本發(fā)明涉及一種用于磷酸肽富集和分離的離心式裝置，屬于分析化學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

磷酸化是蛋白質(zhì)最常見(jiàn)的翻譯后修飾之一，是指由蛋白激酶催化在底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基上添加共價(jià)結(jié)合的磷酸根基團(tuán)。其逆反應(yīng)為由蛋白磷酸酶催化的去磷酸化過(guò)程。蛋白激酶和磷酸酶獨(dú)立工作，并在平衡中調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能。有研究表明，在由基因編碼的蛋白中，約30％會(huì)發(fā)生磷酸化。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化這一可逆過(guò)程幾乎調(diào)節(jié)著生命活動(dòng)的所有過(guò)程，包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化，分子識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)，神經(jīng)活動(dòng)，肌肉收縮，新陳代謝，腫瘤發(fā)生等。蛋白質(zhì)磷酸化在1906年由洛克菲勒醫(yī)學(xué)研究所的phoebuslevene首次報(bào)道，他發(fā)現(xiàn)了磷酸化的卵黃蛋白。然而，直到1954年，蛋白質(zhì)的磷酸化過(guò)程才由burnett和kennedy報(bào)道發(fā)現(xiàn)。1955年fisher和krebs揭示了可逆的磷酸化過(guò)程在生物調(diào)節(jié)機(jī)制中的重要性，并因此獲得了諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。由于蛋白質(zhì)磷酸化具有十分廣泛而顯著的生理意義，因此關(guān)于磷酸化的研究成為蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域里重要的焦點(diǎn)之一。質(zhì)譜是目前蛋白質(zhì)組翻譯后修飾鑒定研究最有力的工具。然而目前以生物質(zhì)譜為主要研究手段的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究還面臨著一系列技術(shù)挑戰(zhàn)：磷酸化蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)含量極低，研究認(rèn)為，一般在某一特定的時(shí)間，磷酸化的蛋白質(zhì)相對(duì)于生物體的總體蛋白質(zhì)而言，含量?jī)H為2～3％；在質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)，大量的非磷酸化肽段會(huì)對(duì)磷酸化肽段的信號(hào)造成干擾和抑制；磷酸化肽段具有負(fù)電性，在質(zhì)譜分析常用的正離子模式下，離子化困難，信號(hào)會(huì)受到抑制。這些問(wèn)題都給磷酸化肽段的規(guī)?；b定帶來(lái)不小的困難。因而在對(duì)較復(fù)雜的樣本進(jìn)行質(zhì)譜分析前，先對(duì)磷酸化肽段進(jìn)行特異性的富集，提高其在樣本中的含量，并去除非磷酸肽的干擾，對(duì)于提高磷酸肽的分析靈敏度和鑒定規(guī)模就顯得尤為重要。目前常用的磷酸肽富集方法主要有金屬氧化物親和色譜(moac)、固相金屬離子親和色譜(imac)、離子交換色譜(sax/scx)等。金屬氧化物親和色譜的原理是利用過(guò)渡金屬氧化物與磷酸根的可逆結(jié)合選擇性富集磷酸化肽段，常用的金屬氧化物有二氧化鈦(tio2)、二氧化鋯(zro2)等。二氧化鈦因其富集效果好、成本較低而得到了廣泛應(yīng)用。但其依然存在一些問(wèn)題：(1)所需樣品起始量大，(2)實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，極為費(fèi)時(shí)費(fèi)力，(3)樣品分析通量有限，(4)富集鑒定結(jié)果的重現(xiàn)性較差。此外，由于目前使用的生物質(zhì)譜儀器在掃描速度方面的局限性，富集后的磷酸肽樣品一般需要經(jīng)過(guò)反相色譜分離為多個(gè)餾分，進(jìn)一步降低樣品的復(fù)雜程度后再進(jìn)行質(zhì)譜分析，從而可以有效提高磷酸肽的鑒定規(guī)模。然而目前廣泛采用的反相色譜柱式肽段分離模式，樣本損失較大，而且需要配合液相色譜儀器使用，樣品處理通量有限。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于磷酸肽富集和分離的離心式富集裝置，具有快速、操作簡(jiǎn)便、便于微量樣本分析和高通量的特點(diǎn)，可平行處理多個(gè)樣品。

本發(fā)明所提供的用于磷酸肽富集和分離的離心式富集裝置，包括富集槍頭、分離槍頭和餾分收集器；

所述富集槍頭內(nèi)填充有固相萃取膜片a和二氧化鈦填料，所述固相萃取膜片a上覆蓋有八烷基膜，所述固相萃取膜片a靠近所述富集槍頭的出液口；

所述分離槍頭內(nèi)填充有固相萃取膜片b和c18反相填料(十八烷基硅烷鍵合硅膠)，所述固相萃取膜片b上覆蓋有十八烷基膜，所述固相萃取膜片b靠近所述分離槍頭的出液口；

所述富集槍頭可設(shè)置于所述分離槍頭內(nèi)，即以串聯(lián)的方式配合；

所述富集槍頭和所述分離槍頭均可與所述餾分收集器配合。

上述的離心式富集裝置中，所述富集槍頭和所述分離槍頭均為移液器槍頭；

所述富集槍頭可采用10μl、200μl或1000μl等不同規(guī)格，優(yōu)選200μl規(guī)格的槍頭；

所述分離槍頭可采用10μl或200μl等不同規(guī)格，優(yōu)選10μl規(guī)格的槍頭。

上述的離心式富集裝置中，所述富集槍頭內(nèi)設(shè)置一層所述八烷基膜，每層所述八烷基膜的厚度為0.2mm～0.5mm；

所述二氧化鈦填料的用量可為1～10mg。

上述的離心式富集裝置中，所述分離槍頭內(nèi)設(shè)置3層所述十八烷基膜，每層所述十八烷基膜的厚度為2mm～3mm；

所述c18反相填料的用量可為1～10mg。

上述的離心式富集裝置中，所述固相萃取膜片a和所述固相萃取膜片b均可采用empore萃取膜片，其是以聚四氟乙烯(ptfe)纖維薄膜為骨架，纖維之間在有以反相硅膠為基質(zhì)或以聚苯乙烯-二乙烯苯(ps-dvb)為基質(zhì)的spe吸附劑顆粒。所述empore萃取膜片的大小尺寸有不同，厚度大約<1mm。

上述的離心式富集裝置中，所述富集槍頭和所述分離槍頭均通過(guò)適配器與所述餾分收集器配合，所述適配器可為一圓柱體，具體可采用上下內(nèi)徑不等的圓柱體。

上述的離心式富集裝置中，所述餾分收集器可為離心管，如ep管，可選用600μl、1500μl和2000μl等不同規(guī)格，優(yōu)選1500μl。

本發(fā)明離心式富集裝置可用于富集和分離磷酸肽，將所述富集槍頭和所述分離槍頭串聯(lián)，以離心方式進(jìn)行樣品的上樣、清洗、洗脫和分離，即在一個(gè)裝置中完成磷酸肽的富集和反相分離，從而將二者有機(jī)結(jié)合，不僅精簡(jiǎn)了實(shí)驗(yàn)步驟，減少了樣品損失，并降低了實(shí)驗(yàn)的勞動(dòng)強(qiáng)度；而且該離心式富集分離裝置可與臺(tái)式離心機(jī)配合使用，一次平行處理24個(gè)樣品，大大提高了樣本處理通量，非常適合應(yīng)用于大規(guī)模、微量臨床樣品的磷酸肽分析。

可按照下述步驟用于富集和分離磷酸肽：

(1)將含有磷酸肽的蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物加入至所述離心式富集裝置中的所述富集槍頭中，然后將所述富集槍頭與所述餾分收集器配合，將所述餾分收集器置于離心機(jī)中進(jìn)行離心分離，即將所述磷酸肽富集于所述二氧化鈦填料中；

(2)將所述富集槍頭設(shè)置于所述分離槍頭內(nèi)，然后將所述分離槍頭與所述餾分收集器配合，采用不同乙腈含量的堿性洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，通過(guò)所述餾分收集器收集梯度洗脫的流穿液，即實(shí)現(xiàn)對(duì)所述磷酸肽的分離。

步驟(1)中，采用臺(tái)式離心機(jī)離心，使磷酸肽保留于所述二氧化鈦填料中，非磷酸肽隨流穿液流入所述餾分收集器中；收集所述餾分收集器中的流穿液，反復(fù)上樣3次，從而達(dá)到充分富集磷酸肽的目的；在所述富集槍頭中加入清洗液后離心，清洗去除吸附于tio2上的非磷酸肽。

步驟(2)中，即將所述富集槍頭、所述分離槍頭和所述餾分收集器串聯(lián)；將富集的磷酸肽洗脫至所述分離槍頭中，同時(shí)利用c18反相填料對(duì)疏水性不同的磷酸肽在乙腈含量不同的洗脫液中保留能力的差異，對(duì)磷酸肽實(shí)現(xiàn)反相分離。

如富集和分離小鼠肝臟蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中的磷酸肽時(shí)，可采用腈、乳酸、水和三氟乙酸(64:20:12:4，v/v)的混合液溶解樣品；可采用乙腈、水和三氟乙酸(80:15:5，v/v)的混合液作為清洗液。

經(jīng)過(guò)上述富集、分離后的磷酸肽樣品可直接用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定，不需要對(duì)樣品進(jìn)行脫鹽預(yù)處理，減少了繁瑣的前處理操作造成的樣本損失。同時(shí)，高ph反相分離與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用時(shí)使用的低ph反相分離具有良好的正交性，能夠有效降低富集產(chǎn)物的復(fù)雜程度，提高磷酸肽的質(zhì)譜鑒定效果。另外，將分餾后的餾分交叉合并可將色譜保留行為差異較大的肽段混合，有效提高分餾與后續(xù)液相色譜-質(zhì)譜鑒定中色譜分離的正交性。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1)通過(guò)tio2富集槍頭和c18反相填料分離槍頭將磷酸肽的富集和反相分離有機(jī)結(jié)合，有效精簡(jiǎn)了實(shí)驗(yàn)步驟，減少了樣品損失；

2)該裝置采用高ph反相分離模式，避免了常用的scx分離中，肽段脫鹽和凍干等一系列繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作步驟和樣本損失；

3)該裝置可與實(shí)驗(yàn)室常用的臺(tái)式離心機(jī)配合使用，通過(guò)離心方式進(jìn)行樣品的上樣、清洗、洗脫和分離，降低了實(shí)驗(yàn)的勞動(dòng)強(qiáng)度和人為因素干擾，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)多達(dá)24個(gè)樣品的平行處理，大幅提高樣品處理通量和分析的重現(xiàn)性；

4)該裝置簡(jiǎn)單易制，成本低；

5)該裝置非常適合應(yīng)用于大規(guī)模、微量臨床樣品的磷酸肽分析，在蛋白質(zhì)組翻譯后修飾的富集研究中具有良好的應(yīng)用潛力。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明離心式富集裝置的富集槍頭的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為本發(fā)明離心式富集裝置的分離槍頭的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3為本發(fā)明離心式富集裝置的餾分收集器的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖4為本發(fā)明離心式富集裝置的富集槍頭與餾分收集器配合時(shí)的示意圖。

圖5為本發(fā)明離心式富集裝置的富集槍頭、分離槍頭與餾分收集器串聯(lián)配合時(shí)的示意圖。

圖6為本發(fā)明離心式富集裝置應(yīng)用于小鼠肝臟蛋白質(zhì)磷酸肽富集分離的實(shí)驗(yàn)流程圖。

圖7為利用本發(fā)明離心式富集裝置進(jìn)行的一次實(shí)驗(yàn)三個(gè)餾分的磷酸肽鑒定結(jié)果的韋恩圖。

圖8為利用本發(fā)明離心式富集裝置重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)的磷酸肽鑒定結(jié)果的韋恩圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

本發(fā)明提供的離心式富集裝置包括富集槍頭、分離槍頭和餾分收集器，其中，富集槍頭的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示，它采用規(guī)格為200μl的槍頭，富集槍頭內(nèi)填充有1層覆蓋有八烷基膜的固相萃取膜片1(empore，直徑47nm)和2mg二氧化鈦填料2，且覆蓋有八烷基膜的固相萃取膜片1靠近槍頭的出液口。分離槍頭的結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示，它采用規(guī)格為10μl的槍頭，分離槍頭內(nèi)設(shè)有3層且覆蓋有十八烷基膜的固相萃取膜片3(empore，直徑47nm)和3mgc18反相填料4，且覆蓋有十八烷基膜的固相萃取膜片3靠近槍頭的出液口。餾分收集器的結(jié)構(gòu)示意圖如圖3所示，它采用規(guī)格為1.5ml的ep管，其管口處設(shè)有適配器5，用于與富集槍頭和分離槍頭配合。富集槍頭與餾分收集器配合時(shí)的示意圖如圖4所示，富集槍頭、分離槍頭和餾分收集器三者串聯(lián)配合時(shí)的示意圖如圖5所示。

采用本發(fā)明上述離心式富集裝置應(yīng)用于小鼠肝臟蛋白質(zhì)磷酸肽富集分離時(shí)，可按照?qǐng)D4所示的流程進(jìn)行：

(1)小鼠肝臟蛋白質(zhì)提?。喝?0周齡c57bl/6小鼠的肝臟于ep管中，加入配置好的尿素裂解液(9m尿素溶于20mmhepes，加入適量蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)，使用高通量組織研磨器破碎組織后將樣品置于冰上，使用超聲破碎儀進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，取上清。

(2)小鼠肝臟蛋白質(zhì)酶解肽段溶液的制備：取1mg鼠肝蛋白，用尿素裂解液稀釋一倍，在溶液中加入二硫蘇糖醇(dtt，終濃度4.5mm)，55℃金屬浴孵育30min。冰上冷卻至室溫后，加入碘乙酰胺(iaa，終濃度10mm)，充分混勻，室溫避光靜置30min。稀釋蛋白溶液后，按胰蛋白酶和蛋白質(zhì)1:100(w/w)加入胰蛋白酶，置于37℃恒溫箱中酶解過(guò)夜后，使用sep-pakc18脫鹽小柱(waters)將產(chǎn)物肽段脫鹽并凍干。酶解產(chǎn)物用200μl上樣液(乙腈/乳酸/水/三氟乙酸，64:20:12:4，v/v)溶解。

(3)材料清洗與活化：分別使用200μl清洗液(乙腈/水/三氟乙酸，80:15:5，v/v)和200μl上樣液(乙腈/乳酸/水/三氟乙酸，64:20:12:4，v/v)清洗tio2富集槍頭，500g離心；分別使用200μl純乙腈和200μl15％濃氨水平衡c18分離槍頭，500g離心。

(4)上樣富集：將tio2富集槍頭固定于餾分收集器上(如圖2所示)，將肽段溶液轉(zhuǎn)移至富集槍頭，500g離心。收集餾分收集器中的流穿液，重復(fù)上樣，共富集3次。

(5)清洗：使用200μl清洗液(乙腈/水/三氟乙酸，80:15:5，v/v)清洗去除非磷酸肽，500g離心，重復(fù)3次。

(6)洗脫、分離：將tio2富集槍頭插入c18分離槍頭中，將二者串聯(lián)結(jié)合，并固定于新的餾分收集器中(如圖3所示)。依次加入梯度洗脫液各200μl：1)15％濃氨水，500g離心；2)2％乙腈+98％(15％濃氨水)，500g離心；3)5％乙腈+95％(15％濃氨水)，500g離心；4)8％乙腈+92％(15％濃氨水)，500g離心；5)10％乙腈+90％(15％濃氨水)，500g離心；6)40％乙腈+60％(15％濃氨水)，500g離心。分別收集梯度洗脫的流穿液，兩兩合并：2％+8％乙腈、5％+10％乙腈、0+40％乙腈，凍干后-80℃保存。

(7)質(zhì)譜檢測(cè)：將富集后的3個(gè)餾分均以20μl的水/甲酸(90:10，v/v)溶解，取10μl，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。質(zhì)譜條件：正離子掃描模式；電噴霧電壓為2.2kv，一級(jí)質(zhì)譜分辨率為120000，一級(jí)agc為5.0e5，最大離子注入時(shí)間為50ms，全掃描質(zhì)荷比范圍為300～1400；二級(jí)質(zhì)譜母離子的選擇采用數(shù)據(jù)依賴模式，hcd碰撞能量設(shè)定為32％，agc為1.0e2，最大離子注入時(shí)間為250ms，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)為18s，質(zhì)譜采集時(shí)間為78min。

(8)搜庫(kù)：proteomediscoverer1.4軟件搜庫(kù)分析，以mascot搜索引擎對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索，蛋白酶切類型選擇trypsin，允許最大肽段漏切位點(diǎn)數(shù)設(shè)為2，一級(jí)搜索質(zhì)量偏差≤15ppm，二級(jí)搜索質(zhì)量偏差≤0.5da，固定修飾為carbamidomethyl(c)，可變修飾為oxidation(m)，acetyl(proteinn-term)，phosphorylation(st)和phosphorylation(y)。肽段水平假陽(yáng)性率(fdr)≤1％。

(9)磷酸肽鑒定結(jié)果：三個(gè)餾分共計(jì)鑒定到10793個(gè)磷酸化位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)7333個(gè)非冗余磷酸肽，富集選擇性為75.8％。三個(gè)餾分的磷酸肽鑒定數(shù)量及富集選擇性見(jiàn)表1，韋恩圖見(jiàn)圖7。同樣條件下未經(jīng)餾分分離，直接進(jìn)行質(zhì)譜鑒定只能得到3405個(gè)磷酸肽，富集選擇性為74.0％，說(shuō)明該分餾策略可以在保證富集選擇性的前提下顯著提高磷酸肽的鑒定規(guī)模。將分餾后的餾分交叉合并可將色譜保留行為差異較大的肽段混合，有效提高分餾與后續(xù)液相色譜-質(zhì)譜鑒定中色譜分離的正交性，比采用順序合并更能使肽段均勻分布在整個(gè)色譜梯度洗脫的范圍內(nèi)，充分利用質(zhì)譜的掃描時(shí)間。使用該裝置，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)分別鑒定到7333個(gè)、7587個(gè)、7962個(gè)磷酸肽，韋恩圖見(jiàn)圖8。富集選擇性分別為73.1％、73.5％和69.1％。其中50.2％的磷酸肽至少在兩次實(shí)驗(yàn)中被鑒定到，充分證明其在復(fù)雜樣本磷酸化分析中的應(yīng)用價(jià)值。

表1三個(gè)餾分的磷酸肽鑒定數(shù)及富集選擇性