本發(fā)明涉及生物學(xué)免疫方法的測定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種二亞甲基雙氧安非他明檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)：

二亞甲基雙氧安非他明俗稱搖頭丸(mdma)，是安非他明類衍生物，是亞甲二氧基甲基苯丙胺的片劑，屬中樞神經(jīng)興奮劑，是中國規(guī)定管制的精神藥品。搖頭丸是一種人工合成的致幻性苯丙胺類毒品，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有很強(qiáng)的興奮作用，服用后表現(xiàn)為活動(dòng)過度、情感沖動(dòng)、性欲亢進(jìn)、嗜舞、偏執(zhí)、妄想、自我約束力下降以及有幻覺和暴力傾向，具有很大的社會(huì)危害性。

國內(nèi)外有關(guān)mdma的檢測主要有高效液相色譜法(hplc)、氣相色譜法(gc)、高效薄層色譜法(hptlc)、酶聯(lián)免疫法等方法，上述方法雖然雖然檢測的靈敏度較高，但對(duì)儀器設(shè)備、檢測材料、實(shí)驗(yàn)人員的要求度都很高，不適合高通量、現(xiàn)場的快速檢測。因此研究具有快速、便攜等優(yōu)點(diǎn)的檢測方法具有現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本法公開了一種二亞甲基雙氧安非他明檢測試劑盒及其制備方法，能夠快速的檢測出尿液中的二亞甲基雙氧安非他明含量是否超標(biāo)，方便攜帶，適用于大眾場合的現(xiàn)場檢測。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種二亞甲基雙氧安非他明檢測試劑盒，包括：樣品墊、膠體金墊、檢測墊、吸水墊和pvc塑料薄板，所述樣品墊、膠體金墊、檢測墊、吸水墊依次粘貼在pvc塑料薄板上；所述膠體金墊為聚酯纖維膜并包被了二亞甲基雙氧安非他明抗體的膠體金標(biāo)記物，所述檢測墊為硝酸纖維素膜并依次包括由二亞甲基雙氧安非他明抗原包被的檢測線(t線)和由羊抗兔多克隆抗體包被的質(zhì)控線(c線)。

優(yōu)選地，所述樣品墊為玻璃纖維布。

優(yōu)選地，所述膠體金顆粒大小為40nm，膠體金包被濃度為od35-od55，包被量0.5-1.5μl/cm。

優(yōu)選地，所述二亞甲基雙氧安非他明抗原的濃度0.3-0.5mg/ml，包被量0.8μl/cm-1.2μl/cm。

優(yōu)選地，所述羊抗兔多克隆抗體的濃度為0.6-1.0mg/ml，包被量0.8μl/cm-1.2μl/cm。

一種二亞甲基雙氧安非他明檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：將二亞甲基雙氧安非他明抗體用膠體金標(biāo)記包被于聚酯纖維膜上，干燥后制得膠體金墊；將二亞甲基雙氧安非他明抗原用點(diǎn)膜機(jī)點(diǎn)于硝酸纖維素膜的檢測線(t線)上并干燥，將羊抗兔多克隆抗體用點(diǎn)膜機(jī)點(diǎn)于硝酸纖維素膜的質(zhì)控線(c線)上并干燥，制得檢測墊；將樣品墊、膠體金墊、檢測墊、吸水墊復(fù)合粘貼在pvc塑料薄板上；將復(fù)合好的塑料薄板置于切割機(jī)上，切割成單人份試紙；將單人份試紙裝入配套使用的塑料盒內(nèi)；將塑料盒、干燥劑放入鋁箔袋內(nèi)，封口、待檢；待檢品抽檢其靈敏度、特異性和穩(wěn)定性合格出廠。

優(yōu)選地，所述膠體金墊的干燥條件為37℃下干燥4-24小時(shí)。

優(yōu)選地，所述檢測線(t線)的干燥條件為45℃下干燥24小時(shí)。

優(yōu)選地，所述質(zhì)控線(c線)的干燥條件為37℃下干燥4-24小時(shí)。

本發(fā)明二亞甲基雙氧安非他明檢測試劑盒的使用方法為：將試劑盒從鋁箔袋取出后1小時(shí)內(nèi)使用，使用時(shí)在樣品墊處加入90μl-240μl尿液樣本，3-5分鐘之內(nèi)判讀結(jié)果，c、t線同時(shí)出現(xiàn)為陰性，只出現(xiàn)c線為陽性，只出現(xiàn)t線測試無效；若溫度高于30℃或者處于高濕條件下，應(yīng)立即使用。

本發(fā)明二亞甲基雙氧安非他明檢測試劑盒的使用原理為：當(dāng)?shù)稳氪郎y尿液樣品時(shí)，由于毛細(xì)作用，樣品將沿著試紙向吸水墊層析移動(dòng)，尿液樣品中的二亞甲基雙氧安非他明抗原與膠體金墊中的二亞甲基雙氧安非他明抗體結(jié)合發(fā)生特異反應(yīng)，當(dāng)移動(dòng)至檢測線t時(shí)，由于膠體金墊中的二亞甲基雙氧安非他明抗體與樣品中的二亞甲基雙氧安非他明抗原結(jié)合而無法與檢測線t上的二亞甲基雙氧安非他明抗原結(jié)合，因此膠體金無法滯留于檢測線t上，即t線不顯色；相反，如果樣品中沒有與膠體金墊中的二亞甲基雙氧安非他明抗體結(jié)合的二亞甲基雙氧安非他明抗原，則膠體金滯留于檢測線t上，t線顯色。當(dāng)移動(dòng)至質(zhì)控線c時(shí)，無論樣品中是否含有二亞甲基雙氧安非他明抗原，膠體金標(biāo)記物均會(huì)與包被在c線上的羊抗兔多克隆抗體結(jié)合顯色，從而判定是否有足夠樣本，層析過程是否正常。

本發(fā)明設(shè)定了尿液中的二亞甲基雙氧安非他明濃度界限值為500ng/ml：超過500ng/ml，c線顯色，結(jié)果為陽性；低于500ng/ml，c、t線同時(shí)顯色，結(jié)果為陰性；只出現(xiàn)t線，測試無效。

本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)，確定了各個(gè)檢測試劑的最佳含量參數(shù)，使本發(fā)明具有以下有益效果：

制備方法簡單，使用方便，成本低廉；特異性強(qiáng)，靈敏度高，存儲(chǔ)容易，攜帶方便，不需要特定的儀器設(shè)備，無需專業(yè)人員也能快速而準(zhǔn)確的得到檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一種二亞甲基雙氧安非他明檢測試劑盒，包括：樣品墊、膠體金墊、檢測墊、吸水墊和pvc塑料薄板，所述樣品墊、膠體金墊、檢測墊、吸水墊依次粘貼在pvc塑料薄板上；所述膠體金墊為聚酯纖維膜并包被了二亞甲基雙氧安非他明抗體的膠體金標(biāo)記物，所述檢測墊為硝酸纖維素膜并依次包括由二亞甲基雙氧安非他明抗原包被的檢測線(t線)和由羊抗兔多克隆抗體包被的質(zhì)控線(c線)。

其中，樣品墊為玻璃纖維布，膠體金顆粒大小為40nm，膠體金包被濃度為od35，包被量0.5μl/cm。二亞甲基雙氧安非他明抗原的濃度0.3mg/ml，包被量0.8μl/cm。羊抗兔多克隆抗體的濃度為0.6mg/ml，包被量0.8μl/cm。

一種二亞甲基雙氧安非他明檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：將二亞甲基雙氧安非他明抗體用膠體金標(biāo)記包被于聚酯纖維膜上，37℃條件下干燥4小時(shí)，制得膠體金墊；將二亞甲基雙氧安非他明抗原用點(diǎn)膜機(jī)點(diǎn)于硝酸纖維素膜的檢測線(t線)上，45℃條件下干燥24小時(shí)，將羊抗兔多克隆抗體用點(diǎn)膜機(jī)點(diǎn)于硝酸纖維素膜的質(zhì)控線(c線)上，37℃條件下干燥4小時(shí)，制得檢測墊；將樣品墊、膠體金墊、檢測墊復(fù)合粘貼在pvc塑料薄板上；將復(fù)合好的塑料薄板置于切割機(jī)上，切割成單人份試紙；將單人份試紙裝入配套使用的塑料盒內(nèi)；將塑料盒、干燥劑放入鋁箔袋內(nèi)，封口、待檢；待檢品抽檢其靈敏度、特異性和穩(wěn)定性合格出廠。

實(shí)施例2

一種二亞甲基雙氧安非他明檢測試劑盒，包括：樣品墊、膠體金墊、檢測墊、吸水墊和pvc塑料薄板，所述樣品墊、膠體金墊、檢測墊、吸水墊依次粘貼在pvc塑料薄板上；所述膠體金墊為聚酯纖維膜并包被了二亞甲基雙氧安非他明抗體的膠體金標(biāo)記物，所述檢測墊為硝酸纖維素膜并依次包括由二亞甲基雙氧安非他明抗原包被的檢測線(t線)和由羊抗兔多克隆抗體包被的質(zhì)控線(c線)。

其中，樣品墊為玻璃纖維布，膠體金顆粒大小為40nm，膠體金包被濃度為od55，包被量1.5μl/cm。二亞甲基雙氧安非他明抗原的濃度0.5mg/ml，包被量1.2μl/cm。羊抗兔多克隆抗體的濃度為1.0mg/ml，包被量1.2μl/cm。

一種二亞甲基雙氧安非他明檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：將二亞甲基雙氧安非他明抗體用膠體金標(biāo)記包被于聚酯纖維膜上，37℃條件下干燥24小時(shí)，制得膠體金墊；將二亞甲基雙氧安非他明抗原用點(diǎn)膜機(jī)點(diǎn)于硝酸纖維素膜的檢測線(t線)上，45℃條件下干燥24小時(shí)，將羊抗兔多克隆抗體用點(diǎn)膜機(jī)點(diǎn)于硝酸纖維素膜的質(zhì)控線(c線)上，37℃條件下干燥24小時(shí)，制得檢測墊；將樣品墊、膠體金墊、檢測墊復(fù)合粘貼在pvc塑料薄板上；將復(fù)合好的塑料薄板置于切割機(jī)上，切割成單人份試紙；將單人份試紙裝入配套使用的塑料盒內(nèi)；將塑料盒、干燥劑放入鋁箔袋內(nèi)，封口、待檢；待檢品抽檢其靈敏度、特異性和穩(wěn)定性合格出廠。

實(shí)施例3

一種二亞甲基雙氧安非他明檢測試劑盒，包括：樣品墊、膠體金墊、檢測墊、吸水墊和pvc塑料薄板，所述樣品墊、膠體金墊、檢測墊、吸水墊依次粘貼在pvc塑料薄板上；所述膠體金墊為聚酯纖維膜并包被了二亞甲基雙氧安非他明抗體的膠體金標(biāo)記物，所述檢測墊為硝酸纖維素膜并依次包括由二亞甲基雙氧安非他明抗原包被的檢測線(t線)和由羊抗兔多克隆抗體包被的質(zhì)控線(c線)。

其中，樣品墊為玻璃纖維布，所述膠體金顆粒大小為40nm，膠體金包被濃度為od45，包被量1.0μl/cm。二亞甲基雙氧安非他明抗原的濃度0.4mg/ml，包被量1.0μl/cm。羊抗兔多克隆抗體的濃度為1.0mg/ml，包被量1.0μl/cm。

一種二亞甲基雙氧安非他明檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：將二亞甲基雙氧安非他明抗體用膠體金標(biāo)記包被于聚酯纖維膜上，37℃條件下干燥12小時(shí)，制得膠體金墊；將二亞甲基雙氧安非他明抗原用點(diǎn)膜機(jī)點(diǎn)于硝酸纖維素膜的檢測線(t線)上，45℃條件下干燥24小時(shí)，將羊抗兔多克隆抗體用點(diǎn)膜機(jī)點(diǎn)于硝酸纖維素膜的質(zhì)控線(c線)上，37℃條件下干燥12小時(shí)，制得檢測墊；將樣品墊、膠體金墊、檢測墊復(fù)合粘貼在pvc塑料薄板上；將復(fù)合好的塑料薄板置于切割機(jī)上，切割成單人份試紙；將單人份試紙裝入配套使用的塑料盒內(nèi)；將塑料盒、干燥劑放入鋁箔袋內(nèi)，封口、待檢；待檢品抽檢其靈敏度、特異性和穩(wěn)定性合格出廠。

各參數(shù)的設(shè)定實(shí)驗(yàn)

1.膠體金標(biāo)記二亞甲基雙氧安非他明抗體

將二亞甲基雙氧安非他明蛋白—膠體金稀釋成od15、od35、od45、od55、od65濃度，用噴金機(jī)以0.5μl/cm、1.0μl/cm、1.5μl/cm固定于聚酯膜上，37℃干燥4小時(shí)，8小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)，36小時(shí)。用企業(yè)內(nèi)部質(zhì)控品，檢測結(jié)果如下：

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可得到本發(fā)明在以下制備條件時(shí)，對(duì)500ng/ml二亞甲基雙氧安非他明的檢測靈敏度最好，底板最清晰：37℃條件下干燥4-24小時(shí)，膠體金包被濃度為od45(可選范圍：od35-od55)，包被量1.0ul/cm(可選范圍0.5-1.5μl/cm)。

2.亞甲基雙氧安非他明抗原，檢測線(t線)參數(shù)的設(shè)定包被量的設(shè)定：

二亞甲基雙氧安非他明

將二亞甲基雙氧安非他明抗原稀釋成0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml，用點(diǎn)膜機(jī)按1.0μl/cm包被于硝酸纖維素膜上，置于45℃條件下烘干12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)。

用上述材料和od45二亞甲基雙氧安非他明蛋白-膠體金組裝成卡型。用企業(yè)內(nèi)部質(zhì)控品，檢測結(jié)果如下：

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可得到本發(fā)明在以下制備條件時(shí)，對(duì)500ng/ml二亞甲基雙氧安非他明的檢測靈敏度最好，底板最清晰：二亞甲基雙氧安非他明抗原的濃度0.4mg/ml(可選范圍0.3～0.5mg/ml)，包被量1.0ul/cm(可選范圍0.8μl/cm～1.2μl/cm)，45℃條件24小時(shí)。

3.羊抗兔多克隆抗體

包被量的設(shè)定實(shí)驗(yàn)

將羊抗兔多克隆抗體，以1.0mg/ml的包被濃度，用點(diǎn)膜機(jī)按0.8μl/cm、1.0μl/cm、1.2μl/cm、1.4μl/cm包被到硝酸纖維素膜質(zhì)控區(qū)(c線)，置于45℃條件下烘干24小時(shí)，用陰性參考品進(jìn)行檢測。

包被量設(shè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

包被濃度和干燥參數(shù)設(shè)定實(shí)驗(yàn)：

將c線抗體，稀釋成0.3mg/ml、0.6mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、用點(diǎn)膜機(jī)按1.0μl/cm包被于硝酸纖維素膜質(zhì)控區(qū)(c線)，將濃度為0.4mg/ml的二亞甲基雙氧安非他明抗原包被于硝酸纖維素膜的測試區(qū)(t線)，置于45℃條件下干燥4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)。將上述包被有c、t線的硝酸纖維素膜和膠體金濃度為od40組裝成卡型。

包被濃度和干燥參數(shù)設(shè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

用企業(yè)內(nèi)部質(zhì)控品，c線檢測結(jié)果如下表：

由結(jié)果可見，選擇羊抗兔多克隆抗體的濃度為1.0mg/ml(可選范圍：0.6～1.0mg/ml)，37℃干燥時(shí)間4～24小時(shí)，包被量1.0ul/cm(可選范圍：0.8μl/cm～1.2μl/cm)，即可保證質(zhì)控線條帶清晰美觀、底板清晰。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。