本發(fā)明涉及一種同時(shí)測(cè)定虎杖苷和白藜蘆醇含量測(cè)定方法的建立，屬于化學(xué)藥物分析
技術(shù)領(lǐng)域：
，其建立的方法應(yīng)用于虎杖提取工藝優(yōu)化結(jié)果成分分析，比較得出虎杖苷和白藜蘆醇含量的hplc測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
：虎杖是蓼科植物虎杖polygonumcuspidatumsieb.et.zucc.的干燥根莖及根，性微寒、味微苦，具利膽退黃、清熱解毒、散瘀止痛、化痰止咳等功效?；⒄群祯?、二苯乙烯類、酚類、黃酮類等多種成分，其中二苯乙烯類主要為白藜蘆醇和虎杖苷，蒽醌類主要以大黃素、大黃素甲醚為代表，也含有多種蒽醌苷?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2010年版僅以大黃素和虎杖苷作為虎杖含量測(cè)定的指標(biāo)物，而未涉及白藜蘆醇。然而白藜蘆醇在虎杖中含量相對(duì)較高，是一類有特殊的醫(yī)療保健功能、對(duì)人體健康有著顯著作用的多酚物質(zhì)。白藜蘆醇是一種極有前途的藥物中間體，對(duì)腫瘤具有化學(xué)預(yù)防作用，而且對(duì)癌細(xì)胞具有選擇性殺傷力；對(duì)治療心腦血管疾病有很好的療效，且毒副性很小，便于長(zhǎng)期服用。但如何通過(guò)虎杖苷和白藜蘆醇hplc檢測(cè)方法的建立，并采用所建立的方法對(duì)虎杖提取工藝優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行測(cè)定，是本領(lǐng)域技術(shù)人員急需解決的技術(shù)難題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種從虎杖中提取虎杖苷和白藜蘆醇的hplc檢測(cè)方法，并采用所建立的方法對(duì)虎杖提取工藝優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行測(cè)定，為虎杖資源全利用提供參考，并為其他基質(zhì)的虎杖苷和白藜蘆醇檢測(cè)提供參考。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：一種從虎杖中提取虎杖苷和白藜蘆醇的hplc檢測(cè)方法，高效液相色譜分析的條件包括：采用反相填料色譜柱；檢測(cè)波長(zhǎng)為306nm以及全波長(zhǎng)掃描，流速為0.8～1.2ml/min，進(jìn)樣量為2～20μl，柱溫為25～35℃，流動(dòng)相為乙腈-水、甲醇-0.1％甲酸水、乙腈-0.1％甲酸水、甲醇-水、甲醇-0.1％磷酸水、乙腈-0.1％磷酸水，等度洗脫。一種從虎杖中提取虎杖苷和白藜蘆醇的hplc檢測(cè)方法，高效液相色譜分析的條件為：采用phenomenex5μmevoc18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，采用波長(zhǎng)為306nm，流速為1.0ml/min，進(jìn)樣量為10μl，柱溫為25℃，分析時(shí)間為40min，流動(dòng)相為乙腈-水(23:77)，等度洗脫。一種從虎杖中提取虎杖苷和白藜蘆醇的hplc檢測(cè)方法，前處理方法考察對(duì)象有：提取溶劑(無(wú)水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、稀乙醇)；提取方法(超聲提取、加熱回流、冷浸)；提取固料比(1:10～1:100)；提取溶劑體積分?jǐn)?shù)(30％、50％、75％、95％、100％)；提取時(shí)間(30min、60min、90min)。一種從虎杖中提取白藜蘆醇的hplc檢測(cè)方法，前處理方法為：取虎杖藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50％乙醇20ml；密塞，加熱回流30分鐘，取出，放冷至室溫后，用甲醇補(bǔ)回失去的重量。過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)條件和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)，對(duì)虎杖纖維素酶酶解提取工藝進(jìn)行優(yōu)化包括：酶解液ph值、酶解溫度、酶解時(shí)間。根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)條件和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)，對(duì)虎杖纖維素酶酶解提取工藝最佳為：酶解液ph7.5、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間6小時(shí)。一種從虎杖中檢測(cè)白藜蘆醇含量的hplc測(cè)定方法，對(duì)虎杖纖維素酶酶解提取工藝優(yōu)化結(jié)果成分進(jìn)行測(cè)定。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：本發(fā)明提供一種實(shí)用性強(qiáng)、穩(wěn)定可靠、重現(xiàn)性好的同時(shí)測(cè)定虎杖苷和白藜蘆醇的hplc檢測(cè)方法，為虎杖工藝優(yōu)化結(jié)果成分虎杖苷和白藜蘆醇進(jìn)行測(cè)定，并通過(guò)提取工藝的考察，同時(shí)以虎杖苷、白藜蘆醇為指標(biāo)成分優(yōu)選最佳提取工藝。附圖說(shuō)明圖1a和1b分別為虎杖苷和白藜蘆醇的全波長(zhǎng)掃描圖譜；圖1c和1d分別為對(duì)照品(虎杖供試品色譜圖(306nm))和供試品溶液(虎杖供試品色譜圖)掃描圖譜(dad全波長(zhǎng)掃描)；圖2a、2b和2c分別為流動(dòng)相為乙腈-水的對(duì)照品(虎杖苷對(duì)照品圖譜(乙腈-水)、白藜蘆醇對(duì)照品圖譜(乙腈-水))和供試品(虎杖供試品溶液圖譜(乙腈-水))圖譜；圖3a和3b分別為虎杖苷和白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖4是不同進(jìn)樣量圖譜；圖5是不同柱溫考察圖譜；圖6是不同提取方法圖譜；圖7是固料比考察圖譜；圖8是不同體積分?jǐn)?shù)色譜圖；圖9是不同提取時(shí)間圖譜。具體實(shí)施方式本發(fā)明所用實(shí)驗(yàn)材料為由肇慶懷集基地提供的虎杖。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)對(duì)肇慶懷集所產(chǎn)虎杖藥材(批號(hào)：20140412)進(jìn)行分析和研究，建立專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好的同時(shí)測(cè)定虎杖苷和白藜蘆醇檢測(cè)方法，包括步驟：1)虎杖苷和白藜蘆醇hplc色譜分析方法建立；2)酶解提取工藝最優(yōu)化。纖維素酶酶解最佳條件為ph7.5、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間6小時(shí)。經(jīng)過(guò)酶解后，白藜蘆醇的含量提高了2.85倍。同時(shí)利用所建立的含量測(cè)定方法，對(duì)纖維素酶酶解工藝優(yōu)化進(jìn)行單因素考察，考察酶解溫度、酶解液ph值、酶解時(shí)間對(duì)虎杖活性成分(主要目標(biāo)產(chǎn)物是白藜蘆醇)得率的影響。通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的綜合分析，進(jìn)而得出各自較優(yōu)提取工藝，為虎杖的資源全利用提供參考。本發(fā)明所用儀器包括：高效液相色譜儀：thermoultimate3000高效液相色譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)：四元泵，二極管陣列檢測(cè)器(dad)，自動(dòng)進(jìn)樣器，chromelen色譜工作站。色譜柱：phenomenex5μmevoc18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，天平：千分之一天平(上海恒平j(luò)a2003)，萬(wàn)分之一天平(sartoriusbs224s)，十萬(wàn)分之一天平(precisaxr205smdr)；超純水系統(tǒng)(美國(guó)millipore(密理博)公司)。本發(fā)明所用試劑與試藥包括：甲醇、乙醇、甲酸、磷酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純；hplc用甲醇、乙腈均為色譜純(德國(guó)merck公司，darmstadt，gemany)；水為超純水(電阻率18.2mω.cm)。為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。實(shí)施例1一種從虎杖中提取虎杖苷和白藜蘆醇的hplc檢測(cè)方法，包括以下步驟：1、供試品溶液的制備1.1初步方法稱取虎杖粉末(過(guò)三號(hào)篩)1g，精密稱定，置于干燥具塞錐形瓶中。精密移取甲醇50ml，稱定重量，超聲處理30min。取出，放冷至室溫后，用甲醇補(bǔ)回失去的重量。過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品。1.2對(duì)不同檢測(cè)波長(zhǎng)的考察本實(shí)驗(yàn)考察了306nm以及全波長(zhǎng)掃描。色譜條件：色譜柱：phenomenex5μmevoc18(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫：25℃；流動(dòng)相：乙腈-水(23:77)。體積流量：1.000ml/min；進(jìn)樣量：10μl；如圖1a-1d所示，由全波長(zhǎng)掃描圖譜可見(jiàn)虎杖苷和白藜蘆醇在280nm～310nm之間有較大吸收。而在306nm的圖譜中，虎杖苷和白藜蘆醇的峰形狀較好，因此選擇306nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。1.3對(duì)不同流動(dòng)相的考察本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-0.1％甲酸水溶液、甲醇-0.1％甲酸水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-水溶液、甲醇-0.1％磷酸水溶液、乙腈-0.1％磷酸水溶液。色譜條件：色譜柱：phenomenex5μmevoc18(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫：25℃；流動(dòng)相：上述溶液；體積流量：1.000ml/min；進(jìn)樣量：10μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：306nm；實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲醇較乙腈的洗脫白藜蘆醇和虎杖苷的能力較差，因此有機(jī)相選擇乙腈。另外，只有乙腈-水系統(tǒng)較其他加酸的流動(dòng)相的理論塔板數(shù)和不對(duì)稱因子較好，且圖譜峰形較好。因此選用乙腈-水系統(tǒng)作為該實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相組成成分。如圖2a-2c所示，即選用乙腈-水溶液作為流動(dòng)相。1.4不同進(jìn)樣量的考察本實(shí)驗(yàn)考察了2μl、5μl、8μl、10μl、20μl不同進(jìn)樣量對(duì)虎杖樣品分離虎杖苷和白藜蘆醇的效果。色譜條件：色譜柱：phenomenex5μmevoc18(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫：25℃；流動(dòng)相：乙腈-水(23:77)溶液；體積流量：1.000ml/min；進(jìn)樣量：2、5、8、10、20μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：306nm；實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2μl和5μl相對(duì)8μl、10μl、20μl峰形好，且無(wú)裂峰。如圖4所示，2μl和5μl色譜圖相差不大，為了含量測(cè)定更準(zhǔn)確，因此選用5μl作為進(jìn)樣量。1.5不同色譜柱溫度的考察本實(shí)驗(yàn)考察了25℃、30℃、35℃不同柱溫對(duì)虎杖樣品分離虎杖苷和白藜蘆醇的效果。色譜條件：色譜柱：phenomenex5μmevoc18(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫：25、30、35℃；流動(dòng)相：乙腈-水(23:77)溶液；體積流量：1.000ml/min；進(jìn)樣量：5μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：306nm；實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同溫度對(duì)色譜圖影響不大，如圖5所示，為了保護(hù)高效液相儀，故選擇25℃為柱溫。1.6不同柱流速的考察本實(shí)驗(yàn)考察了0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min不同流速對(duì)分離虎杖樣品虎杖苷和白藜蘆醇的效果。色譜柱：phenomenex5μmevoc18(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫：25℃；流動(dòng)相：乙腈-水(23:77)溶液；體積流量：0.8、0.9、1.0、1.1、1.2ml/min；進(jìn)樣量：5μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：306nm；實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各流速的系統(tǒng)適應(yīng)性結(jié)果良好，差異不大，故選擇常用的1.0ml/min為流速。1.7確定的色譜條件色譜條件：色譜柱：phenomenex5μmevoc18(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫：25℃；流動(dòng)相：乙腈-水(23:77)溶液；體積流量：1.000ml/min；進(jìn)樣量：5μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：306nm；2、對(duì)虎杖苷和白藜蘆醇提取的方法的考察2.1提取方法的考察本實(shí)驗(yàn)考察超聲提取、加熱回流、冷浸的提取效率，如下表1所示。精密稱取虎杖粉末(過(guò)三號(hào)篩)6份，每份2g，精密稱定，置于干燥具塞錐形瓶中，精密移取甲醇25ml，稱定重量，分別超聲處理30min、加熱回流30min和冷浸提取12h。取出，放冷至室溫后，用甲醇補(bǔ)回失去的重量。過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品。表1不同提取方法考察結(jié)果提取方法虎杖苷平均含量(mg/g)白藜蘆醇平均含量(mg/g)總含量(mg/g)超聲16.201.5117.71加熱回流16.591.8318.42冷浸14.381.2915.66表1，圖6的結(jié)果顯示，加熱回流具有更加高的提取效率。2.2提取溶劑的考察本實(shí)驗(yàn)考察無(wú)水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、稀乙醇幾種不同溶劑的提取效率。如下表4所示。稱取虎杖粉末(過(guò)三號(hào)篩)2g，精密稱定，置于干燥具塞錐形瓶中。分別精密移取甲醇25ml、乙醇25ml、乙酸乙酯25ml以及稀乙醇25ml，稱定重量，加熱回流30min。取出，放冷至室溫后，用甲醇補(bǔ)回失去的重量。過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品。表2不同提取溶劑考察結(jié)果表2的結(jié)果顯示，乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)，虎杖苷相鄰有雜峰，故排除。甲醇、乙醇、稀乙醇作為提取溶劑時(shí)色譜圖相差不大，稀乙醇作為提取溶劑白藜蘆醇和虎杖苷的提取總含量最高。因此選擇稀乙醇作為提取溶劑。2.3提取固料比的考察本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取物料比，物料比如表5。表3不同提取提取固料比考察表稱取虎杖粉末，分別按表3物料比比例進(jìn)行精密稱定并精密移取稀乙醇，稱定重量，加熱回流30min。取出，放冷至室溫后，用稀乙醇補(bǔ)回失去的重量。過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品。表4不同固料比考察結(jié)果固料比(g/ml)虎杖苷平均含量(mg/g)白藜蘆醇平均含量(mg/g)總含量(mg/g)2-2017.262.0919.352-2519.002.0621.052-5022.572.0924.661-2022.082.0624.141-2522.342.0424.381-5022.572.0624.620.5-2023.272.0525.320.5-2523.052.0525.100.5-5022.972.0725.04實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如表4、圖7所示，不同物料比所得的色譜圖相差不大，1:40(g/ml)作為提取物料比白藜蘆醇和虎杖苷的提取量最高。因此選擇1:40(g/ml)作為物料比提取。2.4提取溶劑體積分?jǐn)?shù)的考察本研究考察了提取溶劑不同體積分?jǐn)?shù)，30％、50％、75％、95％、100％。稱取虎杖粉末(過(guò)三號(hào)篩)0.5g，精密稱定，置于干燥具塞錐形瓶中。分別精密移取不同體積分?jǐn)?shù)乙醇20ml，稱定重量，加熱回流30min。取出，放冷至室溫后，用相應(yīng)溶劑補(bǔ)回失去的重量。過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品。表5不同提取溶劑體積分?jǐn)?shù)考察結(jié)果提取溶劑(ml)虎杖苷平均含量(mg/g)白藜蘆醇平均含量(mg/g)總含量(mg/g)30％乙醇21.180.9922.171350％乙醇22.362.0824.433875％乙醇21.952.0423.997295％乙醇15.371.7717.1368100％乙醇16.561.9818.5423實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，如表5、圖8所示，各體積分?jǐn)?shù)所得色譜圖峰形差別不大，50％作為提取溶劑的體積分?jǐn)?shù)白藜蘆醇和虎杖苷的提取量最高。因此選擇50％作為提取溶劑的體積分?jǐn)?shù)。2.5提取時(shí)間的考察本研究考察了提取時(shí)間，30min、60min、90min的提取量。稱取虎杖粉末(過(guò)三號(hào)篩)0.5g，精密稱定，置于干燥具塞錐形瓶中。分別精密移取50％乙醇20ml，稱定重量，分別加熱回流30min、60min、90min。取出，放冷至室溫后，用50％補(bǔ)回失去的重量。過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品。表6不同提取時(shí)間考察結(jié)果提取時(shí)間(min)虎杖苷平均含量(mg/g)白藜蘆醇平均含量(mg/g)總含量(mg/g)3023.112.1925.30326020.631.8322.45639022.241.9424.1746實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，如表6、圖9所示，不同提取時(shí)間所得色譜圖差別不大，30min作為提取時(shí)間白藜蘆醇和虎杖苷的提取總含量最高。因此選擇30min作為提取時(shí)間。2.6供試品制備取虎杖藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50％乙醇20ml。密塞，加熱回流30分鐘，取出，放冷至室溫后，用甲醇補(bǔ)回失去的重量。過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品。根據(jù)以上確定的方法，對(duì)方法進(jìn)行方法學(xué)考察和對(duì)樣品進(jìn)行含量測(cè)定。3、方法學(xué)考察3.1系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)取適量供試品溶液和對(duì)照品溶液，按1.7項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應(yīng)性，結(jié)果如圖1所示，供試品色譜與對(duì)照品色譜在相同時(shí)間上有對(duì)應(yīng)的吸收峰，表明系統(tǒng)適應(yīng)性良好。3.2線性關(guān)系的考察取已知濃度的混合對(duì)照品溶液，加甲醇分別稀釋成不同濃度的溶液：①409.00μg·ml-1的虎杖苷；②204.50μg·ml-1的虎杖苷；③163.60μg·ml-1的虎杖苷；④81.80μg·ml-1的虎杖苷；⑤20.45μg·ml-1的虎杖苷；⑥16.36μg·ml-1的虎杖苷；⑦8.18μg·ml-1的虎杖苷；⑧4.09μg·ml-1的虎杖苷。①411.00μg·ml-1白藜蘆醇；②205.50μg·ml-1的白藜蘆醇；③164.40μg·ml-1的白藜蘆醇；④82.20μg·ml-1的白藜蘆醇；⑤20.55μg·ml-1的白藜蘆醇；⑥16.44μg·ml-1的白藜蘆醇；⑦8.22μg·ml-1的白藜蘆醇；⑧4.11μg·ml-1的白藜蘆醇。按1.7項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積，并以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得虎杖苷的回歸線方程為y＝220.89x-0.4549，(r2＝0.9996)；白藜蘆醇的回歸方程為y＝421.22x-0.7082(r2＝0.9997)圖3a-3b為線性關(guān)系圖譜，表明虎杖苷在濃度4.09μg·ml-1～409.00μg·ml-1范圍內(nèi)呈良好線性；白藜蘆醇在濃度4.11μg·ml-1～411.00μg·ml-1范圍內(nèi)呈良好線性。3.3重復(fù)性試驗(yàn)取虎杖粉末6份，按2.6項(xiàng)下的方法平行制備，結(jié)果如下表7所示。表7重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)得虎杖苷和白藜蘆醇含量的rsd分別為0.68％和1.24％，表明該方法重復(fù)性良好。3.4精密度試驗(yàn)精密吸取同一份供試品溶液5μl，按上述色譜條件重復(fù)連續(xù)進(jìn)樣6次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表8所示。表8精密度試驗(yàn)結(jié)果測(cè)得虎杖苷和白藜蘆醇峰面積rsd分別為0.71％和1.36％，表明精密度良好。3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一份供試品溶液5μl，按上述色譜條件分別于0、4、8、12、16、20、24h進(jìn)樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下表9所示。表9穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果測(cè)得虎杖苷和白藜蘆醇峰面積rsd分別為0.34％和1.43％，表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。3.6加樣回收試驗(yàn)取上述已知含量的虎杖6份，取約0.25g(已知虎杖苷含量21.77mg/g、白藜蘆醇含量1.98mg/g)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入分別加入虎杖苷和白藜蘆醇混合對(duì)照品溶液(虎杖苷5.512mg/ml、白藜蘆醇0.4745mg/ml)1ml，按2.6項(xiàng)制備供試品，按1.7項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果如下表10、11所示。表10虎杖苷加樣回收測(cè)定結(jié)表11白藜蘆醇加樣回收測(cè)定結(jié)果加樣回收試驗(yàn)證明，虎杖苷回收率為102.73％，白藜蘆醇回收率為99.45％，符合回收率95％-105％的范圍，表明該方法穩(wěn)定可靠。,一種同時(shí)測(cè)定虎杖苷和白藜蘆醇hplc檢測(cè)方法的建立，該方法穩(wěn)定可靠，適用性強(qiáng)。其中虎杖苷和白藜蘆醇對(duì)照品與供試品溶液圖譜見(jiàn)圖1a-1d，由圖可見(jiàn)，虎杖苷和白藜蘆醇對(duì)照品與供試品溶液在對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間都有吸收峰，且峰型較好。實(shí)施例21、一種同時(shí)測(cè)定虎杖苷和白藜蘆醇檢測(cè)方法在虎杖提取工藝優(yōu)化結(jié)果成分分析的應(yīng)用：1.1虎杖提取工藝優(yōu)化的供試品溶液制備：根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用，本部分研究所使用的試劑為生產(chǎn)中常用的乙醇作為工藝研究試劑?？疾煲蛩厝绫?2。表12酶解法單因素考察表名稱酶解溫度(℃)酶解時(shí)間(h)ph值13514.524035.034565.545096.0555246.5660487.077.588.0稱取虎杖藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.5g，精密稱定，置于干燥具塞錐形瓶中。分別精密移取酶溶液25ml，調(diào)整為不同的ph，不同的酶解溫度，一定的酶解時(shí)間。酶解后，100℃水浴，滅酶活。精密加入無(wú)水乙醇50ml，加熱回流30min。取出，放冷至室溫后，過(guò)濾，蒸干，殘?jiān)?0％乙醇溶解并定容至25ml容量瓶，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。1.2一種同時(shí)測(cè)定虎杖苷和白藜蘆醇檢測(cè)方法的應(yīng)用白藜蘆醇檢測(cè)的色譜條件(參考本發(fā)明建立的同時(shí)測(cè)定虎杖苷個(gè)白藜蘆醇檢測(cè)方法)1.3一種同時(shí)測(cè)定虎杖苷和白藜蘆醇檢測(cè)方法應(yīng)用的結(jié)果分析對(duì)最優(yōu)提取工藝的成分進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖6，表13。由圖6可見(jiàn)，該工藝優(yōu)化后，白藜蘆醇的峰吸收相應(yīng)增加，且峰型較好。表13酶解溫度優(yōu)化結(jié)果表14酶解時(shí)間優(yōu)化結(jié)果酶解時(shí)間(h)虎杖苷平均含量(mg/g)白藜蘆醇平均含量(mg/g)總含量(mg/g)133.945.1939.13331.036.6437.67626.148.9635.10表15不同ph值考察結(jié)果ph值虎杖苷平均含量(mg/g)白藜蘆醇平均含量(mg/g)總含量(mg/g)4.535.593.9139.515.035.283.9439.235.534.113.8938.006.034.333.8838.216.532.084.6536.737.031.424.8336.267.530.915.6536.568.030.245.5835.82由結(jié)果可知，酶解溫度在40℃時(shí)，白藜蘆醇提取量相對(duì)其他酶解溫度偏低，其原因是配制酶解溫度為40℃的供試品時(shí)，雖均按照加酶量為1.5mg/g原則，但仍在稱取纖維素酶量有偏差，酶解溫度在55℃時(shí)白藜蘆醇提取量達(dá)到最大，55℃之后，酶蛋白開(kāi)始變性，酶活性下降，白藜蘆醇提取量呈下降趨勢(shì)?？沙醪酱_定本工藝最佳酶解溫度為55℃。在酶解時(shí)間6h內(nèi)，白藜蘆醇提取量一直呈現(xiàn)出直線上升趨勢(shì)，在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，6h為最佳酶解時(shí)間。酶解ph在4.5-6區(qū)間，對(duì)纖維素酶的活性沒(méi)有較大影響，白藜蘆醇的提取量差異不大。ph在6-7.5時(shí)，隨著ph值增大，白藜蘆醇的提取量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。ph＝7.5時(shí)，白藜蘆醇的提取量達(dá)到最大值5.6533mg/g(比原來(lái)1.9783mg/g提高了2.85倍)。在ph＞7.5后，白藜蘆醇提取量呈下降趨勢(shì)?？沙醪酱_定本工藝最佳酶解ph值為7.5?；⒄茸罴烟崛」に嚕杀硎鋈缦拢悍Q取虎杖藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.5g，精密稱定，置于干燥具塞錐形瓶中，精密移取酶溶液25ml，ph為7.5，在55℃條件下進(jìn)行酶解6小時(shí)。酶解后，100℃水浴，滅酶活。精密加入無(wú)水乙醇50ml，加熱回流30min。取出，放冷至室溫后，過(guò)濾，蒸干，殘?jiān)?0％乙醇溶解并定容至25ml容量瓶，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。本發(fā)明建立了同時(shí)測(cè)定白藜蘆醇的hplc檢測(cè)方法，用于提取工藝優(yōu)化后虎杖苷和白藜蘆醇的測(cè)定，該工藝穩(wěn)定可靠，操作簡(jiǎn)便省時(shí)，能耗較低，為虎杖工藝研究提供參考。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，故凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾,均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12