本發(fā)明涉及一種檢測(cè)試紙的制備方法，特別是涉及一種人絨毛膜促性腺激素檢測(cè)試紙的制備方法。

背景技術(shù)：

人絨毛膜促性腺激素是由胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，它是由α和β二聚體的糖蛋白組成。人絨毛膜促性腺激素(hcg)αβ，由合體滋養(yǎng)細(xì)胞合成。分子量為36700的糖蛋白激素，α亞基與垂體分泌的fsh（卵泡刺激素）、lh（黃體生成素）和tsh（促甲狀腺激素）等基本相似，故相互間能發(fā)生交叉反應(yīng)，而β亞基的結(jié)構(gòu)各不相似。β-hcg與β-lh結(jié)構(gòu)相近，但最后24個(gè)氨基酸延長(zhǎng)部分在β-lh中不存在?，F(xiàn)有的人絨毛膜促性腺激素檢測(cè)試紙存在缺點(diǎn)，不容易使用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種人絨毛膜促性腺激素檢測(cè)試紙的制備方法，簡(jiǎn)單容易實(shí)現(xiàn)。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是：提供一種人絨毛膜促性腺激素檢測(cè)試紙的制備方法，包括步驟為：

（1）hcg膠體金、免疫膠體金的制備

膠體金的制備：

取450ml高純水放入1000ml的燒杯內(nèi)，再加入14.4ml2%的氯金酸水溶液，置于磁力攪拌器上加熱，加熱至沸騰；另取130ml高純水放入250ml的燒杯內(nèi)，再加入18.72~28ml2%的檸檬酸三鈉水溶液，置于磁力攪拌器上加熱至沸騰；待上述2種溶液都沸騰時(shí)，將檸檬酸三鈉溶液倒入沸騰的氯金酸溶液中，可看到溶液的顏色由澄清透明→黑色→紫色→深紅色，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)樯罴t色時(shí)，繼續(xù)煮沸40分鐘，置室溫冷卻，加入高純水稀釋；通知qa取樣3ml送qc處，1:3稀釋后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)450~600nm范圍內(nèi)掃描，最大吸收峰值應(yīng)在523~528nm處，吸光度為1.05±0.05；2-8℃避光保存，備用，儲(chǔ)存期限1個(gè)月；

確定0.2mk2co3溶液的使用量：

分別按每1ml膠體金加0.2mk2co3溶液5、6、7、8、9μl，攪拌均勻后按每1ml膠體金加入鼠抗α-hcg單抗20μg，靜置10min，觀察顯色，取不變色的第2管膠體金所選用的0.2mk2co3溶液使用量；

hcg免疫膠體金的制備：

（a）每1ml膠體金按照1.2的確定結(jié)果加入0.2mk2co3溶液，攪拌10min；

（b）按每1ml膠體金向調(diào)好ph的金中加入鼠抗α-hcg單抗20μg，攪拌120min；

（c）按每1ml膠體金加入10%bsa溶液100μl，攪拌120min；

（d）將標(biāo)記好的膠體金4℃、6000rpm×30min離心，吸取沉淀，將上清液4℃、10000rpm×30min離心，吸取沉淀，再次將上清液4℃、12000rpm×30min離心，吸取沉淀，向收集得到的沉淀中加膠體金重懸液，終體積為膠體金體積的40%，混勻，即得到hcg免疫膠體金；取樣150μl，用重懸液稀釋20倍，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)450-600nm范圍內(nèi)掃描，最大吸收峰值應(yīng)在530~550nm處，吸光度為0.6±0.1；暫存于2-8℃冰箱，備用，儲(chǔ)存期限7天；

（2）免疫金墊的制備

選用型號(hào)為rb65的玻璃纖維素膜作為免疫金墊材料，裁切成7mm×300mm的金墊長(zhǎng)條，按線濃度3.0、4.0、5.0μl/cm，分別噴制，干燥后送檢，檢測(cè)最低檢測(cè)限、特異性；

按上述檢驗(yàn)合格的線濃度，將重懸好的免疫膠體金噴于玻璃纖維素膜上,60℃烘干5~15分鐘或18~28℃晾干，密封保存，備用，儲(chǔ)存期限14個(gè)月；

（3）反應(yīng)膜的制備

將硝酸纖維素膜浸潤(rùn)在高純水中，浸泡2小時(shí)后取出晾干，再用膜處理液浸泡10分鐘取出晾干，裁切成條帶，粘貼在pvc底板上；用劃膜機(jī)在膜上不同位置分別劃上抗β-hcg單抗（2.0mg/ml，0.2μl/cm）和羊抗鼠igg抗體（隆基或賢至2.5mg/ml，0.2μl/cm），作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，60℃±3℃，相對(duì)濕度≤30%，烘干2h，密封保存，備用，儲(chǔ)存期限14個(gè)月；

（4）樣品墊的制備

條型：選用sb08或c-sab0.80作為樣品墊材料，放置于樣品墊處理液中，確保全部浸濕后取出，相對(duì)濕度≤30%風(fēng)干4h，密封保存，備用，儲(chǔ)存期限14個(gè)月，使用時(shí)用自動(dòng)裁條機(jī)裁切成規(guī)格為27mm×300mm玻纖長(zhǎng)條（具體規(guī)格按照客戶要求而定）；

卡型：選用sb08或c-sab0.80作為樣品墊材料，放置于樣品墊處理液中，確保全部浸濕后取出，相對(duì)濕度≤30%風(fēng)干4h，密封保存，備用，儲(chǔ)存期限14個(gè)月，使用時(shí)用自動(dòng)裁條機(jī)裁切成規(guī)格為17mm×300mm玻纖長(zhǎng)條，具體規(guī)格按照客戶要求而定；

筆型：選用sr62或f-ct-048作為樣品墊材料，放置于樣品墊處理液中，確保全部浸濕后取出，相對(duì)濕度≤30%風(fēng)干4h，密封保存，備用，儲(chǔ)存期限14個(gè)月，使用時(shí)用自動(dòng)裁條機(jī)裁切成規(guī)格為41mm×300mm玻纖長(zhǎng)條，具體規(guī)格按照客戶要求而定；

（5）檢測(cè)試紙的制備

條型：將免疫金墊、樣品墊、吸水紙依次組裝到固定有反應(yīng)膜的粘性pvc底板上(300mm×80mm)，在樣品墊上貼max線，吸水紙上貼條型手柄貼紙，切成試紙條；然后將其與1袋干燥劑裝入鋁箔袋中，封口，4-30℃保存，有效期14個(gè)月；

卡型：將免疫金墊、樣品墊、吸水紙依次組裝到固定有反應(yīng)膜的粘性pvc底板上(300mm×60mm)，切成試紙條，裝入卡殼；然后將其與1袋干燥劑，1個(gè)一次性滴管依次裝入鋁箔袋中，封口，4-30℃保存，有效期14個(gè)月；

筆型：將型號(hào)為kb50/c-sab0.80的玻璃纖維素膜、免疫金墊、樣品墊、吸水紙依次組裝到固定有反應(yīng)膜的粘性pvc底板上(300mm×94mm)，切成試紙條，裝入筆殼；然后將其與1袋干燥劑裝入鋁箔袋中，封口，4-30℃保存，有效期14個(gè)月。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，2%檸檬酸三鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)配方：稱取無(wú)水檸檬酸三鈉2.00g，用高純水定容至100ml，0.22μm過(guò)濾，2-8℃密閉保存，儲(chǔ)存期限1天。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，2%氯金酸溶液標(biāo)準(zhǔn)配方：用高純水將規(guī)格為1g/瓶的氯金酸定容至50ml，2-8℃避光保存，儲(chǔ)存期限6個(gè)月。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，0.2m碳酸鉀溶液標(biāo)準(zhǔn)配方：稱取2.76g碳酸鉀，用高純水定容至100ml，0.22μm過(guò)濾，2-8℃密閉保存，儲(chǔ)存期限1個(gè)月。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，0.2m磷酸氫二鈉溶液的配制：稱取na2hpo42.84g，加高純水定容至100ml，0.22μm過(guò)濾。2-8℃密閉保存，儲(chǔ)存期限3個(gè)月。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，0.2m磷酸二氫鈉溶液的配制：稱取nah2po42.40g，加高純水定容至100ml，0.22μm過(guò)濾。2-8℃密閉保存，儲(chǔ)存期限3個(gè)月。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，0.01m,ph7.4pb緩沖液的配制：量取0.2m,na2hpo4溶液81ml，0.2m,nah2po4溶液19ml，量取高純水1900ml，混勻。2-8℃密閉保存，儲(chǔ)存期限3個(gè)月。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，10%bsa溶液標(biāo)準(zhǔn)配方：稱取10.00gbsa(sprc01)，取高純水100ml，0.22μm過(guò)濾，2-8℃密閉保存，儲(chǔ)存期限1個(gè)月。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，重懸液標(biāo)準(zhǔn)配方：稱取0.24gtris、10.00g蔗糖、5.00g海藻糖、1.00gbsa(sprc02)和0.10g疊氮鈉，用高純水定容至100ml，用1m鹽酸調(diào)節(jié)ph至8.5，0.22μm過(guò)濾，2-8℃密閉保存，儲(chǔ)存期限1個(gè)月。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，樣品墊處理液標(biāo)準(zhǔn)配方：稱取1.21gtris、1.00gbsa(sprc02)、0.50gpvp、0.10g酪蛋白，加入100ml高純水，加入1mltriton，用1m鹽酸調(diào)節(jié)ph=8.7，2-8℃密閉保存，儲(chǔ)存期限1個(gè)月；膜處理液標(biāo)準(zhǔn)配方：稱取0.2mltritonx-100,加入100ml高純水,混勻。2-8℃密閉保存，儲(chǔ)存期限7天。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的人絨毛膜促性腺激素檢測(cè)試紙的制備方法，制作方法簡(jiǎn)單，容易進(jìn)行操作，方便進(jìn)行推廣應(yīng)用，制得的人絨毛膜促性腺激素檢測(cè)試紙檢測(cè)效果好，靈敏度高，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，能夠隨時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

提供一種人絨毛膜促性腺激素檢測(cè)試紙的制備方法，包括步驟為：

（1）hcg膠體金、免疫膠體金的制備

膠體金的制備：

取450ml高純水放入1000ml的燒杯內(nèi)，再加入14.4ml2%的氯金酸水溶液，置于磁力攪拌器上加熱，加熱至沸騰；另取130ml高純水放入250ml的燒杯內(nèi)，再加入18.72~28ml2%的檸檬酸三鈉水溶液，置于磁力攪拌器上加熱至沸騰。待上述2種溶液都沸騰時(shí)，將檸檬酸三鈉溶液倒入沸騰的氯金酸溶液中，可看到溶液的顏色由澄清透明→黑色→紫色→深紅色，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)樯罴t色時(shí)，繼續(xù)煮沸40分鐘，置室溫冷卻，加入高純水稀釋。通知qa取樣3ml送qc處，1:3稀釋后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)450~600nm范圍內(nèi)掃描，最大吸收峰值應(yīng)在523~528nm處，吸光度為1.05±0.05。2-8℃避光保存，備用，儲(chǔ)存期限1個(gè)月。

確定0.2mk2co3溶液的使用量：

分別按每1ml膠體金加0.2mk2co3溶液5、6、7、8、9μl，攪拌均勻后按每1ml膠體金加入鼠抗α-hcg單抗20μg，靜置10min，觀察顯色，取不變色的第2管膠體金所選用的0.2mk2co3溶液使用量。

hcg免疫膠體金的制備：

（a）每1ml膠體金按照1.2的確定結(jié)果加入0.2mk2co3溶液，攪拌10min。

（b）按每1ml膠體金向調(diào)好ph的金中加入鼠抗α-hcg單抗20μg，攪拌120min。

（c）按每1ml膠體金加入10%bsa溶液100μl，攪拌120min。

（d）將標(biāo)記好的膠體金4℃、6000rpm×30min離心，吸取沉淀，將上清液4℃、10000rpm×30min離心，吸取沉淀，再次將上清液4℃、12000rpm×30min離心，吸取沉淀，向收集得到的沉淀中加膠體金重懸液，終體積為膠體金體積的40%，混勻，即得到hcg免疫膠體金。取樣150μl，用重懸液稀釋20倍，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)450-600nm范圍內(nèi)掃描，最大吸收峰值應(yīng)在530~550nm處，吸光度為0.6±0.1。暫存于2-8℃冰箱，備用，儲(chǔ)存期限7天。

（2）免疫金墊的制備

選用型號(hào)為rb65的玻璃纖維素膜作為免疫金墊材料，裁切成7mm×300mm的金墊長(zhǎng)條，按線濃度3.0、4.0、5.0μl/cm，分別噴制，干燥后送檢，檢測(cè)最低檢測(cè)限、特異性。

按上述檢驗(yàn)合格的線濃度，將重懸好的免疫膠體金噴于玻璃纖維素膜上,60℃烘干5~15分鐘或18~28℃晾干，密封保存，備用，儲(chǔ)存期限14個(gè)月。

（3）反應(yīng)膜的制備

將硝酸纖維素膜浸潤(rùn)在高純水中，浸泡2小時(shí)后取出晾干，再用膜處理液浸泡10分鐘取出晾干，裁切成條帶，粘貼在pvc底板上。用劃膜機(jī)在膜上不同位置分別劃上抗β-hcg單抗（2.0mg/ml，0.2μl/cm）和羊抗鼠igg抗體（隆基或賢至2.5mg/ml，0.2μl/cm），作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，60℃±3℃，相對(duì)濕度≤30%，烘干2h，密封保存，備用，儲(chǔ)存期限14個(gè)月。

（4）樣品墊的制備

條型：選用sb08或c-sab0.80作為樣品墊材料，放置于樣品墊處理液中，確保全部浸濕后取出，相對(duì)濕度≤30%風(fēng)干4h，密封保存，備用，儲(chǔ)存期限14個(gè)月，使用時(shí)用自動(dòng)裁條機(jī)裁切成規(guī)格為27mm×300mm玻纖長(zhǎng)條（具體規(guī)格按照客戶要求而定）。

卡型：選用sb08或c-sab0.80作為樣品墊材料，放置于樣品墊處理液中，確保全部浸濕后取出，相對(duì)濕度≤30%風(fēng)干4h，密封保存，備用，儲(chǔ)存期限14個(gè)月，使用時(shí)用自動(dòng)裁條機(jī)裁切成規(guī)格為17mm×300mm玻纖長(zhǎng)條（具體規(guī)格按照客戶要求而定）。

筆型：選用sr62或f-ct-048作為樣品墊材料，放置于樣品墊處理液中，確保全部浸濕后取出，相對(duì)濕度≤30%風(fēng)干4h，密封保存，備用，儲(chǔ)存期限14個(gè)月，使用時(shí)用自動(dòng)裁條機(jī)裁切成規(guī)格為41mm×300mm玻纖長(zhǎng)條（具體規(guī)格按照客戶要求而定）。

（5）檢測(cè)試紙的制備

條型：將免疫金墊、樣品墊、吸水紙依次組裝到固定有反應(yīng)膜的粘性pvc底板上(300mm×80mm)，在樣品墊上貼max線，吸水紙上貼條型手柄貼紙，切成試紙條。然后將其與1袋干燥劑裝入鋁箔袋中，封口，4-30℃保存，有效期14個(gè)月。

卡型：將免疫金墊、樣品墊、吸水紙依次組裝到固定有反應(yīng)膜的粘性pvc底板上(300mm×60mm)，切成試紙條，裝入卡殼。然后將其與1袋干燥劑，1個(gè)一次性滴管依次裝入鋁箔袋中，封口，4-30℃保存，有效期14個(gè)月。

筆型：將型號(hào)為kb50/c-sab0.80的玻璃纖維素膜、免疫金墊、樣品墊、吸水紙依次組裝到固定有反應(yīng)膜的粘性pvc底板上(300mm×94mm)，切成試紙條，裝入筆殼。然后將其與1袋干燥劑裝入鋁箔袋中，封口，4-30℃保存，有效期14個(gè)月。

（6）有關(guān)液體試劑標(biāo)準(zhǔn)配方及制備

2%檸檬酸三鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)配方：稱取無(wú)水檸檬酸三鈉2.00g，用高純水定容至100ml，0.22μm過(guò)濾，2-8℃密閉保存，儲(chǔ)存期限1天。

2%氯金酸溶液標(biāo)準(zhǔn)配方：用高純水將規(guī)格為1g/瓶的氯金酸定容至50ml，2-8℃避光保存，儲(chǔ)存期限6個(gè)月。

0.2m碳酸鉀溶液標(biāo)準(zhǔn)配方：稱取2.76g碳酸鉀，用高純水定容至100ml，0.22μm過(guò)濾，2-8℃密閉保存，儲(chǔ)存期限1個(gè)月。

0.2m磷酸氫二鈉溶液的配制：稱取na2hpo42.84g，加高純水定容至100ml，0.22μm過(guò)濾。2-8℃密閉保存，儲(chǔ)存期限3個(gè)月。

0.2m磷酸二氫鈉溶液的配制：稱取nah2po42.40g，加高純水定容至100ml，0.22μm過(guò)濾。2-8℃密閉保存，儲(chǔ)存期限3個(gè)月。

0.01m,ph7.4pb緩沖液的配制：量取0.2m,na2hpo4溶液81ml，0.2m,nah2po4溶液19ml，量取高純水1900ml，混勻。2-8℃密閉保存，儲(chǔ)存期限3個(gè)月。

10%bsa溶液標(biāo)準(zhǔn)配方：稱取10.00gbsa(sprc01)，取高純水100ml，0.22μm過(guò)濾，2-8℃密閉保存，儲(chǔ)存期限1個(gè)月。

重懸液標(biāo)準(zhǔn)配方：稱取0.24gtris、10.00g蔗糖、5.00g海藻糖、1.00gbsa(sprc02)和0.10g疊氮鈉，用高純水定容至100ml，用1m鹽酸調(diào)節(jié)ph至8.5，0.22μm過(guò)濾，2-8℃密閉保存，儲(chǔ)存期限1個(gè)月。

樣品墊處理液標(biāo)準(zhǔn)配方：稱取1.21gtris、1.00gbsa(sprc02)、0.50gpvp、0.10g酪蛋白，加入100ml高純水，加入1mltriton，用1m鹽酸調(diào)節(jié)ph=8.7，2-8℃密閉保存，儲(chǔ)存期限1個(gè)月。

膜處理液標(biāo)準(zhǔn)配方：稱取0.2mltritonx-100,加入100ml高純水,混勻。2-8℃密閉保存，儲(chǔ)存期限7天。

其中c線包被液0.01m,ph7.4pb+15%無(wú)水乙醇，t線包被液0.01m,ph7.4pb+15%無(wú)水乙醇。

所述人絨毛膜促性腺激素檢測(cè)試紙的反應(yīng)原理為：

本試紙將鼠抗β-hcg單克隆抗體以適當(dāng)濃度包被在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線處，對(duì)照線處則包被羊抗鼠igg多克隆抗體；同時(shí)在玻璃纖維素膜上預(yù)包被膠體金標(biāo)記鼠抗α-hcg單克隆抗體。應(yīng)用免疫層析技術(shù)及雙抗體夾心的原理，檢測(cè)人尿液中的人絨毛膜促性腺激素（hcg）。

檢測(cè)時(shí)，樣本尿液將包被在玻璃纖維素膜上標(biāo)記有鼠抗α-hcg單克隆抗體的膠體金復(fù)合物復(fù)溶，復(fù)溶混合物由于毛細(xì)效應(yīng)沿nc膜向前移動(dòng)，若樣本尿液中含有一定量的hcg，復(fù)溶混合物中膠體金標(biāo)記的鼠抗α-hcg單克隆抗體與nc膜上預(yù)包被的鼠抗β-hcg單克隆抗體結(jié)合形成復(fù)合物，使得膠體金標(biāo)記物被截留在檢測(cè)線處而形成一條紅色的條帶；無(wú)論樣本是否含有hcg，游離的膠體金標(biāo)記鼠抗α-hcg單克隆抗體都會(huì)在對(duì)照線處被羊抗鼠igg多克隆抗體捕獲而呈現(xiàn)出紅色條帶。

以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其它相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。