本申請屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種血吸蟲病快速診斷試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)：

血吸蟲病是世界上分布最廣泛的人畜共患寄生蟲病之一，其易感動物包括人、牛、羊等家畜及野生動物，涉及40多種哺乳動物。家畜感染血吸蟲不僅給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成重大損失，更為重要的是，患病家畜還是人體血吸蟲病最主要的傳染源，其嚴(yán)重危害著人類健康并直接影響著全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展。在我國，血吸蟲病雖然得到了一定的控制，但其仍然是一個重要的公共衛(wèi)生問題。目前，血吸蟲病的診斷仍然是血吸蟲病防治工作的關(guān)鍵，它是尋找并確定指示血吸蟲在機(jī)體存在的直接或間接證據(jù)，為血吸蟲感染的臨床診斷提供依據(jù)。

血吸蟲病傳統(tǒng)的檢測方法為糞檢等病原學(xué)檢測，但該方法在中度或低度血吸蟲病流行區(qū)域的敏感性并不令人滿意，且費時、費力、漏檢率較高，而且不能對該病進(jìn)行早期診斷。為了解決這一問題，至今逾半個世紀(jì)研究者們一直致力于免疫學(xué)診斷方法的研制，目前免疫學(xué)診斷已被廣泛用于血吸蟲病的篩查及監(jiān)測，并成為血防工作的主要手段，常用的方法主要包括環(huán)卵沉淀實驗(copt)，酶聯(lián)免疫吸附實驗(elisa)、間接血凝實驗(iha)等，但由于這些方法均有一定的缺陷，靈敏度仍不夠高，操作復(fù)雜費時，且需要昂貴的儀器及技術(shù)熟練的分析人員，嚴(yán)重阻礙了其在現(xiàn)場大規(guī)模篩查中的應(yīng)用，不能完全適應(yīng)目前血吸蟲病防治工作的需要。本發(fā)明申請人經(jīng)過長期研究和實踐證明，在應(yīng)用已有免疫學(xué)診斷技術(shù)的基礎(chǔ)上，發(fā)展一種新穎、快速、簡便、適合于基層的能診斷多種動物血吸蟲病的免疫學(xué)診斷方法，以適用于現(xiàn)場大規(guī)模篩查家畜血吸蟲病。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本申請所要解決的技術(shù)問題是提供了一種血吸蟲病快速診斷試劑盒及其制備方法，以適用于廣大基層疫區(qū)血吸蟲病的篩查及監(jiān)測。

為了解決上述技術(shù)問題，本申請公開了一種血吸蟲病快速診斷試劑盒及其制備方法。本申請的血吸蟲病快速診斷試劑盒包括：盒體、pvc底板、樣品吸收墊、金標(biāo)墊、nc膜、吸收墊、檢測線和控制線；所述pvc底板固設(shè)在所述盒體上，所述樣品吸收墊、金標(biāo)墊、nc膜和吸收墊水平方向順序相接并固定在所述pvc底板上；所述檢測線和控制線設(shè)置在所述nc膜上；盒體盒面上對應(yīng)于樣品吸收墊的位置設(shè)置有加樣孔，盒體盒面上對應(yīng)于nc膜的位置設(shè)置有觀察窗口。

如上所述的試劑盒，其中，該試劑盒是由血吸蟲可溶性蟲卵抗原和血吸蟲可溶性蟲卵抗原包被硝酸纖維膜作為質(zhì)量控制線和檢測線，用膠體金標(biāo)記血吸蟲可溶性蟲卵抗原，利用雙抗原夾心法制成。

本申請?zhí)峁┑难x病快速診斷試劑盒的制備方法包括下列步驟：

(1)樣品吸收墊的制備：

將濃度為0.5mg/ml-1mg/ml的植物凝集素或抗人紅細(xì)胞抗體緩沖溶液處理包被載體，低溫凍干，裁切成長條備用；

(2)膠體金溶液的制備：

采用檸檬酸鈉還原法制備40nm的膠體金；

(3)可溶性血吸蟲蟲卵抗原的制備：

將可溶性血吸蟲蟲卵抗原研磨后，加入0.85％的生理鹽水溶液中，置于-20℃冷凍過夜，白天溶解，如此反復(fù)凍融5-10次后置于碎冰塊中，用超聲波破碎3min，反復(fù)破碎10次，12000rpm高速離心30min，取上清液即為可溶性血吸蟲蟲卵抗原；

(4)膠體金標(biāo)記血吸蟲可溶性蟲卵抗原的緩沖液體系及標(biāo)記過程：

待膠體金冷卻后，用0.1-0.5m的碳酸鉀調(diào)節(jié)ph至值7.0-8.0；并取1ml用tris-hci緩沖液稀釋至60-100ug/ml的血吸蟲可溶性蟲卵抗原在磁力攪拌下逐滴加入調(diào)好ph值的10ml膠體金溶液中，攪拌5-20min后加入穩(wěn)定劑，繼續(xù)攪拌5-20min，12000rpm,4℃離心5-30min，棄上清，用穩(wěn)定劑重懸沉淀，同上法重復(fù)洗離3次后重懸至2ml，加10％的nan3,終濃度為0.2％，后于4℃保存；

(5)金標(biāo)墊的制備：

將玻璃纖維用均漿劑浸泡片刻，20-40℃干燥30min；將血吸蟲可溶性蟲卵抗原—膠體金探針以5-20ul/cm²噴于玻璃纖維上，低溫凍干；

(6)nc膜的包被：

用ph7.0-7.5的0.01-0.1mtris-hcl溶液稀釋血吸蟲或可溶性蟲卵抗原、抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原抗體，分別以1ul/cm²噴膜，20-40℃干燥，用含1-5％脫脂奶粉的封閉液封閉30min，用0.01-0.1mtris-hcl洗脫液漂洗，20-40℃烘干30min，密封后裝入含干燥劑的鋁箔袋中密封，4-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(7)硝酸纖維素膜設(shè)置檢測線和控制線：

用包被機(jī)將吸入到檢測線注射泵中的1mg/ml可溶性血吸蟲蟲卵抗原和吸入到控制線注射泵中的1mg/ml的igg包被到硝酸纖維素膜上分別形成檢測線和控制線，于37℃干燥過夜備用；

(8)試劑盒的組裝：

將pvc底板固設(shè)在所述盒體的底面上，所述盒體的頂面上設(shè)置有加樣孔和觀察窗口；

將制備好的樣品吸收墊、金標(biāo)墊、包被好的nc膜和吸收墊依次水平方向順序相接并固定在所述pvc底板上，使得樣品吸收墊的位置與盒體盒面上的加樣孔相對應(yīng)，nc膜的位置與盒體盒面上的觀察窗口相對應(yīng)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1、靈敏度高，特異性及重現(xiàn)性好；

2、操作簡便快捷，不需要特殊儀器、設(shè)備，不需要專業(yè)培訓(xùn)即可操作，特別適于廣大基層疫區(qū)血吸蟲病的篩查及監(jiān)測；

3、結(jié)果判定直觀、準(zhǔn)確、可靠；

4、制備成本低，適于規(guī)模化生產(chǎn)。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本申請的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請的一部分，本申請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構(gòu)成對本申請的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是本申請實施例的血吸蟲病快速診斷試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是本申請實施例的血吸蟲病快速診斷試劑盒的制備方法的流程圖。

具體實施方式

以下將配合附圖及實施例來詳細(xì)說明本申請的實施方式，藉此對本申請如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。

圖1是本申請實施例的血吸蟲病快速診斷試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。如圖1示，本實施例的血吸蟲病快速診斷試劑盒包括：盒體101、pvc底板102、樣品吸收墊103、金標(biāo)墊104、nc膜105、吸收墊106、檢測線107和控制線108；所述pvc底板102固設(shè)在所述盒體101上，所述樣品吸收墊103、金標(biāo)墊104、nc膜105和吸收墊106水平方向順序相接并固定在所述pvc底板102上；所述檢測線107和控制線108設(shè)置在所述nc膜105上；盒體101盒面上對應(yīng)于樣品吸收墊103的位置設(shè)置有加樣孔109，盒體101盒面上對應(yīng)于nc膜105的位置設(shè)置有觀察窗口110。

如上所述的血吸蟲病快速診斷試劑盒，其中，所述試劑盒是由血吸蟲可溶性蟲卵抗原和血吸蟲可溶性蟲卵抗原包被硝酸纖維膜作為質(zhì)量控制線和檢測線，用膠體金標(biāo)記血吸蟲可溶性蟲卵抗原，利用雙抗原夾心法制成。

圖2是本申請實施例的血吸蟲病快速診斷試劑盒的制備方法的流程圖。如圖2所示，該方法包括下列步驟：

s101：樣品吸收墊的制備。

具體的，將濃度為0.5mg/ml-1mg/ml的植物凝集素或抗人紅細(xì)胞抗體緩沖溶液處理包被載體，低溫凍干，裁切成長條備用。

s102：膠體金溶液的制備。

具體的，采用檸檬酸鈉還原法制備40nm的膠體金。

s103：可溶性血吸蟲蟲卵抗原的制備。

具體的，將可溶性血吸蟲蟲卵抗原加入0.85％的生理鹽水溶液中，置于-20℃冷凍過夜，白天溶解，如此反復(fù)凍融5-10次后置于碎冰塊中，用超聲波破碎3min，反復(fù)破碎10次，12000rpm高速離心30min，取上清液即為可溶性血吸蟲蟲卵抗原。

s104：膠體金標(biāo)記血吸蟲可溶性蟲卵抗原的緩沖液體系及標(biāo)記過程。

具體的，待膠體金冷卻后，用0.1-0.5m的碳酸鉀調(diào)節(jié)ph至值7.0-8.0；并取1ml用tris-hcl緩沖液稀釋至60-100ug/ml的血吸蟲可溶性蟲卵抗原在磁力攪拌下逐滴加入調(diào)好ph值的10ml膠體金溶液中，攪拌5-20min后加入穩(wěn)定劑，繼續(xù)攪拌5-20min，12000rpm,4℃離心5-30min，棄上清，用穩(wěn)定劑重懸沉淀，同上法重復(fù)洗離3次后重懸至2ml，加10％的nan3,終濃度為0.2％，后于4℃保存。

s105：金標(biāo)墊的制備。

具體的，將玻璃纖維用均漿劑浸泡片刻，20-40℃干燥30min；將血吸蟲可溶性蟲卵抗原—膠體金探針以5-20ul/cm²噴于玻璃纖維上，低溫凍干。

s106：nc膜的包被。

具體的，用ph7.0-7.5的0.01-0.1mtris-hcl溶液稀釋血吸蟲或可溶性蟲卵抗原、抗血吸蟲可溶性蟲卵抗原抗體，分別以1ul/cm²噴膜，20-40℃干燥，用含1-5％脫脂奶粉的封閉液封閉30min，用0.01-0.1mtris-hcl洗脫液漂洗，20-40℃烘干30min，密封后裝入含干燥劑的鋁箔袋中密封，4-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

s107：硝酸纖維素膜設(shè)置檢測線和控制線。

具體的，用包被機(jī)將吸入到檢測線注射泵中的1mg/ml可溶性血吸蟲蟲卵抗原和吸入到控制線注射泵中的1mg/ml的igg包被到硝酸纖維素膜上分別形成檢測線和控制線，于37℃干燥過夜備用。

s108：試劑盒的組裝。

具體的，將pvc底板102固設(shè)在所述盒體101的底面上，所述盒體101的頂面上設(shè)置有加樣孔109和觀察窗口110；將制備好的樣品吸收墊103、金標(biāo)墊104、包被好的nc膜105和吸收墊106依次水平方向順序相接并固定在所述pvc底板102上，使得樣品吸收墊103的位置與盒體101盒面上的加樣孔109相對應(yīng)，nc膜105的位置與盒體101盒面上的觀察窗口110相對應(yīng)。

綜上所述，本申請?zhí)峁┑难x病快速診斷試劑盒試劑盒包括：盒體、pvc底板、樣品吸收墊、金標(biāo)墊、nc膜、吸收墊、檢測線和控制線；pvc底板固設(shè)在盒體上，樣品吸收墊、金標(biāo)墊、nc膜和吸收墊水平方向順序相接并固定在pvc底板上；檢測線和控制線設(shè)置在nc膜上；盒體盒面上對應(yīng)于樣品吸收墊的位置設(shè)置有加樣孔，盒體盒面上對應(yīng)于nc膜的位置設(shè)置有觀察窗口。本申請?zhí)峁┑难x病快速診斷試劑盒靈敏度高，特異性及重現(xiàn)性好，且操作簡便快捷，特別適于疫區(qū)血吸蟲病的篩查及監(jiān)測。另外，本申請?zhí)峁┑难x病快速診斷試劑盒還具有制備成本低，適于規(guī)?；a(chǎn)的特點。

上述說明示出并描述了本申請的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解本申請并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改，并能夠在本申請構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進(jìn)行改動。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動和變化不脫離本申請的精神和范圍，則都應(yīng)在本申請所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。