本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種檢測(cè)禽白細(xì)胞介素4含量的方法及其專用試劑盒。
背景技術(shù)：
：白細(xì)胞介素4(interleukin4，il-4)是20世紀(jì)80年代初發(fā)現(xiàn)的，具有多種免疫學(xué)調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，對(duì)b細(xì)胞、t細(xì)胞等免疫細(xì)胞以及造血細(xì)胞等非免疫細(xì)胞均有免疫調(diào)節(jié)作用，可通過與多種類型細(xì)胞相互作用來調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答。2004年，單拷貝的功能性雞白細(xì)胞介素4(chickeninterleukin4,chil-4)基因被發(fā)現(xiàn)，其mrna基因序列全長(zhǎng)為411bp，前體是137肽，其中包括25個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，分泌的成熟的chil-4有112個(gè)氨基酸殘基，含3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵和2個(gè)可能的n端糖基化位點(diǎn)。目前，已有在蛋白水平上檢測(cè)人和小鼠il-4的商品化試劑盒，但是由于chil-4與人和小鼠il-4的同源性僅分別為22.48％和21.23％，所以目前國(guó)內(nèi)，無論是在學(xué)術(shù)研究還是臨床疾病分析中主要還是以熒光定量pcr檢測(cè)chil-4的相對(duì)含量。但由于mrna水平與蛋白水平并不呈絕對(duì)的線性關(guān)系，所以應(yīng)用熒光定量pcr并不能反應(yīng)出chil-4的實(shí)際水平，故其并不能作為一個(gè)檢測(cè)chil-4蛋白量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)而應(yīng)用，同時(shí)熒光定量pcr技術(shù)操作繁瑣，對(duì)專業(yè)技能要求較高且價(jià)格昂貴，不宜用于生產(chǎn)實(shí)際。因此，建立針對(duì)chil-4在蛋白水平上的檢測(cè)方法，將有助于評(píng)價(jià)chil-4在機(jī)體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化水平，對(duì)于了解禽類傳染性疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸情況及機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)的動(dòng)態(tài)規(guī)律具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供抗chil-4的單克隆抗體。本發(fā)明提供的抗chil-4的單克隆抗體是由保藏號(hào)為cgmccno.13838的雜交瘤細(xì)胞株1g11-7f-9e-6b和保藏號(hào)為cgmccno.13839的雜交瘤細(xì)胞株2e5-g7-10c-7e分泌的。將保藏號(hào)為cgmccno.13838的雜交瘤細(xì)胞株1g11-7f-9e-6b分泌的抗chil-4的單克隆抗體命名為1g11-7f-9e-6b抗體，將保藏號(hào)為cgmccno.13839的雜交瘤細(xì)胞株2e5-g7-10c-7e分泌的抗chil-4的單克隆抗體命名為2e5-g7-10c-7e抗體。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供分泌抗chil-4的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明提供的分泌抗chil-4的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株為1g11-7f-9e-6b和2e5-g7-10c-7e。雜交瘤細(xì)胞株1g11-7f-9e-6b的分類命名為雜交瘤細(xì)胞系(小鼠來源)，該雜交瘤細(xì)胞株已于2017年4月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為cgmccno.13838。雜交瘤細(xì)胞株2e5-g7-10c-7e的分類命名為雜交瘤細(xì)胞系(小鼠來源)，該雜交瘤細(xì)胞株已于2017年4月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為cgmccno.13839。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中chil-4含量的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中chil-4含量的酶聯(lián)免疫試劑盒包括上述1g11-7f-9e-6b抗體和/或2e5-g7-10c-7e抗體。上述酶聯(lián)免疫試劑盒還包括chil-4標(biāo)準(zhǔn)品；所述chil-4標(biāo)準(zhǔn)品是通過將核苷酸序列如序列表中序列1所示的chil-4基因在原核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)獲得的。所述酶聯(lián)免疫試劑盒中還包括如下中的至少一種：酶標(biāo)板、包被緩沖液、洗滌緩沖液、抗體稀釋液、封閉液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(hrp標(biāo)記的鏈霉親和素)、顯色液和終止液。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述抗chil-4的單克隆抗體或上述雜交瘤細(xì)胞株或上述酶聯(lián)免疫試劑盒的新用途。本發(fā)明提供了上述抗chil-4的單克隆抗體或上述雜交瘤細(xì)胞株或上述酶聯(lián)免疫試劑盒在檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中chil-4含量中的應(yīng)用。上述抗chil-4的單克隆抗體或上述雜交瘤細(xì)胞株在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中chil-4含量的試劑或膠體金試紙條或試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中chil-4含量的方法。本發(fā)明提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中chil-4含量的方法是以1g11-7f-9e-6b抗體為包被抗體、生物素化的2e5-g7-10c-7e抗體為檢測(cè)抗體的雙抗體夾心elisa檢測(cè)方法。上述方法檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中chil-4含量的方法具體包括如下步驟：(1)將1g11-7f-9e-6b抗體包被到酶標(biāo)板上，洗滌；(2)封閉(1)得到的酶標(biāo)板，洗滌；(3)向(2)得到的酶標(biāo)板中加入chil-4標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，孵育，洗滌；(4)向(3)得到的酶標(biāo)板中加入生物素化的2e5-g7-10c-7e抗體，孵育，洗滌；(5)向(4)得到的酶標(biāo)板中加入hrp標(biāo)記的鏈霉親和素，孵育，洗滌；(6)向(5)得到的酶標(biāo)板中加入底物顯色，顯色后加入終止液終止反應(yīng)；(7)用酶標(biāo)儀檢測(cè)加入chil-4標(biāo)準(zhǔn)品的各孔的吸光度值，以chil-4標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、以酶標(biāo)儀的讀數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(8)用酶標(biāo)儀檢測(cè)加入待測(cè)樣品的孔的吸光度值，將吸光度值代入所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得待測(cè)樣品中chil-4的濃度。上述方法中，所述步驟(1)中，用磷酸鹽緩沖液將1g11-7f-9e-6b抗體稀釋后包被到酶標(biāo)板上；所述步驟(2)中，用脫脂奶溶液封閉(1)得到的酶標(biāo)板；所述步驟(3)中，用bsa溶液將chil-4標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后加入酶標(biāo)板中；所述步驟(4)中，用bsa溶液將生物素化的2e5-g7-10c-7e抗體稀釋至1μg/ml后加入酶標(biāo)板中。所述生物素化的2e5-g7-10c-7e抗體的制備方法參照抗體生物素標(biāo)記試劑盒(購(gòu)自thermoscientific，prod#21440)中說明書中的方法。上述方法中，所述步驟(1)中，所述抗體的濃度稀釋為5μg/ml；所述包被的條件為4℃包被12h；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.05m，ph為6.0；所述步驟(2)中，所述脫脂奶溶液(溶劑為洗滌緩沖液)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％；所述封閉的條件為4℃封閉12h；所述bsa溶液(溶劑為洗滌緩沖液)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％；所述步驟(3)中，所述孵育時(shí)間為1h；所述步驟(4)中，所述孵育時(shí)間為2h；所述步驟(5)中，所述孵育時(shí)間為15min；所述用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值時(shí)的波長(zhǎng)為450nm；所述洗滌的次數(shù)為6次；所述底物為tmb；所述終止液為2mh2so4。本發(fā)明在酶聯(lián)免疫的基礎(chǔ)上結(jié)合生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)建立了雙抗體夾心elisa檢測(cè)方法，該方法利用生物素化抗體和hrp標(biāo)記的鏈霉親和素之間的高親和力及高特異性結(jié)合的特點(diǎn)，使大量的酶分子聚集在抗原抗體復(fù)合物周圍，產(chǎn)生多級(jí)放大作用，使每個(gè)抗體攜帶的酶分子顯著增加，從而極大地提高靈敏度。與熒光定量pc相比，本發(fā)明所建立的雙抗體夾心elisa檢測(cè)方法有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)樣品處理簡(jiǎn)單，不需要取動(dòng)物的組織進(jìn)行rna的提取及反轉(zhuǎn)錄，僅采取少量動(dòng)物的血液，分離血清進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，即可進(jìn)行檢測(cè)；(2)簡(jiǎn)單、快速，操作方法簡(jiǎn)單，且整個(gè)檢測(cè)過程僅需3-4個(gè)h；(3)準(zhǔn)確性高，直接在蛋白水平上針對(duì)chil-4進(jìn)行檢測(cè)，不易受操作或是其他外部條件影響；(4)成本低，對(duì)儀器要求不高。本發(fā)明利用chil-4單克隆抗體建立了針對(duì)chil-4在蛋白水平上的雙抗體夾心elisa檢測(cè)方法，可以用于檢測(cè)血清及細(xì)胞上清中chil-4含量。通過實(shí)驗(yàn)證明：本發(fā)明的chil-4單克隆抗體具有良好的特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確地反映出血清或細(xì)胞上清中chil-4的含量，且本發(fā)明的檢測(cè)方法快捷、高效又準(zhǔn)確，解決了現(xiàn)有技術(shù)中采用熒光定量pcr檢測(cè)方法帶來的操作繁瑣，耗時(shí)耗力，易受操作及其他外部條件影響等問題，不僅有助于評(píng)價(jià)chil-4在機(jī)體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化水平，為疾病的預(yù)防和治理提供很好的參考，而且有助于了解禽類傳染性疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸情況及機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)的動(dòng)態(tài)。附圖說明圖1為sds-page分析重組蛋白的表達(dá)。(a)重組蛋白his-chil-4的誘導(dǎo)表達(dá)。m：蛋白marker；1：pet-28a空載誘導(dǎo)后；2,3：pet-28a-chil-4未誘導(dǎo)；4,5：pet-28a-chil-4誘導(dǎo)后。(b)重組蛋白gst-chil-4的誘導(dǎo)表達(dá)。m：蛋白marker；1：pgex-6p-1空載誘導(dǎo)后；2,3,4,5：pgex-6p-1-chil-4未誘導(dǎo)；6,7,8,9：pgex-6p-1-chil-4誘導(dǎo)后。圖2為westernblot驗(yàn)證重組蛋白的表達(dá)。(a)重組蛋白his-chil-4的westernblot鑒定。1：pet-28a-chil-4未誘導(dǎo)；2：重組蛋白his-chil-4誘導(dǎo)后；3：pet-28a空載誘導(dǎo)后。(b)重組蛋白gst-chil-4的westernblot鑒定。1：pgex-6p-1-chil-4未誘導(dǎo)；2：重組蛋白gst-chil-4誘導(dǎo)后:3：pgex-6p-1空載誘導(dǎo)后。圖3為單克隆抗體抗原識(shí)別區(qū)的分析。(a)chil-4基因全長(zhǎng)和截短示意圖；(b)單克隆抗體抗原識(shí)別區(qū)的westernblot鑒定；(c)單克隆抗體抗原識(shí)別區(qū)示意圖。圖4為單克隆抗體特異性鑒定。圖5為標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中所使用的溶液的配方如下：1、包被緩沖液為0.05m磷酸鹽緩沖液(ph6.0)，是將a液438.5ml和b液61.5ml混勻得到的溶液，其中a液和b液的配方如下：2、洗滌緩沖液(pbst，ph7.4)的配方如下：3、封閉液(5％的脫脂奶)的配方如下：試劑用量脫脂奶5g洗滌緩沖液100ml4、樣品及抗體稀釋液(1％的bsa)的配方如下：試劑用量牛血清白蛋白(bsa)1g洗滌緩沖液100ml5、終止液(2mh2so4)的配置方法試劑用量濃硫酸22ml水178ml下述實(shí)施例中的原核表達(dá)的chil-2在文獻(xiàn)“付夢(mèng)姣等，chil-2單克隆抗體的制備與鑒定，中國(guó)獸醫(yī)雜志”中公開過，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實(shí)施例中的原核表達(dá)的chil-10在文獻(xiàn)“高俊峰等，雞白介素10(chil-10)單克隆抗體的制備及鑒定，中國(guó)獸醫(yī)雜志”中公開過，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實(shí)施例中的緩沖液的制備方法如下：1、0.05m甘氨酸-鹽酸緩沖液(ph2.8)a液：稱取1.5g甘氨酸溶于100ml蒸餾水中，制成0.2m甘氨酸作為母液備用。b液：量取1.65ml濃鹽酸，用蒸餾水定容至100ml，制成0.2m鹽酸作為母液備用。取a液25ml，b液8.4ml，加蒸餾水定容至100ml。2、0.05m檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ph3.0-5.0)a液：稱取檸檬酸10.5g溶于500ml蒸餾水中，制成0.05m檸檬酸作為母液備用。b液：稱取檸檬酸鈉14.7g溶于500ml蒸餾水中，制成0.05m檸檬酸鈉作為母液備用。將93mla液和7mlb液混勻，得到0.05m檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ph3.0)。將65.5mla液和34.5mlb液混勻，得到0.05m檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ph4.0)。將41mla液和59mlb液混勻，得到0.05m檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ph5.0)。3、0.05m磷酸鹽緩沖液(ph6.0-8.0)a液：稱取二水磷酸二氫鈉3.9g溶于500ml蒸餾水中，制成0.05m磷酸二氫鈉作為母液備用。b液:稱取十二水磷酸氫二鈉8.975g溶于500ml蒸餾水中，制成0.05m磷酸氫二鈉作為母液備用。將87.7mla液和12.3mlb液混勻，得到0.05m磷酸鹽緩沖液(ph6.0)。將39mla液和61mlb液混勻，得到0.05m磷酸鹽緩沖液(ph7.0)。將5.3mla液和94.7mlb液混勻，得到0.05m磷酸鹽緩沖液(ph8.0)。4、0.05m碳酸鹽緩沖液(ph9.6)稱取1.59g碳酸鈉，2.93g碳酸氫鈉，溶于1000ml蒸餾水中。5、0.05m碳酸氫鈉-氫氧化鈉緩沖液(ph10.0)a液：稱取0.21g碳酸氫鈉溶于50ml蒸餾水中制成0.05m碳酸氫鈉作為母液備用。b液:稱取0.4g氫氧化鈉溶于100ml蒸餾水中制成0.1m氫氧化鈉作為母液備用。取a液50ml，b液10.7ml，加蒸餾水定容至100ml后混勻。6、pbs(ph7.4)稱取8.0gnacl，0.2gkcl，1.44gna2hpo4，0.24gkh2po4溶解于800ml蒸餾水，濃鹽酸調(diào)節(jié)ph值至7.4，定容至1l，121℃高壓20min，4℃保存。下述實(shí)施例中的封閉液的配方如下：1、5％的脫脂奶：稱取5g脫脂奶，溶于80mlpbst中，最后定容至100ml。2、2％的bsa：稱取2gbsa，溶于80mlpbst中，最后定容至100ml。3、1％的明膠：稱取1g明膠，溶于80mlpbst中，攪拌溶解，最后定容至100ml。4、5％的脫脂奶+1％的酪蛋白：稱取0.5g酪蛋白，用pbst定容至50ml，攪拌溶解過夜，然后與等量的5％的脫脂奶混合。實(shí)施例1、用于檢測(cè)禽白細(xì)胞介素4(chil-4)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及雙抗體夾心elisa檢測(cè)方法的建立及條件的優(yōu)化一、用于檢測(cè)禽白細(xì)胞介素4(chil-4)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制備本發(fā)明用于檢測(cè)禽白細(xì)胞介素4(chil-4)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒包括聚苯乙烯酶標(biāo)反應(yīng)板、chil-4標(biāo)準(zhǔn)品(重組蛋白gst-chil-4，夾心蛋白)、抗chil-4單克隆抗體1g11-7f-9e-6b(包被抗體)、生物素化抗chil-4單克隆抗體2e5-g7-10c-7e(檢測(cè)抗體)、0.05m磷酸鹽緩沖液(ph6.0，包被液)、pbst(ph7.4，洗滌緩沖液)、5％脫脂奶(封閉液)、1％bsa(樣品及抗體稀釋液)、hrp標(biāo)記的鏈霉親和素、底物tmb、2mh2so4溶液(終止液)。1、免疫原的制備(1)chil-4原核表達(dá)載體的構(gòu)建將序列1所示的chil-4基因序列插入到載體pet-28a(購(gòu)自emdbiosciences(novagen)，產(chǎn)品目錄號(hào)為69864-3)的ecorⅰ和hindiii酶切位點(diǎn)間，且保持載體pet-28a的其他序列不變，得到pet-28a-chil-4質(zhì)粒。將序列1所示的chil-4基因序列插入到載體pgex-6p-1(購(gòu)自優(yōu)寶生物公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為vt1258)的ecorⅰ和hindiii酶切位點(diǎn)間，且保持載體pgex-6p-1的其他序列不變，得到pgex-6p-1-chil-4質(zhì)粒。(2)重組菌的構(gòu)建及重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化1)分別將質(zhì)粒pet-28a-chil-4和pgex-6p-1-chil-4轉(zhuǎn)化到rosseta表達(dá)菌(購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物，貨號(hào)為cw0811a)中，分別得到重組菌。2)分別向重組菌中加入iptg至終濃度為1mmol/l，37℃誘導(dǎo)6h，離心收集菌體。菌體經(jīng)超聲裂解(其功率比為35％，槽溫度為46℃，超聲3s，停3s，超聲總時(shí)間為30min)后12000r/min離心20min，分離上清和沉淀，通過sds-page分析蛋白的表達(dá)情況并用westernblot進(jìn)行驗(yàn)證后，提取包涵體，并進(jìn)行稀釋復(fù)性，分別得到純化后的重組蛋白his-chil-4(約15kda)和gst-chil-4(約38kda)。sds-page和westernblot結(jié)果分別如圖1和圖2所示。重組蛋白his-chil-4用于免疫小鼠，gst-chil-4用于雜交瘤細(xì)胞篩選。2、小鼠免疫及雜交瘤細(xì)胞株的獲得以重組蛋白his-chil-4為抗原，免疫8周齡雌性balb/c小鼠。首次免疫，抗原與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化，頸背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射，50μg/只。3周后進(jìn)行二免，抗原與等體積弗氏不完全佐劑混合乳化，頸背部皮下多點(diǎn)注射，50μg/只。3周后進(jìn)行三免，免疫劑量與途徑同二免。三免1周后，小鼠斷尾采血分離血清，以重組蛋白gst-chil-4所包被的酶標(biāo)反應(yīng)板用間接elisa的方法測(cè)定血清抗體效價(jià)，當(dāng)效價(jià)大于1：10000時(shí)，小鼠達(dá)到融合以制備單克隆抗體的要求。在細(xì)胞融合前3d，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，小鼠腹腔注射抗原，50μg/只。3、細(xì)胞融合小鼠三次免疫后取小鼠血清采用間接elisa進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè)，效價(jià)合格者進(jìn)行加強(qiáng)免疫用于細(xì)胞融合。細(xì)胞融合的具體步驟如下：將準(zhǔn)備好的sp2/0雜交瘤細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞按照1:2-1:5的比例混合，加到一個(gè)無菌的50ml離心管中，4℃，1000rpm離心10min，棄上清，將盛有細(xì)胞的離心管插入37℃的溫水中，一邊輕輕晃動(dòng)離心管，一邊吸取1ml溶解好的peg4000融合劑，一滴一滴加入到細(xì)胞泥中，在60s內(nèi)完成此操作，然后靜止60s，之后按照如下方法加入15ml10％dmem培養(yǎng)液：第1-2min緩緩加入1ml10％dmem培養(yǎng)液，第三分鐘加入1ml，第四分鐘加入2ml，然后在3min內(nèi)加入余下的10％dmem培養(yǎng)液，1000rpm離心10min，棄上清，加入40ml10％dmem培養(yǎng)液懸浮沉淀細(xì)胞，將懸浮細(xì)胞加入96孔板中，100μl/孔，置于37℃co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。上述間接elisa進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè)的具體步驟如下：用ph9.6的碳酸鹽緩沖液(包被液)將gst-chil-4蛋白稀釋至1μg/ml，100μl/孔包被酶標(biāo)板，4℃過夜；甩干孔內(nèi)殘留液體，每孔加入300μlpbst，洗滌3次；每孔加入300μl5％脫脂奶，4℃封閉過夜；洗滌同上；斷尾采血，將陰陽性血清分別做2倍倍比稀釋，將稀釋好的血清加入酶標(biāo)板，100μl/孔，每個(gè)稀釋度做三個(gè)以上的平行孔，37℃孵育1h；洗滌同上；加入按1：5000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠igg，100μl/孔，37℃孵育1h；洗滌同上；加tmb顯色劑，100μl/孔，室溫顯色10-15min后，每孔加50μl終止液，最后酶標(biāo)儀檢測(cè)od450值。結(jié)果的判定以檢測(cè)od450>標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品的均值+2x標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品的標(biāo)準(zhǔn)差為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行陽性判定，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上該判定結(jié)果可以達(dá)到95％的置信區(qū)間。4、陽性雜交瘤細(xì)胞篩選待融合的細(xì)胞克隆生長(zhǎng)到覆蓋孔底部的1/4-1/3時(shí)，利用間接elisa方法對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)，方法同血清抗體效價(jià)的測(cè)定，加入陰陽性血清和sp2/0細(xì)胞上清作為對(duì)照，判定標(biāo)準(zhǔn)同血清抗體效價(jià)的測(cè)定，陰性孔三天后再檢一次，如仍為陰性則棄之。經(jīng)兩次間接elisa檢測(cè)為陽性的細(xì)胞孔，選擇陽性值較高的進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和亞克隆。5、陽性雜交瘤細(xì)胞的亞克隆將陽性細(xì)胞輕輕吹起，取少量細(xì)胞進(jìn)行稀釋后，加入臺(tái)盼藍(lán)染色液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，經(jīng)計(jì)算后，吸取80-100個(gè)雜交瘤細(xì)胞加入到20ml15％dmem培養(yǎng)液中，混勻，將稀釋好的細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使每孔內(nèi)大約含有1個(gè)雜交瘤細(xì)胞，每個(gè)陽性克隆鋪一塊板，另外每塊板內(nèi)有1孔加入約10個(gè)細(xì)胞，1個(gè)孔內(nèi)加入約100個(gè)細(xì)胞，以避免陽性細(xì)胞的丟失。將細(xì)胞放于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)到覆蓋孔底部的1/4-1/3時(shí)，再按上述步驟進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選及亞克隆，亞克隆一共做3-4次。當(dāng)獲得穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株后，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。最終獲得2株可穩(wěn)定分泌chil-4抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1g11-7f-9e-6b和2e5-g7-10c-7e。雜交瘤細(xì)胞株1g11-7f-9e-6b的分類命名為雜交瘤細(xì)胞系(小鼠來源)，該雜交瘤細(xì)胞株已于2017年4月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為cgmccno.13838。雜交瘤細(xì)胞株2e5-g7-10c-7e的分類命名為雜交瘤細(xì)胞系(小鼠來源)，該雜交瘤細(xì)胞株已于2017年4月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為cgmccno.13839。6、單克隆抗體的制備及鑒定挑選經(jīng)產(chǎn)balb/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟1ml/只，7d后分別將步驟5篩選得到的2株雜交瘤細(xì)胞注射入小鼠腹腔進(jìn)行腹水制備，雜交瘤細(xì)胞注射量為2.0×106個(gè)/只。收集的腹水經(jīng)離心后收集上清，利用正辛酸飽和硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化。其中，雜交瘤細(xì)胞株1g11-7f-9e-6b分泌的chil-4單克隆抗體命名為1g11-7f-9e-6b抗體；雜交瘤細(xì)胞株2e5-g7-10c-7e分泌的chil-4單克隆抗體命名為2e5-g7-10c-7e抗體，并分別對(duì)其特性進(jìn)行鑒定，包括亞型鑒定、腹水效價(jià)測(cè)定、親和力測(cè)定、抗體特異性鑒定及抗原表位分析。(1)單克隆抗體的抗原表位分析以chil-4n端第80位和第40位氨基酸為截點(diǎn)，構(gòu)建chil-4的截短蛋白的表達(dá)載體pet-28a-chil-4-△1(his-chil-41-80aa)和pet-28a-chil-4-△2(his-chil-440-112aa)，然后在e.colibl21菌中分別誘導(dǎo)各個(gè)截短蛋白的表達(dá)，并以此為抗原，以chil-4單克隆抗體為一抗，以hrp標(biāo)記的山羊抗小鼠igg為二抗，通過westernblot分析2株單克隆抗體的抗原識(shí)別區(qū)。上述chil-4的截短蛋白的表達(dá)載體pet-28a-chil-4-△1(his-chil-41-80aa)為將序列2所示的dna片段插入到載體pet-28a的bamh和xhoⅰ酶切位點(diǎn)間，且保持載體pet-28a的其他序列不變后得到的載體。上述chil-4的截短蛋白的表達(dá)載體pet-28a-chil-4-△2(his-chil-440-112aa)為將序列3所示的dna片段插入到載體pet-28a的bamhⅰ和xhoⅰ酶切位點(diǎn)間，且保持載體pet-28a的其他序列不變后得到的載體。結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明：2株單克隆抗體識(shí)別chil-4不同的抗原表位：1g11-7f-9e-6b識(shí)別抗原氨基酸序列如序列5所示；2e5-g7-10c-7e識(shí)別抗原氨基酸序列如序列6所示。(2)單克隆抗體得特異性鑒定以原核表達(dá)的重組蛋白his-chil-4、his-chil-2、his-chil-10和his-chifn-γ為抗原，分別以his-tag單克隆抗體和2株抗chil-4單克隆抗體為一抗，以hrp標(biāo)記山羊抗小鼠igg為二抗進(jìn)行westernblot，鑒定單克隆抗體的特異性。上述原核表達(dá)的his-chifn-γ表達(dá)載體為將序列4所示的雞ifn-γ基因序列插入載體pet-28a(購(gòu)自emdbiosciences(novagen)，產(chǎn)品目錄號(hào)為69864-3)的ecorⅰ和hindiii酶切位點(diǎn)間，且保持載體pet-28a的其他序列不變后得到的載體。結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明：2株抗chil-4單克隆抗體均只識(shí)別原核表達(dá)的his-chil-4蛋白，而不識(shí)別原核表達(dá)的his-chil-2、his-chil-10和his-chifn-γ，表明2株單抗特異性良好。(3)單克隆抗體亞型的鑒定按照sigma公司的mousemonoclonalantibodyisotypingreagents鑒定試劑盒說明書進(jìn)行單克隆抗體亞型的鑒定。結(jié)果表明2株抗chil-4單克隆抗體的亞型均為igg1。(4)單克隆抗體的親和力檢測(cè)利用間接elisa方法測(cè)定單克隆抗體的親和力，具體步驟如下：以1μg/ml重組蛋gst-chil-4包被酶標(biāo)反應(yīng)板，封閉后加入倍比稀釋的單克隆抗體，以hrp標(biāo)記的山羊抗小鼠igg為二抗，酶標(biāo)儀讀取od450吸光值。當(dāng)連續(xù)幾個(gè)稀釋度的od450讀數(shù)不再增大時(shí)視為抗原抗體100％結(jié)合，以抗體濃度(mol/l)為橫坐標(biāo)，od450吸光值為縱坐標(biāo)做散點(diǎn)圖，生成對(duì)數(shù)趨勢(shì)線和公式。將od450最大值的一半帶入公式，求出此時(shí)的抗體濃度即為單克隆抗體的親和力解離常數(shù)(kd)。結(jié)果表明2株單克隆抗體1g11-7f-9e-6b和2e5-g7-10c-7e的親和力分別為1.79×10-9和2.36×10-9。二、雙抗體夾心elisa檢測(cè)方法的建立及條件的優(yōu)化本發(fā)明在酶聯(lián)免疫的基礎(chǔ)上結(jié)合生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)建立了雙抗體夾心elisa檢測(cè)方法，該方法以1g11-7f-9e-6b為包被抗體、以重組蛋白gst-chil-4為夾心蛋白，以生物素標(biāo)記抗體2e5-g7-10c-7e為檢測(cè)抗體，利用生物素化抗體和hrp標(biāo)記的鏈霉親和素之間的高親和力及高特異性結(jié)合的特點(diǎn)，使大量的酶分子聚集在抗原抗體復(fù)合物周圍，產(chǎn)生多級(jí)放大作用，使每個(gè)抗體攜帶的酶分子顯著增加，從而極大地提高靈敏度。按照常規(guī)雙抗體夾心elisa方法進(jìn)行操作，每?jī)?yōu)化一個(gè)條件則固定其他條件。當(dāng)優(yōu)化好一個(gè)條件a后，那么下一次優(yōu)化另一條件b時(shí)，則采用a的條件，其他條件仍固定，以此類推，直到所有的條件優(yōu)化完畢。每完成一次條件優(yōu)化，需對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，綜合考慮p/n值(p/n值＝陽性對(duì)照od450均值/陰性對(duì)照od450均值，通常以p/n值最大，且p值接近1，n值較小作為最佳反應(yīng)條件的判定依據(jù))以及線性關(guān)系良好的夾心蛋白濃度范圍兩方面，確定最佳反應(yīng)條件。1、包被條件的優(yōu)化分別以0.05m甘氨酸-鹽酸(ph2.8)、0.05m檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ph3.0)、0.05m檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ph4.0)、0.05m檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ph5.0)、0.05m磷酸鹽緩沖液(ph6.0)、0.05m磷酸鹽緩沖液(ph7.0)、0.05m磷酸鹽緩沖液(ph8.0)、0.05m碳酸鹽緩沖液(ph9.6)和0.05m碳酸氫鈉-氫氧化鈉緩沖液(ph10.0)為包被液，將1g11-7f-9e-6b抗體稀釋至濃度為10μg/ml，4℃包被12h，1％的pbst洗滌3遍后，用5％的脫脂奶4℃封閉12h后洗滌，加入以pbs進(jìn)行倍比稀釋的重組蛋白gst-il-4，并以pbs為陰性對(duì)照，37℃孵育1h后洗滌。用pbs將生物素化抗體稀釋至10μg/ml(生物素化抗體的制備方法參照抗體生物素標(biāo)記試劑盒(購(gòu)自thermoscientific，prod#21440)中說明書所述方法)，37℃孵育1h后洗滌，用1％的bsa按1:10000對(duì)hrp標(biāo)記的鏈霉親和素(購(gòu)自thermoscientific，prod#21130)進(jìn)行稀釋，37℃孵育30min后洗滌，加入顯色液tmb并室溫顯色適當(dāng)時(shí)間后，2mh2so4終止。在酶標(biāo)儀上讀取od450吸光值，根據(jù)判定條件確定最佳包被液。在優(yōu)化包被溫度及時(shí)間時(shí)，用最佳包被液對(duì)抗體進(jìn)行稀釋，分別室溫包被12h、4℃包被12h和37℃包被2h，其他反應(yīng)條件同上，在酶標(biāo)儀上讀取od450吸光值，根據(jù)判定條件確定最佳包被溫度及時(shí)間。在優(yōu)化包被濃度時(shí)，用最佳包被液將抗體分別稀釋到5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml和20μg/ml，采用最佳包被溫度及時(shí)間，其他反應(yīng)條件同上，在酶標(biāo)儀上讀取od450吸光值，根據(jù)判定條件確定最佳包被濃度。根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，最佳包被條件如下：0.05m磷酸鹽緩沖液(ph6.0)稀釋包被抗體至5μg/ml，4℃包被12h。2、封閉條件的優(yōu)化采用已優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件，分別以5％的脫脂奶、2％的bsa、1％的明膠和5％的脫脂奶+1％的酪蛋白作為封閉液，在4℃，12h和37℃，2h的條件下進(jìn)行封閉，其他反應(yīng)條件同上，在酶標(biāo)儀上讀取od450吸光值，根據(jù)判定條件確定最佳封閉條件。根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，最佳的封閉條件如下：5％的脫脂奶，4℃封閉12h。3、生物素化抗體作用濃度的優(yōu)化采用已優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件，將生物素化抗體分別稀釋至0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml，其他反應(yīng)條件同上，在酶標(biāo)儀上讀取od450吸光值，根據(jù)判定條件確定最佳生物素化抗體作用濃度。根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，最佳生物素化抗體作用濃度為1.0μg/ml。4、夾心蛋白及生物素化抗體稀釋液的優(yōu)化采用已優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件，分別以pbs、5％的脫脂奶、2.5％的脫脂奶、1.25％的脫脂奶和1％的bsa對(duì)生物素化抗體和夾心蛋白進(jìn)行稀釋，其他反應(yīng)條件不變，在酶標(biāo)儀上讀取od450吸光值，根據(jù)判定條件確定最佳夾心蛋白及生物素化抗體稀釋液(確定以后，將最佳稀釋液作為陰性對(duì)照)。根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，最佳夾心蛋白及生物素化抗體稀釋液為1％的bsa。5、夾心蛋白孵育時(shí)間的優(yōu)化采用已優(yōu)化的最佳條件，夾心蛋白分別孵育0.5h、1.0h、1.5h和2.0h，其他反應(yīng)條件不變，在酶標(biāo)儀上讀取od450吸光值，根據(jù)判定條件確定最佳夾心蛋白孵育時(shí)間。根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，最佳夾心蛋白孵育時(shí)間為1h。6、生物素化抗體孵育時(shí)間的優(yōu)化采用已優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件，生物素化抗體分別孵育0.5h、1.0h、1.5h和2.0h，其他反應(yīng)條件不變，在酶標(biāo)儀上讀取od450吸光值，根據(jù)判定條件確定最佳生物素化抗體孵育時(shí)間。根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，最佳生物素化抗體孵育時(shí)間為2h。7、洗板次數(shù)的優(yōu)化采用已優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件，分別洗板3、4和6次，其他反應(yīng)條件不變，在酶標(biāo)儀上讀取od450吸光值，根據(jù)判定條件確定最佳洗板次數(shù)。根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，最佳洗板次數(shù)為6次。8、hrp標(biāo)記的鏈霉親和素孵育時(shí)間的優(yōu)化采用已優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件，hrp標(biāo)記的鏈霉親和素分別孵育15min、30min、45min和60min，其他反應(yīng)條件不變，在酶標(biāo)儀上讀取od450吸光值，根據(jù)判定條件確定最佳hrp標(biāo)記的鏈霉親和素的孵育時(shí)間。根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，最佳hrp標(biāo)記的鏈霉親和素的孵育時(shí)間為15min。9、最佳反應(yīng)條件的確定通過上述反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定雙抗體夾心elisa檢測(cè)方法的反應(yīng)條件如下：ph6.0的磷酸鹽緩沖液稀釋包被抗體1g11-7f-9e-6b至5μg/ml，4℃包被12h；5％脫脂奶，4℃封閉12h；用1％的bsa稀釋夾心蛋白(重組蛋白gst-chil-4)，37℃孵育1h；用1％的bsa將生物素化抗體2e5-g7-10c-7e稀釋至1.0μg/ml，37℃孵育2h；用1％的bsa按照1:10000的比例對(duì)hrp標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行稀釋，37℃孵育15min；pbst洗板6次。實(shí)施例2、用于檢測(cè)禽il-4的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的靈敏度檢測(cè)一、本發(fā)明的用于檢測(cè)禽il-4的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的靈敏度檢測(cè)按照實(shí)施1中確定的雙抗體夾心elisa檢測(cè)方法的最優(yōu)條件，以1g11-7f-9e-6b為包被抗體、生物素化抗體2e5-g7-10c-7e為檢測(cè)抗體，將夾心蛋白倍比稀釋至不同濃度后進(jìn)行elisa試驗(yàn)，并以夾心蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以od450為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體步驟如下：1、用ph6.0的磷酸鹽緩沖液將包被抗體1g11-7f-9e-6b稀釋成5μg/ml，100μl/孔，4℃包被12h后，洗滌緩沖液洗滌6次，300μl/孔，甩干孔內(nèi)殘留液體；2、5％的脫脂奶，300μl/孔，4℃封閉12h后，洗滌同上；3、用1％的bsa將夾心蛋白(重組蛋白gst-chil-4)稀釋至不同濃度(濃度如表1所示)，100μl/孔，37℃孵育1h后，洗滌同上；4、用1％的bsa對(duì)生物素化抗體2e5-g7-10c-7e進(jìn)行稀釋，使其最終濃度為1μg/ml，100μl/孔，37℃孵育2h后，洗滌同上；5、用1％的bsa按1:10000的比例對(duì)hrp標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行稀釋，100μl/孔，37℃孵育15min后，洗滌同上；6、加入顯色液tmb，100μl/孔，待陰性對(duì)照輕微變藍(lán)時(shí)，加入2mh2so4，50μl/孔，終止反應(yīng)；7、酶標(biāo)儀讀取od450吸光值。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。夾心蛋白濃度與od450線性關(guān)系如表1所示。結(jié)果表明：夾心蛋白濃度在64pg/ml-40ng/ml的濃度范圍內(nèi)，其濃度與od450線性關(guān)系良好，所能檢測(cè)到的最小夾心蛋白濃度為64pg/ml。表1、夾心蛋白濃度與od450線性關(guān)系夾心蛋白度(ng/ml)10002004081.60.320.0640od4503.03803.02651.45100.54600.29050.25000.24800.2243二、對(duì)比文獻(xiàn)中抗體靈敏度的檢測(cè)按照步驟一中的方法，分別以文獻(xiàn)“抗雞白細(xì)胞介素4單克隆抗體的制備及鑒定”中的雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗chil-4抗體為包被抗體和檢測(cè)抗體，將夾心蛋白倍比稀釋至不同濃度后進(jìn)行elisa試驗(yàn)。包被抗體、檢測(cè)抗體及夾心蛋白的濃度具體如表2和表3所示。結(jié)果如表2和表3所示。不同抗體組合夾心蛋白濃度與od450線性關(guān)系如表2所示。從表中可以看出：文獻(xiàn)中以1g11-3b為包被抗體，生物素化抗體1g11-5h為檢測(cè)抗體的組合檢測(cè)效果最好，這對(duì)抗體組合經(jīng)條件優(yōu)化后能檢測(cè)到的最小夾心蛋白濃度為156pg/ml，如表3所示。因此，本發(fā)明的以1g11-7f-9e-6b為包被抗體、生物素化抗體2e5-g7-10c-7e為檢測(cè)抗體的抗體組合的靈敏度明顯更好。表2、對(duì)比文獻(xiàn)中雜交瘤細(xì)胞株所分泌抗體用于夾心elisa的檢測(cè)情況表3、文獻(xiàn)中最佳抗體組合夾心蛋白濃度與od450線性關(guān)系夾心蛋白度(ng/ml)201052.51.250.6250.3130.1560od4500.69800.46500.32700.27500.24000.22750.20900.19600.1900實(shí)施例3、用于檢測(cè)禽il-4的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用采用本發(fā)明的用于檢測(cè)禽il-4的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒對(duì)70份1日齡雛雞血清和56份沙門菌抗體陽性血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，初步判斷該檢測(cè)方法臨床實(shí)用性。具體步驟如下：1、用ph6.0的磷酸鹽緩沖液將包被抗體1g11-7f-9e-6b稀釋成5μg/ml，100μl/孔，4℃包被12h后，洗滌緩沖液洗滌6次，300μl/孔，甩干孔內(nèi)殘留液體；2、5％的脫脂奶，300μl/孔，4℃封閉12h后，洗滌同上；3、用1％的bsa按1:10的比例對(duì)待測(cè)血清樣品進(jìn)行稀釋，100μl/孔，37℃孵育1h后，洗滌同上；4、用1％的bsa對(duì)生物素化抗體2e5-g7-10c-7e進(jìn)行稀釋，使其最終濃度為1μg/ml，100μl/孔，37℃孵育2h后，洗滌同上；5、用1％的bsa按1:10000對(duì)hrp標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行稀釋，100μl/孔，37℃孵育15min后，洗滌同上；6、加入顯色液tmb，100μl/孔，待陰性對(duì)照輕微變藍(lán)時(shí)，加入2mh2so4，50μl/孔，終止反應(yīng)；7、酶標(biāo)儀讀取od450吸光值。將od450吸光值代入實(shí)施例2中的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到待測(cè)血清樣品中chil-4濃度。結(jié)果如表4和表5所示。結(jié)果表明：70份1日齡雛雞血清中，有7份被檢測(cè)出chil-4濃度較高，其余血清中chil-4的濃度較低，不在本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測(cè)線性濃度范圍內(nèi)的濃度以0表示。56份沙門菌抗體陽性血清中，除2份濃度為0外，其余血清中被檢測(cè)出的chil-4濃度均較高，且絕大部分檢出的chil-4濃度遠(yuǎn)高于1日齡雛雞血清的chil-4濃度。表4、1日齡雛雞血清檢測(cè)表5、沙門菌抗體陽性血清檢測(cè)序列表<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種檢測(cè)禽白細(xì)胞介素4含量的方法及其專用試劑盒<160>6<210>1<211>336bp<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1ttacagctctcagtgccgctgatggagagcatccggatagtgaatgacatccagggagag60gtttcctgcgtcaagatgaacgtgacagatatctttgcagacaataagacaaataacaaa120actgagctcttatgcaaagcctccacaattgtttgggagagccagcactgccacaagaac180ctgcagggtctcttcctcaacatgcgtcagctcctgaatgccagcagcacctccctcaag240gcaccatgtcccacggcagcaggcaacactacttcaatggagaagttcctagcagaccta300cgtaccttcttccaccaactagctaaaaataagtga336<210>2<211>240bp<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2ttacagctctcagtgccgctgatggagagcatccggatagtgaatgacatccagggagag60gtttcctgcgtcaagatgaacgtgacagatatctttgcagacaataagacaaataacaaa120actgagctcttatgcaaagcctccacaattgtttgggagagccagcactgccacaagaac180ctgcagggtctcttcctcaacatgcgtcagctcctgaatgccagcagcacctccctcaag240<210>3<211>216bp<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3actgagctcttatgcaaagcctccacaattgtttgggagagccagcactgccacaagaac60ctgcagggtctcttcctcaacatgcgtcagctcctgaatgccagcagcacctccctcaag120gcaccatgtcccacggcagcaggcaacactacttcaatggagaagttcctagcagaccta180cgtaccttcttccaccaactagctaaaaataagtga216<210>4<211>435bp<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4catactgcaagtagtctaaatcttgttcaacttcaagatgatatagacaaactgaaagct60gactttaactcaagtcattcagatgtagctgacggtggacctattattgtagagaaactg120aagaactggacagagagaaatgagaaaaggatcatactgagccagattgtttcgatgtac180ttggaaatgcttgaaaacactgacaagtcaaagccgcacatcaaacacatatctgaggag240ctctatactctgaaaaacaaccttcctgatggcgtgaagaaggtgaaagatatcatggac300ctggccaagctcccgatgaacgacttgagaatccagcgcaaagccgcgaatgaactcttc360agcatcttacagaagctggtggatcctccgagtttcaaaaggaaaaggagccagtctcag420aggagatgcaattgc435<210>5<211>40<212>prt<213>人工序列<220><223><400>5leuglnleuservalproleumetgluserileargilevalasnasp151015ileglnglygluvalsercysvallysmetasnvalthraspilephe202530alaaspasnlysthrasnasnlys3540<210>6<211>40<212>prt<213>人工序列<220><223><400>6thrgluleuleucyslysalaserthrilevaltrpgluserglnhis151015cyshislysasnleuglnglyleupheleuasnmetargglnleuleu202530asnalaserserthrserleulys3540當(dāng)前第1頁12