本發(fā)明涉及一種基于均相免疫反應(yīng)和磁分離技術(shù)的黃曲霉毒素b1一體化快速檢測(cè)裝置和檢測(cè)策略，屬于免疫檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和科學(xué)技術(shù)水平的提高，人類對(duì)身體健康和安全愈來愈重視。目前許多消費(fèi)者身體處于亞健康狀態(tài)，這一現(xiàn)狀食品和環(huán)境的安全程度有著直接或間接的聯(lián)系。更為嚴(yán)重的是，部分食品和環(huán)境有毒有害物質(zhì)還可能誘發(fā)血液病和癌癥等惡性疾病，對(duì)消費(fèi)者生命安全造成威脅。黃曲霉毒素b1是主要由黃曲霉菌和寄生曲霉產(chǎn)生的極毒的次生代謝產(chǎn)物，主要存在于糧油和動(dòng)植物食品中，花生和玉米污染最為嚴(yán)重，在高溫高濕地區(qū)的糧油及制品中具有很高的檢出率。黃曲霉毒素b1是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)且阎幕瘜W(xué)物質(zhì)中致癌性最強(qiáng)的一種。其致癌能力為二甲基亞硝胺的75倍，比二甲基偶氨苯高900倍。對(duì)人和動(dòng)物具有強(qiáng)烈的毒性，其毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，慢性毒性可誘發(fā)癌變，主要是對(duì)肝臟的損害。在天然食物中以黃曲霉毒素b1最為多見，危害性也最強(qiáng)，國家質(zhì)檢總局規(guī)定黃曲霉毒素b1是大部分食品的必檢項(xiàng)目之一。我國對(duì)玉米、花生、花生油中黃曲霉毒素b1的限量為20ng/g。歐盟等國對(duì)糧食、花生及其產(chǎn)品中人類直接使用的花生中黃曲霉毒素b1限量為2ng/g，作為食品原料進(jìn)口的花生中限量為8ng/g。目前對(duì)于黃曲霉毒素b1的檢測(cè)方法主要是薄層色譜法、液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等儀器分析方法和常規(guī)酶聯(lián)吸附免疫分析方法(elisa)。儀器分析方法靈敏度高，但是儀器昂貴、樣品前處理復(fù)雜、耗時(shí)、需要專業(yè)人員操作，難以滿足大量樣品快速簡(jiǎn)便檢測(cè)的需要。相比于儀器方法，免疫分析方法則具有成本低、操作簡(jiǎn)便、特異性高、高通量等優(yōu)點(diǎn)，更適用于大量樣品的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)監(jiān)測(cè)。然而，elisa方法仍需要繁瑣的分離和洗滌步驟，使得檢測(cè)時(shí)間仍較長(zhǎng)，更為簡(jiǎn)便快捷的檢測(cè)方法研發(fā)是免疫分析檢測(cè)當(dāng)前的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。為了使免疫檢測(cè)的流程更加簡(jiǎn)單，操作更加簡(jiǎn)便，本發(fā)明采用新型一體化快速檢測(cè)裝置，通過抗原抗體特異性結(jié)合、均相反應(yīng)、磁分離等策略，將極大地簡(jiǎn)化常規(guī)elisa方法的檢測(cè)步驟，使得檢測(cè)更為簡(jiǎn)便快捷。本發(fā)明將實(shí)現(xiàn)黃曲霉毒素b1的簡(jiǎn)便快捷、高靈敏度、一體化定量檢測(cè)，該檢測(cè)裝置和檢測(cè)策略的發(fā)展對(duì)于免疫分析技術(shù)具有重要的推動(dòng)和現(xiàn)實(shí)意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種新型一體化免疫快速檢測(cè)裝置和檢測(cè)策略，實(shí)現(xiàn)黃曲霉毒素b1的均相磁分離免疫分析檢測(cè)，極大地簡(jiǎn)化檢測(cè)程序和提高檢測(cè)效率，為食品和環(huán)境樣品中有毒有害物質(zhì)快速檢測(cè)提供新技術(shù)和新思路。本發(fā)明的技術(shù)方案：本發(fā)明主要包括檢測(cè)裝置制備、檢測(cè)策略和檢測(cè)程序三方面，技術(shù)方案如下：一種黃曲霉毒素b1免疫快速檢測(cè)裝置，所述黃曲霉毒素b1免疫快速檢測(cè)裝置包括樣品室、洗滌室和檢測(cè)室，作為三個(gè)功能區(qū)，所述樣品室、洗滌室和檢測(cè)室均設(shè)有一個(gè)蓋板，用于加樣和取樣；所述樣品室與洗滌室之間、洗滌室與檢測(cè)室之間均通過孔道相連通，所述孔道處均設(shè)有玻璃插板，實(shí)現(xiàn)相鄰功能區(qū)之間的隔離，互不干擾。進(jìn)一步，所述樣品室、洗滌室和檢測(cè)室均為梭形。進(jìn)一步，所述樣品室、洗滌室和檢測(cè)室尺寸均為(40-80)mm×(8-20)mm×(6-20)mm。所述樣品室、洗滌室和檢測(cè)室的有效容積均為300-500μl。所述孔道尺寸為1.5-3mm。所述玻璃插板的尺寸均為(1-2)mm×(0.5-1.5)mm×(5-15)。所述黃曲霉毒素b1免疫快速檢測(cè)裝置的材質(zhì)為聚二甲基硅氧烷(pdms)。所述黃曲霉毒素b1免疫快速檢測(cè)裝置的模具是由鍍鉻青銅制成。所述黃曲霉毒素b1免疫快速檢測(cè)裝置的制作方法如下：將聚二甲基硅氧烷預(yù)聚物倒入模具，70-80℃靜置40-70min，冷卻獲得所述黃曲霉毒素b1免疫快速檢測(cè)裝置。檢測(cè)原理由樣品室、洗滌室和檢測(cè)室這三個(gè)功能區(qū)構(gòu)成的一體化檢測(cè)裝置為簡(jiǎn)便快捷的免疫檢測(cè)提供了基礎(chǔ)條件。在樣品室中抗原-磁性納米顆粒探針、抗體-hrp探針、目標(biāo)分析物三者間進(jìn)行抗原抗體特異性免疫反應(yīng)，形成磁性納米顆粒-抗原-抗體-hrp復(fù)合物；通過磁分離和轉(zhuǎn)移，將復(fù)合物轉(zhuǎn)移至洗滌室進(jìn)行洗滌，將復(fù)合物轉(zhuǎn)移至檢測(cè)室進(jìn)行顯色和讀數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)品/待檢測(cè)溶液中的目標(biāo)分析物濃度，與復(fù)合物濃度成反比例關(guān)系，隨著目標(biāo)分析物濃度降低，顯色程度逐漸加深(如圖1)。利用所述黃曲霉毒素b1免疫快速檢測(cè)裝置檢測(cè)黃曲霉毒素b1的檢測(cè)方法，步驟如下：步驟1、制備功能化探針將30-100mg商品化fe3o4磁性納米顆粒(平均粒徑為50-100nm)加入3-10ml無水乙醇中，室溫超聲10-15min獲得均勻懸浮液，加入20-50μl3-氨丙基三乙基硅烷(aptes)室溫?cái)嚢?-8h，分離獲得氨基化磁性納米顆粒；通過碳二亞胺法將氨基化磁性納米顆粒和黃曲霉毒素b1抗原(黃曲霉毒素b1半抗原與雞卵清蛋白偶聯(lián)物)偶聯(lián)，純化獲得抗原-磁性納米顆粒探針；通過過碘酸鈉法將黃曲霉毒素b1單克隆抗體和辣根過氧化物酶(hrp)偶聯(lián)，純化獲得抗體-hrp探針；將抗原-磁性納米顆粒探針和抗體-hrp探針分別保存在含1％bsa和0.1％疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖溶液(pbs，0.01mol/l)中備用；步驟2、均相免疫反應(yīng)和磁分離(1)在樣品室中加入25-50μl抗原-磁性納米顆粒探針溶液、25-50μl各濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品/待檢測(cè)溶液、50-100μl抗體-hrp探針溶液，樣品室中反應(yīng)溶液為0.01mol/lpbs緩沖溶液，將檢測(cè)裝置在渦旋混合器上混合1-2min，進(jìn)行均相免疫反應(yīng)，形成磁性納米顆粒-抗原-抗體-hrp復(fù)合物，在磁場(chǎng)作用下，復(fù)合物從均相溶液中分離出來；(2)傾斜檢測(cè)裝置，磁場(chǎng)作用力將磁性納米顆粒-抗原-抗體-hrp復(fù)合物從樣品室轉(zhuǎn)移到洗滌室，通過玻璃插板密封各功能區(qū)，在洗滌室中加入250-500μl洗滌液，所述洗滌液含0.05％吐溫-20的0.01mol/lpbs緩沖溶液，渦旋混合1-2min，進(jìn)行洗滌，重復(fù)洗滌2-3次，在磁場(chǎng)作用下，復(fù)合物從洗滌液中分離出來；(3)傾斜檢測(cè)裝置，磁場(chǎng)作用力將洗滌后的復(fù)合物從洗滌室轉(zhuǎn)移到檢測(cè)室，通過玻璃插板密封各功能區(qū)；步驟3、顯色和讀數(shù)(1)在檢測(cè)室中加入100-200μltmb顯色液，所述顯色液含0.4mmol/ltmb和3mmol/lh2o2的檸檬酸緩沖溶液，ph5.0，渦旋混合1-2min，顯色液呈現(xiàn)藍(lán)色程度與待檢測(cè)黃曲霉毒素b1溶度成反比例關(guān)系；(2)用50-100μl2mol/lh2so4終止顯色，測(cè)定450nm吸光值；(3)通過對(duì)系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品檢測(cè)，建立檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)未知樣品進(jìn)行定量。有益效果：本發(fā)明根據(jù)黃曲霉毒素b1檢測(cè)的需求和當(dāng)前免疫檢測(cè)仍需較為復(fù)雜的分離洗滌步驟，在常規(guī)elisa基礎(chǔ)上對(duì)檢測(cè)模式進(jìn)行改進(jìn)，通過將三個(gè)獨(dú)立的功能區(qū)域組合，設(shè)計(jì)了一體化免疫快速檢測(cè)裝置，并通過均相磁分離技術(shù)在該裝置上實(shí)現(xiàn)了黃曲霉毒素b1的簡(jiǎn)便快速定量檢測(cè)。本發(fā)明涉及的一體化免疫快速檢測(cè)裝置和檢測(cè)策略，不僅可以應(yīng)用于黃曲霉毒素b1快速檢測(cè)，對(duì)于其它小分子有毒有害化合物免疫快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展同樣具有指導(dǎo)和參考價(jià)值，其推廣應(yīng)用對(duì)于保障食品和農(nóng)產(chǎn)品安全具有重要現(xiàn)實(shí)意義。附圖說明圖1檢測(cè)原理示意圖；圖2為本發(fā)明所述裝置的俯視示意圖；圖3為本發(fā)明所述裝置的前視示意圖；圖4為黃曲霉毒素b1檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施方式以下所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于更好地說明和解釋本發(fā)明，而決不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成限制。實(shí)施例：黃曲霉毒素b1一體化免疫快速檢測(cè)裝置設(shè)計(jì)及應(yīng)用1檢測(cè)裝置如圖2、3所示，以聚二甲基硅氧烷(pdms)為材料制作一體化檢測(cè)裝置。模具由青銅制成，拋光后鍍鉻。該檢測(cè)裝置有三個(gè)功能區(qū)，分別是樣品室、洗滌室和檢測(cè)室，尺寸為45×10×8mm3，有效容積為300μl/腔室。每個(gè)腔室都有一個(gè)蓋板，用于加樣和取樣；腔室之間通過1.5mm寬的孔相連，作為復(fù)合物在磁場(chǎng)下的通道；腔室之間通過1×0.6×7mm3的玻璃插板實(shí)現(xiàn)封閉隔離，使得各功能區(qū)間互不干擾。將pdms預(yù)聚物倒入模具，70℃靜置60min，冷卻獲得檢測(cè)裝置。2檢測(cè)程序2.1功能化探針制備將50mg商品化fe3o4磁性納米顆粒(平均粒徑為100nm)加入5ml無水乙醇中，室溫超聲10min獲得均勻懸浮液，加入30μl3-氨丙基三乙基硅烷(aptes)室溫?cái)嚢?h，分離獲得氨基化磁性納米顆粒。通過碳二亞胺法將氨基化磁性納米顆粒和黃曲霉毒素b1抗原(黃曲霉毒素b1半抗原與雞卵清蛋白偶聯(lián)物)偶聯(lián)，純化獲得抗原-磁性納米顆粒探針。通過過碘酸鈉法將黃曲霉毒素b1單克隆抗體和辣根過氧化物酶(hrp)偶聯(lián)，純化獲得抗體-hrp探針。將兩種功能化探針保存在含1％bsa和0.1％疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖溶液(pbs，0.01mol/l)中備用。2.2均相免疫反應(yīng)和磁分離(1)配置濃度為0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5ng/ml的黃曲霉毒素b1標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，稀釋液用10％甲醇的pbs緩沖溶液(na+濃度為0.4mol/l，ph7.4)；(2)在樣品室中加入25μl抗原-磁性納米顆粒探針溶液、25μl各濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品/待檢測(cè)溶液、50μl抗體-hrp探針溶液，樣品室中反應(yīng)溶液為0.01mol/lpbs緩沖溶液，將檢測(cè)裝置在渦旋混合器上混合1-2min，進(jìn)行均相免疫反應(yīng)，形成磁性納米顆粒-抗原-抗體-hrp復(fù)合物，在磁場(chǎng)作用下，復(fù)合物從均相溶液中分離出來；(3)傾斜檢測(cè)裝置，磁場(chǎng)作用力將復(fù)合物從樣品室轉(zhuǎn)移到洗滌室，通過插板密封各功能區(qū)，在洗滌室中加入250μl洗滌液(含0.05％吐溫-20的0.01mol/lpbs緩沖溶液)，渦旋混合1min，進(jìn)行洗滌，重復(fù)洗滌3次，在磁場(chǎng)作用下，復(fù)合物從洗滌液中分離出來；(4)傾斜檢測(cè)裝置，磁場(chǎng)作用力將洗滌后的復(fù)合物從洗滌室轉(zhuǎn)移到檢測(cè)室，通過插板密封各功能區(qū)。2.3顯色和讀數(shù)(1)在檢測(cè)室中加入100μltmb顯色液(含0.4mmol/ltmb和3mmol/lh2o2的檸檬酸緩沖溶液，ph5.0)，渦旋混合1min，顯色液呈現(xiàn)藍(lán)色程度與待檢測(cè)黃曲霉毒素b1溶度成反比例關(guān)系；(2)用50μl2mol/lh2so4終止顯色，測(cè)定450nm吸光值；(3)通過對(duì)系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品檢測(cè)，建立檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)未知樣品進(jìn)行定量。用origin7.0軟件對(duì)濃度和結(jié)合率(b/b0，％)進(jìn)行四參數(shù)擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖4)。結(jié)合率計(jì)算公式：式中：odmax為不加標(biāo)準(zhǔn)溶液或分析物時(shí)的吸光值，odx為標(biāo)準(zhǔn)溶液或分析物濃度為x時(shí)的吸光值，odmin為空白對(duì)照孔的吸光值。3靈敏度方法對(duì)于黃曲霉毒素b1檢測(cè)的抑制中濃度(ic50)為0.101ng/ml，最低檢測(cè)限(lod，ic10)為0.0142ng/ml，檢測(cè)范圍(ic10-ic90)為0.0142-0.725ng/ml；該檢測(cè)技術(shù)靈敏度能夠很好地滿足黃曲霉毒素b1檢測(cè)限量要求。4特異性通過交叉反應(yīng)率(cr％)來反映該方法的特異性。結(jié)果表明該方法對(duì)黃曲霉毒素b1的其它幾種結(jié)構(gòu)類似化合物具有不同程度的交叉反應(yīng)率(表1)。cr％＝[ic50(黃曲霉毒素b1)/ic50(結(jié)構(gòu)類似化合物)]×100表1特異性化合物cr％黃曲霉毒素b1100黃曲霉毒素b235.4黃曲霉毒素g125.4黃曲霉毒素g23.6黃曲霉毒素m118.2本發(fā)明的檢測(cè)原理如圖1所示。本發(fā)明公開了一種針對(duì)黃曲霉毒素b1的簡(jiǎn)單、快速、一體化免疫檢測(cè)裝置和檢測(cè)策略。該發(fā)明基于抗原-抗體特異性結(jié)合、均相反應(yīng)、磁分離等策略，對(duì)黃曲霉毒素b1進(jìn)行分析檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度能夠很好地滿足食品和農(nóng)業(yè)樣品中黃曲霉毒素b1污染檢測(cè)限量要求，均相磁分離技術(shù)的應(yīng)用使得檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)步驟比常規(guī)elisa獲得顯著優(yōu)化和改進(jìn)，是一種更加簡(jiǎn)便快捷的免疫分析策略。本發(fā)明公開的免疫檢測(cè)裝置和檢測(cè)策略，作為儀器分析方法的補(bǔ)充或替代方法，以及常規(guī)elisa方法的改進(jìn)，具有靈敏度高、簡(jiǎn)便快捷、一體化、無需大型儀器、檢測(cè)成本低等優(yōu)勢(shì)特征，其推廣應(yīng)用對(duì)于免疫快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展具有重要指導(dǎo)價(jià)值，對(duì)于保障食品和農(nóng)產(chǎn)品安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。當(dāng)前第1頁12