本發(fā)明涉及生物電化學(xué)與電化學(xué)傳感領(lǐng)域，以及電化學(xué)分析領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

碳納米材料具有不同的形態(tài)和獨有的性質(zhì)，是近年來各學(xué)科的研究熱點；石墨烯(graphene，gr)是由碳六元環(huán)組成的二維碳納米片，表現(xiàn)為周期蜂窩狀點陣結(jié)構(gòu),厚度為單原子層。它可以翹曲成零維的富勒烯，卷曲成一維的碳納米管或堆疊成三維的石墨。由于其獨特的電學(xué)、熱學(xué)、力學(xué)和化學(xué)性質(zhì)，而且可以通過化學(xué)反應(yīng)改變其大小、形狀和相對sp²雜化范圍，因此可以用于進行g(shù)r的衍生化與功能化，進而調(diào)控其結(jié)構(gòu)與性能。gr及其衍生物在材料、能源、傳感器、轉(zhuǎn)換器和生物醫(yī)藥等方面有著廣泛的應(yīng)用。

石墨烯量子點(graphenequantumdots,gqds)通常定義為由單原子層的納米石墨片構(gòu)成的小尺寸石墨烯，為橫向尺寸小于100nm，縱向為單層、雙層或多層的石墨納米材料。它具有強烈的量子限制效應(yīng)和邊緣效應(yīng)，可以表現(xiàn)出獨特的結(jié)構(gòu)和光電化學(xué)性質(zhì)，以及與波長相關(guān)的熒光現(xiàn)象，使其在生物成像、醫(yī)療診斷、催化和光電池設(shè)備具有潛在的應(yīng)用價值；gods擁有石墨烯的結(jié)構(gòu)，與傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點和碳量子點相比，它還具有獨有的優(yōu)異性質(zhì)，如大的比表面積、導(dǎo)電導(dǎo)熱性好、易于化學(xué)修飾等理化性質(zhì)。異原子摻雜是一種常用的調(diào)控納米材料性能的方法，通過化學(xué)摻雜異原子后可以有效的調(diào)節(jié)石墨烯共軛平面的電荷密度和帶寬能隙，進而改變電子的流動密度和躍遷方式，達(dá)到調(diào)節(jié)其理化性能的目的；由于硼（b）原子的原子半徑與碳原子相接近，易于嵌入到石墨烯的結(jié)構(gòu)之中，而且b原子比c原子外層少了一個電子，表現(xiàn)出一定的缺電子性，因此會改變gods的光電化學(xué)性質(zhì)。摻雜上異原子或功能化基團可以賦予gqds更優(yōu)異的理化性質(zhì)，并且不同元素?fù)诫s可以改變gqds的結(jié)構(gòu)缺陷和表面功能基團，調(diào)控碳原子與其相鄰的c、o和摻雜原子之間的相互作用。

血紅蛋白（hb）是一種水溶性氧化還原型蛋白質(zhì)，其主要生物功能是儲存和運輸氧氣。它是由肽鏈、珠蛋白和血紅素組成的，相對分子質(zhì)量約為64500，其肽鏈繞成一個近似于球形的三維宏觀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部的孔洞包埋著血紅素；每個血紅素又由4個吡咯環(huán)組成，環(huán)中間存在著電化學(xué)活性中心fe^2+/3+，所以hb經(jīng)常被選來當(dāng)作研究蛋白質(zhì)直接電化學(xué)和電化學(xué)傳感器的模型分子。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明構(gòu)建了一種新型第三代電化學(xué)酶傳感器件，克服了前兩代酶傳感器的諸多問題，例如線性范圍窄、受測定體系的限制、使用媒介體制作電極過程復(fù)雜，且介體有可能污染電極等；利用b-gqds為電子轉(zhuǎn)移促進劑，通過將hb固定在b-gqds修飾電極表面，制備出一種新型電化學(xué)生物傳感器。

為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案：

1.一種基于hb在b-gqds修飾電極上的電化學(xué)生物傳感器件的制備與應(yīng)用研究，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將1.6g石墨粉和0.8ghppf6混合，用研缽研磨均勻后填入玻璃電極管(φ=4mm)中并壓實，插入銅線作為電極的導(dǎo)線，制得的電極即為碳離子液體電極(cile)，使用前將電極表面在稱量紙上打磨成鏡面；

(2)修飾電極的制備

取b-gqds超聲分散液涂到表面已經(jīng)處理好的cile上，自然晾干后將hb溶液涂布到b-gqds/cile上，自然晾干后再涂nafion溶液，晾干后就制得了修飾電極nafion/hb/b-gqds/cile。同樣方法制備nafion/cile、nafion/hb/cile、nafion/b-gqds/cile等修飾電極。

所述的碳離子液體電極，其特征在于，離子液體為1-己基吡啶六氟磷酸鹽(hppf6)用量為0.8g，石墨粉的用量為1.6g。

所述的修飾電極，其特征在于，修飾材料b-gqds的用量和濃度分別為6.0μl和0.6mg·ml^-1;hb的用量和濃度分別為8.0μl和15mg·ml^-1；nafion的用量和質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.0μl和0.5%。

所述的hb/b-gqd復(fù)合膜，利用傅里葉變換紅外光譜（ft-ir）研究hb的二級結(jié)構(gòu)是否發(fā)生構(gòu)象變化。

所述的修飾電極，利用電化學(xué)交流阻抗圖譜（eis）考察了不同修飾電極的界面電阻。

所述的hb/b-gqds復(fù)合膜修飾電極，采用循環(huán)伏安法（cv）考察了修飾電極表面hb的直接電化學(xué)行為。

所述hb的直接電化學(xué)行為，其特征在于，電解質(zhì)溶液為ph4.0的磷酸鹽緩沖溶液，掃速為100mv·s^-1。

一種基于hb/b-gods修飾電極的電化學(xué)生物傳感器件的應(yīng)用，在于利用所構(gòu)建的生物傳感器對亞硝酸鈉（nano2）進行電催化還原檢測。

根據(jù)上述的生物傳感器的應(yīng)用，其特征在于，以ph4.0的pbs緩沖溶液為測試溶液，采用循環(huán)伏安技術(shù)測試生物傳感器的實際應(yīng)用性能，掃速為100mv·s^-1。

附圖說明

圖1：（a）hb和（b）hb/b-gqds復(fù)合膜的傅里葉變換紅外光譜圖。

圖2：不同修飾電極的電化學(xué)交流阻抗圖譜，（a）nafion/b-gqds/cile；（b）nafion/hb/b-gqdscile；（c）nafion/cile和（d）nafion/hb/cile。

圖3：不同修飾電極的循環(huán)伏安圖（a）cile；（b）nafion/cile；（c）nafion/b-gqds/cile；（d）nafion/hb/cile；（e）nafion/hb/b-gqds/cile（ph4.0pbs緩沖溶液，掃速為100mv·s^-1）。

圖4：修飾電極在不同濃度nano2存在下的循環(huán)伏安圖（a到m為1.0,5.0,10.0,15.0,20.0,30.0,40.0,50.0,60.0,70.0,80.0,90.0,100.0mmoll^-1）（插圖：還原峰電流與nano2濃度之間的關(guān)系曲線）。

具體實施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作進一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

紅外光譜分析

傅立葉變換紅外光譜（ft-ir）是檢查血紅素蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性的常用方法。在1700-1600cm^?1處的峰由c=o伸縮振動引起，1600-1500cm^?1處的峰為n–h彎曲振動和c–n伸縮振動引起，如圖1a中hb的特征峰在1651cm^?1和1541cm^?1，而圖1b中發(fā)生b-gqds和hb混合后的峰出現(xiàn)在1651cm^?1and1542cm^?1，說明混合膜中hb沒有發(fā)生變性。

實施例2

電化學(xué)交流阻抗分析

電化學(xué)交流阻抗譜(eis)能夠有效提供電極表面修飾過程的阻抗變化信息，并且電子轉(zhuǎn)移電阻(ret)可以通過半圓的直徑獲得；圖2分別為nafion/b-gqds/cile(曲線a)，nafion/hb/b-gqds/cile(曲線b)，nafion/cile(曲線c)和nafion/hb/cile(曲線d)的交流阻抗譜圖。半圓的直徑等同于阻抗值的大小，代表電極表面的電阻大小。nafion/cile(曲線c)的阻抗值為85ω，在nafion/b-gqds/cile(曲線a)上的阻抗值降低到為37ω，而nafion/hb/cile(曲線d)的阻值增大到102ω；這表明導(dǎo)電性高的b-gqds有利于降低界面的電阻，而不導(dǎo)電的生物高分子hb在界面的存在阻礙了[fe(cn)6]^3-/4-的電子轉(zhuǎn)移，進而增加了電阻值。而nafion/hb/b-gqds/cile的阻抗值為60ω，介于nafion/b-gqds/cile和nafion/hb/cile之間，說明b-gqds和hb能共同存在與電極表面。

實施例3

hb在修飾電極上的直接電化學(xué)

圖3為不同修飾電極在ph4.0的pbs緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖；從圖中可以看出，在cile(曲線a)，nafion/cile(曲線b)，nafion/b-gqds/cile(曲線c)上沒有氧化峰還原峰，表明電極表面不存在電活性物質(zhì)；在nafion/hb/cile(曲線d)上出現(xiàn)了一對非對稱的氧化還原峰，說明hb和cile之間的電子傳輸速度較慢。而在nafion/hb/b-gqds/cile(曲線e)上有一對良好且準(zhǔn)可逆的氧化還原峰出現(xiàn)，b-gqds的存在使得氧化還原峰變得更加對稱，氧化還原峰電流也隨之增加；這是由于電極表面上高導(dǎo)電性和小面積的b-gqds可以加快hb與電極之間的電子轉(zhuǎn)移；從曲線d中可以直接看出峰電位分別為還原峰epc為-0.251v和氧化峰epa為-0.165v(vs.sce)，峰電位差(△ep)為0.086v，式電位e^0'=-0.208v(vs.sce)，氧化還原峰電流之比接近于1，表現(xiàn)出蛋白質(zhì)內(nèi)血紅素輔基fe(iii)/fe(ii)氧化還原電對的特征電化學(xué)行為。

實施例4

hb修飾電極對nano2的電催化

nafion/hb/b-gqds/cile電催化還原nano2的催化效果結(jié)果如圖4所示。在ph4.0的pbs緩沖溶液加入nano2后記錄循環(huán)伏安曲線，發(fā)現(xiàn)在-0.809v出現(xiàn)新的還原峰，還原峰電流隨著nano2濃度的增大而增大。當(dāng)nano2的濃度在1.0~10.0mmoll^-1的范圍內(nèi)時，還原峰電流和nano2的濃度大小成良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為i(μa)=1.13226c(mm)+2.44759(n=7,γ=0.962)；當(dāng)nano2的濃度在10.0~80.0mmoll^-1的范圍內(nèi)時，還原峰電流和nano2的濃度大小成良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為i(μa)=0.1460c(mm)+12.26(n=9,γ=0.992)，檢測限為0.3mmoll^-1(3σ)；當(dāng)nano2的濃度大于80.0mmol/l時峰電流會出現(xiàn)一個平臺，電流值保持不變，可根據(jù)雙倒數(shù)作圖法(1/iss~1/[nano2])計算nafion/hb/b-gqds/cile對nano2的催化反應(yīng)的表觀米氏常數(shù)（km^app）為6.372mmoll^-1。