣載帶下噴入焰炬，樣品進樣量大約為1ml/min，是靠蠕動泵送入霧化器的。在負載線圈上面約10mm處，焰炬溫度大約為8000k，在這么高的溫度下，電離能低于7ev的元素完全電離，電離能低于10.5ev的元素電離度大于20％。由于大部分重要的元素電離能低于10.5ev，因此具有很高的靈敏度，少數(shù)電離能較高的元素，如c、o、cl、br等也能檢測，只是靈敏度較低。質譜是一個質量篩選和分析器，通過選擇不同質核比(m/z)的離子通過來檢測到某個離子的強度，進而分析計算出某種元素的強度。但icp-ms價格昂貴，干擾大，且在生物醫(yī)藥領域的應用受限，更無法實現(xiàn)單細胞水平檢測。中國專利申請?zhí)枮?01480009995.6，申請公布日為2015年12月23日的專利申請文件公開了一種用于使用激光燒蝕電感耦合等離子體質譜法(la-icp-ms)分析樣品的方法和設備，將激光束的脈沖導向樣品以便產(chǎn)生對于每個脈沖的樣品的羽流；區(qū)別性地捕獲對于每個脈沖的每個羽流；將區(qū)別性地捕獲的羽流轉移至icp；以及在icp中電離區(qū)別性地捕獲和轉移的羽流并產(chǎn)生用于質譜流式細胞術分析的離子。但是該專利中公開的方法檢測通道有限，且不能實現(xiàn)在蛋白和基因兩個組學層面的共同檢測。

一方面，傳統(tǒng)流式細胞儀的檢測通道數(shù)量已經(jīng)很難有質的提升。目前美國bd最高端的分析型流式細胞儀具有20個檢測通道，而實驗室常用的通道數(shù)量一般少于12個。由于熒光的發(fā)射信號具有較長的帶寬，流式信號的檢測窗口已經(jīng)非常擁擠，很難容納新的檢測通道。另一方面，發(fā)射光譜的重疊會導致通道間的信號之間會相互干擾，當檢測較多通道多于8個時，實驗設計和補償計算已經(jīng)變得相當復雜，使得多參數(shù)檢測成為了一項復雜、費時的技術性工作，從而限制了它的應用。再者，熒光染料的熒光信號易猝滅、易漂白，且非特異性背景高。而icp-ms價格昂貴，干擾大，樣品制備困難，分析速度慢常規(guī)離子源效率低，且在生物醫(yī)藥領域的應用受限，更無法實現(xiàn)單細胞水平檢測。

隨著我們對于造血發(fā)生、免疫細胞分化成熟、癌細胞轉化、干細胞自我更新和分化、誘導多功能干細胞等關鍵生物學領域的研究逐漸深入，我們需要更清晰的了解細胞群體內部的各種變化，對流式的通道數(shù)量和信號質量有了更高的要求。傳統(tǒng)的熒光流式細胞儀已經(jīng)不能完全滿足科研的需要，急切需要一種更加高效、易用、可以進行更多參數(shù)檢測的流式細胞儀用于以后的科學研究。

技術實現(xiàn)要素：

1.要解決的問題

針對現(xiàn)有流式細胞儀檢測通道少、信號之間會相互干擾、檢測多參數(shù)時復雜、費時的問題，以及icp-ms價格昂貴，干擾大、無法實現(xiàn)單細胞水平檢測等問題，本發(fā)明提供一種基于金屬同位素標記流式結合icp-ms的單細胞蛋白檢測方法，采用金屬元素標簽標記抗體染料，利用質譜原理對單細胞進行多參數(shù)定量檢測，應用于單細胞蛋白組學分析。將質譜技術與流式細胞技術兩種實驗平臺的融合，既繼承了傳統(tǒng)流式細胞儀的高速分析的特點，又具有質譜檢測的高分辨能力。

2.技術方案

為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術方案如下：

基于金屬同位素標記流式結合icp-ms的單細胞蛋白檢測方法，包括以下步驟：

(1)樣品標記：采用金屬元素標記的特異抗體或染料標記或識別細胞表面和內部的信號分子，作為靶標表達水平的報告因子；

(2)霧化處理：將標記后的樣品溶液進行霧化處理，去除其中的水分；

(3)plasma離子化：單細胞霧化懸滴進入plasma后被氣化、原子化、離子化，形成離子云；

(4)去除未離子化物質及光子：利用偏轉電場及加速電場的結合去除離子云流中存在的未離子化的物質及光子；

(5)icp-ms檢測：用icp-ms觀察單個細胞的原子質量譜，將原子質量譜的數(shù)據(jù)轉換為細胞表面和內部的信號分子數(shù)據(jù)，并通過專業(yè)分析軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行分析，從而實現(xiàn)對細胞表型和信號網(wǎng)絡的精細觀察。

更進一步地，所述步驟(1)中金屬元素與特異抗體或染料之間通過多聚螯合物實現(xiàn)共價耦聯(lián)。

更進一步地，用于標記的金屬元素，其原子質量介于88-210da之間。

更進一步地，用于標記的金屬元素為鑭系金屬元素。

更進一步地，所述步驟(2)中用蠕動泵將樣品溶液均勻的送入霧化器，霧化溫度為200-250℃左右。

更進一步地，所述步驟(2)中樣品溶液在霧化器中霧化時，霧化器中的液體流道為氬氣環(huán)境，氬氣流速0.15-0.35l/min。

更進一步地，所述步驟(3)中plasma內溫度范圍為5000-10000k。

更進一步地，所述步驟(5)中的icp-ms檢測全程在真空狀態(tài)下進行。

3.有益效果

相比于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果為：

(1)本發(fā)明針對熒光染料存在熒光信號易猝滅、易漂白，且非特異性背景高等缺陷進行了改進，采用金屬元素標簽標記抗體染料，利用質譜原理對單細胞進行多參數(shù)定量檢測，應用于單細胞蛋白組學分析；將質譜技術與流式細胞技術兩種實驗平臺的融合，既繼承了傳統(tǒng)流式細胞儀的高速分析的特點，又具有質譜檢測的高分辨能力；

(2)本發(fā)明提供的樣品標記方法具有創(chuàng)新性，應用稀土金屬元素代替?zhèn)鹘y(tǒng)熒光標記，通常是金屬元素標記的特異抗體或者染料(通過螯合集團聚合物鏈共軛連接上純化過的穩(wěn)定重金屬同位素)標記或識別細胞表面和內部的信號分子，作為靶標表達水平的報告因子，從根本上解決了熒光串色的問題，并實現(xiàn)了幾十個參數(shù)的同時測量。這樣不僅使實驗流程得到簡化，也節(jié)約了標本和試劑；

(3)本發(fā)明采用金屬元素標記代替熒光標記可避免由于熒光波段重疊帶來的串色補償?shù)睦_，具有非常寬的原子量檢測范圍(88～210da)，相鄰通道間的干擾<0.3％，通道數(shù)量增加同時避免了補償計算，而傳統(tǒng)流式細胞技術主要基于對熒光發(fā)射光譜的檢測，故而存在檢測通道數(shù)量限制以及光譜重疊串色而需進行復雜補償?shù)倪^程；

(4)本發(fā)明中可使用的金屬標簽元素種類豐富，在細胞中的含量極低，同時金屬原素通過多聚螯合物實現(xiàn)與抗體的共價耦聯(lián)，這種多聚螯合物與細胞組分的非特異性結合能力極低，所以信號的背景極低；本發(fā)明通道數(shù)量的激增帶來信息量的成倍增長，而各種分析方法如spade、pca、visne以及gemstone通過對數(shù)據(jù)進行降維處理，可充分提取有用的生物學信息；

(5)本發(fā)明應用蠕動泵把溶液樣品比較均勻的送入霧化器，并同時排除霧化室中的廢液，通過控制蠕動泵的轉速，可以得到理想的進樣速度。

附圖說明

圖1為熒光染料技術的發(fā)展示意圖；

圖2為本發(fā)明樣品標記方法的示意圖；

圖3為鑭系金屬常用的polymer結構示意圖；

圖4為質譜檢測法與傳統(tǒng)的熒光檢測法相比的優(yōu)勢示意圖；

圖5為傳統(tǒng)流式細胞儀與本發(fā)明的原理圖；

圖6為本發(fā)明中霧化的示意圖；

圖7為本發(fā)明中去除未離子化物質及光子的示意圖；

圖8為本發(fā)明中霧化與流式細胞的對比圖；

圖9為本發(fā)明中四極管的原理示意圖；

圖10為本發(fā)明中可用于標記的金屬元素示意圖，圖中帶有“√”標記的元素標簽可用于dna標記；帶有“o”標記的元素標簽可用于與抗體結合標記抗體；灰色標記為傳統(tǒng)生物學icp-ms可用的檢測元素；

圖11為本發(fā)明中基于飛行時間的檢測原理示意圖；

圖12為本發(fā)明中實施例1的實驗結果圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明進一步進行描述。

實施例1

附圖5為傳統(tǒng)流式細胞儀(upperpanel)與本實施(lowerpanel)的原理圖對比。傳統(tǒng)流式細胞儀通過熒光染料標記抗體，繼而抗體與抗原結合，在鞘液包繞下，通過流動室，形成單細胞懸液，經(jīng)激光器，并將前向散射角、側向散射角、熒光激發(fā)信號燈信息經(jīng)由pmt傳遞給計算機分析。本實施應用金屬元素標簽代替熒光染料標簽，經(jīng)過nebulizer形成單細胞懸液，由plasmatorch將單細胞懸液離子化，并有tof進行檢測。由于本發(fā)明技術的使用，使得單細胞蛋白水平檢測結果數(shù)據(jù)量及數(shù)據(jù)維度激增，因而分析數(shù)據(jù)時，可以應用多種降維算法、聚類分析算法。

對于液體樣本的分析，在進入plasma離子化之前需要盡可能地除去其中的水分。因此nebulizer的作用即為將樣本霧化，隨后通過加熱至200-250℃左右的霧化室，進入plasma。nebulizer中心有一內置毛細管，為樣本液體流道。毛細管管流道為氬氣環(huán)境。氬氣流速0.15-0.35l/min。當樣本流出nebulizer尖端時，氬氣流的剪切力使得樣本流形成微小水珠，即霧化，如圖6所示。本發(fā)明用流式細胞原理分離單個細胞，即細胞進入單細胞懸浮培養(yǎng)霧化，經(jīng)由氬等離子體，共價鍵斷裂，產(chǎn)生自由原子，并完成充電過程。icptorch炬管主要有三層結構，外層的叫做外管，其次是內管，中間的是中心管。外管中通的是大流量的氬氣，叫做冷卻氣，冷卻氣提供給等離子體氣體源源不斷的ar原子，在等離子體中不斷的電離放熱，產(chǎn)生的ar離子在射頻線圈中振蕩碰撞，從而維持了很高的溫度，伴隨著大量離子留出等離子體，又有很多ar原子流入，從而達到了一種平衡。冷卻氣的流量大概為18l/min。在內管中流動的氣體叫做輔助氣，也是氬氣，它的作用是給等離子體火焰向前的推力，實現(xiàn)不斷的電離，也很好的了中心管，以免過高的溫度使其熔化。輔助氣的流量為～1l/min。中心管中流出的是從霧室排出的樣品溶液的氣溶膠。

單細胞霧化水珠流出霧化室后即進入icp。icptorch的原理是當在感應線圈上施加高頻電場時，由于某種原因(如電火花等)在等離子體工作氣體中部分電離產(chǎn)生的帶電粒子在高頻交變電磁場的作用下做高速運動，碰撞氣體原子，使之迅速、大量電離，形成雪崩式放電，電離的氣體在垂直于磁場方向的截面上形成閉合環(huán)形的渦流，在感應線圈內形成相當于變壓器的次級線圈并同相當于初級線圈的感應線圈耦合，這種高頻感應電流產(chǎn)生的高溫又將氣體加熱、電離，并在管口形成一個火炬狀的穩(wěn)定的等離子體焰矩。其特點如下：

(1)工作溫度高、同時工作氣體為惰性氣體(氬氣)，因此原子化條件良好，有利于難熔化合物的分解及元素的激發(fā)，對大多數(shù)元素有很高的靈敏度；

(2)由于趨膚效應的存在，穩(wěn)定性高，自吸現(xiàn)象小，測定的線性范圍寬；

(3)由于電子密度高，所以堿金屬的電離引起的干擾較??；

(4)icp屬無極放電，不存在電極污染現(xiàn)象；

(5)icp的載氣流速較低，有利于試樣在中央通道中充分激發(fā)，而且耗樣量也較少；

(6)采用惰性氣體(氬氣)作為工作氣體，因而光譜背景干擾少

單細胞懸滴進入plasma時，plasma內溫度范圍為5000-10000k。因此進入plasma的單細胞懸滴被瞬間氣化、原子化、離子化，由此單細胞轉化為一團離子云。

離子化后的離子云流內包含大量未離子化的物質及光子等，若不濾除，易黏附于儀器結構，引起檢測信號漂移。其中光子若抵達檢測器將被誤以為是待檢測離子，引起檢測結果準確度下降。因此，在進入tof檢測前，需去除其中的未離子化物質及光子。利用偏轉電場及加速電場的結合即可實現(xiàn)。具體原理見圖7所示。采樣錐作用是把來自等離子體中心通道的載氣流，即離子流大部分吸入錐孔，進入第一級真空室。采樣錐通常由ni、al、cu、pt等金屬制成。

檢測技術全程要求真空狀態(tài)。因為結合的質譜技術要求離子具有較長的平均自由程，以便離子在通過檢測器時與另外的離子、分子、原子碰撞的幾率最低，真空度直接影響了離子傳輸效率、質譜波形及檢測器壽命。

本發(fā)明應用四極管質量分析器的原理篩選原子質量，如圖9所示。四極管的作用是基于在四根電極之間的空間產(chǎn)生一個隨時間變化的特殊的電磁場，只有給定荷質比(m/z)的離子才能獲得穩(wěn)定的路徑而通過極棒，從另一端出射，其它離子將被過分偏轉，與極棒碰撞，并在極棒上被中和而丟失。通過四極管去除常見生物元素后，限定檢測的原子量的檢測范圍(88-210da)，分辨率極高。篩選檢測原子質量較大的原子，濾除原子量小的元素，保留較寬的原子量檢測范圍的同時，由于該類元素在細胞內的含量極低，所以信號的背景極低。金屬元素同位素的選擇不局限于鑭系金屬?？梢允窃淤|量介于88-210da之間的且螯合物安全無毒可合成的任意元素。金屬標簽元素種類豐富，通道數(shù)量激增，信息量亦成倍增長。金屬標簽可以是通過金屬螯合物與抗體結合，如圖10所示，圖中帶有“√”標記的元素標簽可用于dna標記；帶有“o”標記的元素標簽可用于與抗體結合標記抗體；灰色標記為傳統(tǒng)生物學icp-ms可用的檢測元素。

基于飛行時間(timeofflight)原理進行檢測(示意圖如圖11所示)。用感應耦合等離子質譜(icp-ms)觀察單個細胞的原子質量譜，原子的質量與細胞表面和內部的信號分子數(shù)據(jù)呈現(xiàn)一一對應的關系，即檢測到1個原子質量信號就代表有一個細胞表面和內部的信號分子，最后將原子質量譜的數(shù)據(jù)轉換為細胞表面和內部的信號分子數(shù)據(jù)，并通過專業(yè)分析軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行分析，從而實現(xiàn)對細胞表型和信號網(wǎng)絡的精細觀察。

信號分子檢測通道數(shù)量的增加，可實現(xiàn)從單個樣本獲取更大的信息量，為單細胞蛋白質組學的研究提供了新的手段。然而數(shù)據(jù)量及數(shù)據(jù)維度的激增使得原有傳統(tǒng)流式的數(shù)據(jù)分析圖無法很好地呈現(xiàn)數(shù)據(jù)結果。應用多種降維算法、聚類分析算法、分群算法等進行數(shù)據(jù)分析與可視化。目前已有大量相關算法文獻報道。如spade、drevi、accense、xshift、visne以及phenograp。

實施例2

基于流式結合icp-ms單細胞蛋白檢測的樣本前處理方法的步驟包括以下內容：

(一)人外周血樣本的處理與凍存(提取單個核細胞-細胞活性染色-細胞刺激-細胞固定)

1.試劑準備。a.試劑平衡至常溫：ficoll淋巴細胞分離液；ca²⁺/mg²⁺freepbs；2×fixationsolution(3.2％pfainpbs)；人紅細胞裂解液(可選)；cellstainingbuffer(0.5％bsa+0.02％nan3inpbs)。b.需要預熱的試劑：fbsfreedmem/1640(37℃)。c.將以下試劑冰上放置：含有10％dmso的cellstainingbuffer；cellstainingbuffer；cisplatin5mm；

2.全血樣本的采集和運輸。血液標本采集是分析前質量控制的重要環(huán)節(jié)。推薦用肝素或者檸檬酸鹽作為抗凝劑，本實施例中采用肝素作為抗凝劑，按照醫(yī)院里的標準用量來使用；edta易與金屬標簽元素螯合影響抗體標記，故而edta抗凝全血中提取出的pbmc樣本可能需要額外的洗滌步驟。一般情況下，在4小時內將全血樣本需要送達實驗室，常溫運輸；(22攝氏度最佳，不要低于15度或者高于35度)；

3.pbmc細胞分離。用生理鹽水/pbs/hanks液(三者的混合液，一般按照1:1:1的體積比混合后使用)將全血樣本1：1稀釋后，用一次性吸管緩緩將其加入含1倍體積ficoll淋巴細胞分離液的離心管內，注意將離心管傾斜，不要晃動，以免擾動液面影響分層。常溫400g，剎車速度設為5，離心20min；吸出中層白色的pbmc細胞轉移至新的15ml離心管中。再以預熱的無血清dmem/1640，室溫下300g，5min離心清洗細胞一遍后，用1ml預熱的無血清的dmem/1640重懸細胞沉淀。若紅細胞太多，可用紅細胞裂解液處理，但對細胞活性影響較大，故若需對胞內蛋白磷酸化檢測時謹慎使用。

4.細胞活性(順鉑)染色。短時間(5～10min)的處理過程中，順鉑無法進入活細胞內部，因此胞內順鉑信號很弱。而死細胞內大量蛋白與順鉑共價結合，會呈現(xiàn)較強的信號，可以此來區(qū)分細胞活性。細胞密度調至1×10⁷/ml以下，與1ul終濃度為5um的順鉑混勻，37度，孵育5min；加入2～5倍體積(本實施例中采用的是3倍體積)的常溫的cellstainingbuffer，混勻中止標記反應，常溫300g，離心5min，去上清后用常溫的cellstainingbuffer(固定用)重懸或預熱的培養(yǎng)基(刺激用)進行重懸?；钚匀旧襟E中用到的所有cellstainingbuffer中都含有0.5％bsa+0.02％nan3。

5.細胞刺激。將細胞轉移至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min(一般根據(jù)需要來選擇培養(yǎng)的時間，15～30min均可)，使細胞恢復“靜息”狀態(tài)。并根據(jù)適當?shù)拇碳の锛按碳し椒▽毎M行分組刺激，本實施例中采用γ-干擾素作為刺激物，加入細胞溶液中混合均勻，然后用于細胞固定實驗，一般建議在細胞刺激之后2小時內使用。

6.細胞固定。重懸混勻細胞懸液；加入等倍體積的2×固定液(含3.2％pfa的pbs)后立即用移液器吹打或渦旋振蕩混勻，以減少細胞形成二聚體。室溫孵育10min。加入4ml冰冷的cellstainingbuffer以減慢pfa固定反應。4℃，600g，離心5min。去上清。加入1ml凍存液(含10％dmso的cellstaningbuffer)重懸細胞，放置在冰上靜置用于后續(xù)染色或置于冰上靜置數(shù)分鐘后放入-80度冰箱凍存。樣本應注意避免反復凍融。在前處理過程中，通過在顯微鏡下，細胞計數(shù)的辦法，分析每1000個細胞里有多少二聚體、三聚體等。

(二)金屬標簽標記的抗體與細胞結合(細胞表面抗體染色-細胞內磷酸化蛋白染色-單細胞標記)

1.表面抗體染色。對于用pfa固定、凍存的細胞，在冰上或者冷水浴中融化后，vortex重懸細胞，取1ml(10⁶個)細胞溶液加入2mlcellstaningbuffer，600g5min離心去上清，加入50ulblockingmix(每份人pbmc(外周血單個核細胞)樣本：5ulfcreceptorblockingsolution+50ulcsb，取其中的50ul)重懸，常溫放置10min。每管加入50ulcocktail(單個樣品的各抗體用量均為1.1ul，總體積55ul，見下表)混勻，常溫30分鐘。加入2mlcellstainingbuffer，常溫500g離心5min，去上清并重復一次。

表1cocktail的組成成分

2.胞內磷酸化蛋白染色。經(jīng)過前面的步驟之后，加入2mlpbs，500g離心5min，去上清。加入100ulpbs，輕輕votex混勻細胞，冰上放置3分鐘。加入1ml預冷的甲醇，立即用槍頭吹勻，冰上放置15min以上，加入2mlpbs，800g離心5分鐘，棄上清。加入2mlcellstainingbuffer，800g離心5min，棄上清。每個樣本用50ulcellstainingbuffer重懸，加入50ul磷酸化抗體cocktail(配制方法同表面抗體)，混勻，常溫孵育30分鐘。加入2mlcellstainingbuffer，800g離心5min，棄上清。

3.cellintercalation單細胞標記。加入2mlcellstainingbuffer，常溫500g離心5min，去上清。加入100ulpbs重懸細胞，邊振蕩邊逐滴加入1mlcellintercalation溶液(在fixandpermbuffer里加入終濃度為125nm的ir(銥元素)或者500nm的rh(銠元素)，每個樣品用量1ml)。分別用2mlcellstaingbuffe及2ml水，800g離心5min，清洗細胞1次及3次后，加入1ml含有10％eqbeads的水重懸，將樣本置于冰上。至此，樣本前處理已完成，可用于后續(xù)檢測

實施例3

基于金屬同位素標記流式結合icp-ms的單細胞蛋白檢測方法，其步驟為：

(1)樣品標記：按照前述的方法采用金屬元素標記的特異抗體，作為靶標表達水平的報告因子；其中用于標記的金屬元素，其原子質量介于88-210da之間，常用于標記的金屬元素為鑭系金屬元素，本實施例中分別采用nd同位素質量為146標記蛋白cd8a，nd同位素質量為145標記蛋白cd4。

(2)霧化處理：用蠕動泵將標記后的樣品溶液均勻的送入霧化器進行霧化處理，去除其中的水分；霧化溫度為200℃左右，霧化器中的液體流道為氬氣環(huán)境，氬氣流速0.15l/min。

(3)plasma離子化：單細胞霧化懸滴進入plasma后被氣化、原子化、離子化，形成離子云；plasma內溫度范圍為5000k，離子化過程在密閉的高溫腔體中進行，只要是能滿足溫度、密閉等要求的腔體，在腔體中將細胞燒掉，留下標記的同位素均可。

(4)去除未離子化物質及光子：利用偏轉電場及加速電場的結合去除離子云流中存在的未離子化的物質及光子；

(5)icp-ms檢測：用icp-ms觀察單個細胞的原子質量譜(icp-ms檢測全程在真空狀態(tài)下進行)，將原子質量譜的數(shù)據(jù)轉換為細胞表面和內部的信號分子數(shù)據(jù)，并通過專業(yè)分析軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行分析，從而實現(xiàn)對細胞表型和信號網(wǎng)絡的精細觀察，實驗的結果如圖12所示。

實施例4

基于金屬同位素標記流式結合icp-ms的單細胞蛋白檢測方法，其步驟為：

(1)樣品標記：按照前述的方法采用金屬元素標記的特異抗體，作為靶標表達水平的報告因子；其中用于標記的金屬元素，其原子質量介于88-210da之間，常用于標記的金屬元素為鑭系金屬元素，本實施例中采用同位素166er、169tm、173yb標記蛋白cd45。

(2)霧化處理：用蠕動泵將標記后的樣品溶液均勻的送入霧化器進行霧化處理，去除其中的水分；霧化溫度為250℃左右，霧化器中的液體流道為氬氣環(huán)境，氬氣流速0.35l/min。

(3)plasma離子化：單細胞霧化懸滴進入plasma后被氣化、原子化、離子化，形成離子云；plasma內溫度范圍為8000k。

(4)去除未離子化物質及光子：利用偏轉電場及加速電場的結合去除離子云流中存在的未離子化的物質及光子；

(5)icp-ms檢測：用icp-ms觀察單個細胞的原子質量譜(icp-ms檢測全程在真空狀態(tài)下進行)，將原子質量譜的數(shù)據(jù)轉換為細胞表面和內部的信號分子數(shù)據(jù)，并通過專業(yè)分析軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行分析，從而實現(xiàn)對細胞表型和信號網(wǎng)絡的精細觀察。

實施例5

基于金屬同位素標記流式結合icp-ms的單細胞蛋白檢測方法，其步驟為：

(1)樣品標記：按照前述的方法采用金屬元素標記的特異抗體，作為靶標表達水平的報告因子；其中用于標記的金屬元素，其原子質量介于88-210da之間，常用于標記的金屬元素為鑭系金屬元素，本實施例中分別采用nd同位素質量為146標記蛋白cd8a，nd同位素質量為145標記蛋白cd4。

(2)霧化處理：用蠕動泵將標記后的樣品溶液均勻的送入霧化器進行霧化處理，去除其中的水分；霧化溫度為230℃左右，霧化器中的液體流道為氬氣環(huán)境，氬氣流速0.25l/min。

(3)plasma離子化：單細胞霧化懸滴進入plasma后被氣化、原子化、離子化，形成離子云；plasma內溫度范圍為10000k。

(4)去除未離子化物質及光子：利用偏轉電場及加速電場的結合去除離子云流中存在的未離子化的物質及光子；

(5)icp-ms檢測：用icp-ms觀察單個細胞的原子質量譜(icp-ms檢測全程在真空狀態(tài)下進行)，將原子質量譜的數(shù)據(jù)轉換為細胞表面和內部的信號分子數(shù)據(jù)，并通過專業(yè)分析軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行分析，從而實現(xiàn)對細胞表型和信號網(wǎng)絡的精細觀察，實驗的結果基本同實施例1。