本發(fā)明屬于肉類品質(zhì)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種牛羊肉中四種雌激素殘留量的測定方法。

背景技術(shù)：

當(dāng)前，我國食品安全問題因三鹿奶粉中“三聚氰胺”事件而受到極大關(guān)注。除食品加工中惡意添加外，食品中污染的化學(xué)物質(zhì)更多的來自于喂養(yǎng)畜禽所使用的動物飼料、治病所用獸藥殘留及催熟植物所用的生長調(diào)節(jié)劑等。

激素類藥物在牛羊產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用可表現(xiàn)在提高牛羊的繁殖性能，免疫去勢，高飼料報酬、促進(jìn)生長，改善牛羊肉品質(zhì)，促進(jìn)泌乳牛羊的產(chǎn)奶量等。我們所食用的牛羊肉也不可避免的會有雌激素殘留，而這些激素就會通過食物鏈在人體內(nèi)積累，可誘發(fā)癌變，對生殖與神經(jīng)等系統(tǒng)帶來影響，還造成嚴(yán)重的環(huán)境問題。還能增加婦女得子宮癌的可能，使生殖道產(chǎn)生炎癥，使女性提前發(fā)育，使男性生殖器官發(fā)生異常與病變，及女性乳腺癌和子宮內(nèi)膜異位發(fā)生率上升，因此，對牛羊肉的監(jiān)測也是保證安全的措施之一。但是目前國家標(biāo)準(zhǔn)中只有己烯雌酚的檢測方法，而其余雌激素的沒有明確的測定方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決上述問題，提供一種牛羊肉中己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇雌激素殘留量的測定方法。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來具體實現(xiàn)：

一種牛羊肉中己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇雌激素殘留量的測定方法，包括如下步驟：

1）配制流動相、設(shè)置色譜條件

流動相：甲醇：磷酸氫二鈉溶液體積比80:20；

色譜條件：檢測波長210-400nm，流速為1.0ml/min，柱溫：40℃，進(jìn)樣量為10μl；

2）標(biāo)準(zhǔn)品貯備液的配制、供試樣品處理

①稱取己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)品各50mg，分別定容至50ml，制成1.0mg/ml標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，備用；

②稱取供試牛羊肉樣品，用甲醇進(jìn)行兩次超聲萃取-離心操作，取兩次離心后的上清液蒸干后加甲醇，過濾，制成供試品處理液，準(zhǔn)備上機(jī)；

3）混合標(biāo)樣的配制

分別吸取2.5ml步驟2）得到的己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇標(biāo)準(zhǔn)貯備液并混合，再將混合液用甲醇分別稀釋至雌激素濃度為0.4mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml，制成混合標(biāo)樣，備用；

4）線性回歸分析

將步驟2）得到的雌二醇、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的單個標(biāo)準(zhǔn)品貯備液過濾，以步驟1）的條件依次注入hplc中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間進(jìn)行定性，然后將步驟3）得到的0.4mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml的混合標(biāo)樣過濾，以步驟1）的條件依次注入hplc中，以4種混標(biāo)的峰面積比與其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸分析，得4種混標(biāo)的線性回歸方程；

5）供試樣品中雌激素含量的測定

將步驟2）得到的供試品處理液以步驟1）的條件注入hplc中，以峰面積、按步驟4）得到的線性回歸方程計算供試品處理液中己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的含量，然后計算供試牛羊肉樣品中己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的殘留量。

進(jìn)一步的，所述步驟1）中，所述磷酸氫二鈉溶液的濃度為0.043mol/l；

色譜柱類型為：c18，ods5μm，150×4mm；

所述檢測波長優(yōu)選為280nm。

進(jìn)一步的，所述步驟2）中，所述供試品處理液的具體制備方法為：

稱取供試牛羊肉粉碎樣品5.0g，放入20ml帶蓋離心管中，加甲醇10.0ml，超聲萃取20min，以10000轉(zhuǎn)/min離心10min，移出上清液，殘渣中再加10.0ml甲醇，再超聲萃取20min，以10000轉(zhuǎn)/min離心10min，合并上清液，于80℃水浴蒸干，用24ml甲醇溶解殘渣，經(jīng)0.22μm一次性有機(jī)濾膜過濾，得供試品處理液。

進(jìn)一步的，所述步驟4）中，過濾時使用的濾膜為0.45μm有機(jī)膜。

進(jìn)一步的，所述步驟5）中，供試牛羊肉樣品中己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的殘留量計算方法如下：

x=v1c/mv2；

式中：

x：樣品中某一種雌激素的含量mg/kg；

c：根據(jù)線性回歸方程得到的某一種雌激素的含量ng；

v1：樣品的最終溶解體積ml；

v2：進(jìn)樣體積μl；

m：樣品質(zhì)量g。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供的牛羊肉中己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇雌激素殘留量的測定方法，可以同時檢出牛羊肉中4種雌激素的殘留量，具有檢出限低、靈敏度高、操作簡便快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、檢測條件限制較小的優(yōu)點(diǎn)，具有很大的推廣性，同樣適用于其他激素類藥物。

附圖說明

圖1為4種雌激素的混合標(biāo)樣圖譜；

圖2為雌二醇的單標(biāo)圖譜；

圖3為己烯雌酚的單標(biāo)圖譜；

圖4為戊酸雌二醇的單標(biāo)圖譜；

圖5為苯甲酸雌二醇的單標(biāo)圖譜。

具體實施方式

為了更加突出本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合以下實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，但并不因此將本發(fā)明限制在實施例范圍之內(nèi)。

實施例1

1材料和方法

1.1材料

1.1.1試劑

甲醇，色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海；

磷酸二氫鈉（nah2po4·2h2o）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海；

0.043mol/l磷酸二氫鈉溶液：3.4g磷酸二氫鈉（nah2po4·2h2o）溶于水并定容在500ml容量瓶中得到。

1.1.2標(biāo)準(zhǔn)品

己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品：sigma-alorich，productofusa；

雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品：sigma-alorich，productofgermany；

苯甲酸雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所；

戊酸雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所。

己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇標(biāo)準(zhǔn)貯備液及混合標(biāo)樣的制備方法：

精密稱取50mg己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇定容在50ml容量瓶中，即得到每個單標(biāo)的儲備液為1mg/ml；然后分別吸取2.5ml己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇標(biāo)準(zhǔn)貯備液混合，再用甲醇分別稀釋至0.4mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml，存放在冰箱中備用。

1.2方法

1.2.1前處理方法

分別在甘肅省蘭州市、靖遠(yuǎn)縣、臨夏州、張掖地區(qū)采集羊肉樣品20份，蘭州市、張掖地區(qū)采集牛肉樣品20份。

樣品前處理方法：稱取粉碎樣品5.0g，放入20ml帶蓋離心管中，加甲醇10.0ml，超聲萃取20min，離心10min（10000轉(zhuǎn)/min），移出上清液。殘渣中再加10.0ml甲醇，再超聲萃取20min，離心10min（10000轉(zhuǎn)/min），合并上清液于80℃水浴蒸干，用24ml甲醇溶解殘渣，經(jīng)0.22μm一次性有機(jī)濾膜過濾，準(zhǔn)備上機(jī)。

1.2.2儀器及條件

waterse2695高效液相色譜儀，配有2998pad檢測器；超聲波清洗器；色譜柱：c18，ods5μm，150×4mm；流動相：甲醇：磷酸氫二鈉溶液（0.043mol/l）=80:20；流速：1.0ml/min；柱溫：40℃；檢測波長：280nm。分別取己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的單個標(biāo)準(zhǔn)品及0.4mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml的混合標(biāo)樣經(jīng)0.45μm的有機(jī)濾膜過濾，取10μl依次注入hplc中，先用標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間定性，再用混合標(biāo)樣、根據(jù)4種混標(biāo)的峰面積比與其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸分析，得線性回歸方程。

1.2.3計算公式

x=v1c/mv2；

式中：

x：樣品中某一種雌激素的含量(mg/kg)；

c：根據(jù)線性回歸方程得到的某一種雌激素的含量（ng）；

v1：樣品的最終溶解體積（ml）；

v2：進(jìn)樣體積（μl）；

m：樣品質(zhì)量（g）。

2結(jié)果

4種雌激素混標(biāo)圖譜見圖1，雌二醇、己烯雌酚、戊酸雌二醇、苯甲酸雌二醇單標(biāo)圖譜見圖2-5。

牛羊肉樣品中4種雌激素殘留量的檢測結(jié)果見表1。

表1牛羊肉樣品中4種雌激素殘留量的檢測結(jié)果

注：“--”表示未檢出，檢出量單位為mg/kg，初次檢測時所有樣品均未檢出雌激素，然后對蘭州市、臨夏州羊肉樣品和蘭州市牛肉樣品進(jìn)行加標(biāo)測試。

由表1，在所測定的6個地方的牛羊肉樣品中，初次檢測時均未檢出雌激素殘留，然后對蘭州市和臨夏州羊肉樣品、蘭州市牛肉樣品中進(jìn)行加標(biāo)檢測，同時檢測出己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇4種雌激素，蘭州市牛肉樣品中也同時檢測出上述4種雌激素，說明本發(fā)明的方法能夠檢測出牛羊肉中殘留的雌激素。

3條件選擇

3.1流動相的選擇

流動相是色譜分離中最重要的一步，直接關(guān)系到分析的靈敏度、檢出限、決定著能否將樣品的組份一一分離出來。本發(fā)明用甲醇、0.043mol/l磷酸二氫鈉溶液不同配比的溶劑進(jìn)行了實驗，以甲醇：磷酸氫二鈉溶液=40:60、甲醇：磷酸氫二鈉溶液=50:50、甲醇：磷酸氫二鈉溶液=70:30、甲醇：磷酸氫二鈉溶液=80:20、甲醇：磷酸氫二鈉溶液=90:10等不同比例的流動相進(jìn)行了實驗。結(jié)果顯示：以甲醇：磷酸氫二鈉溶液=80:20為流動相，分離效果較好。

3.2流速的選擇

流速的大小直接影響色譜柱及系統(tǒng)的壓力、樣品各組分分離效果和出峰時間。在流動相確定之后，選擇最佳分離度和最短分離時間的流速，流速太小，出峰時間太長，流速太大，系統(tǒng)的壓力太高，容易引起柱頭塌陷。本申請采用1.0ml/min的流速。

3.3柱溫的選擇

柱溫是影響樣品組份分離度的因素之一?，F(xiàn)有技術(shù)大多以30℃或者室溫為柱溫，通過以30℃、室溫和40℃分別試驗，結(jié)果40℃的分離效果較好，故本發(fā)明柱溫采用40℃。

3.4波長的選擇：

利用pad檢測器的3d通道，在210-400nm的可見光范圍內(nèi)搜尋，發(fā)現(xiàn)在230nm和280nm兩個波長都有較好的吸收，再以標(biāo)準(zhǔn)品對照發(fā)現(xiàn)280nm波長下的分離度較230nm波長的分離度好，故選用280nm作為波長。

3.5本發(fā)明方法線性范圍、相關(guān)性及檢出限試驗，結(jié)果如表2所示。

表2線性范圍、相關(guān)性及檢出限

3.6精密度試驗：

用1.0mg/ml加標(biāo)樣品提取液進(jìn)樣10μl，進(jìn)樣6次分析，其峰面積、變異系數(shù)結(jié)果如表3所示。

表34種組份峰面積（area）測定的精密度結(jié)果

3.7準(zhǔn)確度試驗：

以羊肉樣品為樣，添加3個水平混標(biāo)測回收率，結(jié)果如表4所示。

表4樣品加標(biāo)回收率結(jié)果

由表4，加標(biāo)回收率范圍為85.96-101.56%。

通過上述實驗可知，本發(fā)明的方法檢出限較其他方法低，靈敏度高，具有較高的精密度和準(zhǔn)確度。本發(fā)明的方法使用的儀器較普遍，普通實驗室就可以具備，可以同時檢出4種雌激素，具有很大的推廣性。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。