本發(fā)明屬于微生物燃料電池生物傳感器檢測(cè)藥物的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于(cnts/pani)n-ito陽(yáng)極的mfc生物傳感器用于藥敏試驗(yàn)的方法。

背景技術(shù)：

近年來抗生素的濫用嚴(yán)重地威脅著人類的生命健康。傳統(tǒng)的抗生素藥敏試驗(yàn)法包括紙片擴(kuò)散法、瓊脂稀釋法、e試驗(yàn)法以及肉湯稀釋法等。然而，這些方法都存在著耗時(shí)較長(zhǎng)(24～48h)和操作繁瑣的不足，不能滿足臨床快速診斷治療的需要。微生物燃料電池(mfc)是以微生物為催化劑，將化學(xué)能直接轉(zhuǎn)生物傳感器作為一種化為電能的裝置，被用于產(chǎn)電供能、污水處理、環(huán)境生物修復(fù)及生物傳感器等領(lǐng)域。微生物燃料電池用于生物傳感器領(lǐng)域可用來檢測(cè)有毒物質(zhì)。基本原理為有毒物質(zhì)進(jìn)入mfc后，電化學(xué)活性菌的代謝受到有毒物質(zhì)的抑制，導(dǎo)致輸出電流降低，而電流的下降程度與有毒物質(zhì)的濃度存在一定的相關(guān)性。有毒物質(zhì)毒性越大，電流降低幅度越大，根據(jù)有毒物質(zhì)與電流降低幅度之間的關(guān)系可構(gòu)建不同的毒性傳感器。雖然目前已經(jīng)利用mfc構(gòu)建了生物傳感器用于抗生素檢測(cè)，但是并沒有對(duì)傳感器的檢測(cè)靈敏度和抗生素的最低檢測(cè)限進(jìn)行研究。

基于微生物燃料電池的生物傳感器的傳感特性主要取決于微生物燃料電池的產(chǎn)電性能。陽(yáng)極材料因直接和微生物接觸并傳遞胞外電子成為重要的影響因素之一。納米金屬顆粒、碳納米管、納米結(jié)構(gòu)導(dǎo)電聚合物等電極材料應(yīng)用于微生物燃料電池中能夠提高產(chǎn)電性能。雖然目前人們已嘗試不同方法制備了mfc納米結(jié)構(gòu)材料陽(yáng)極，但并未有制備納米結(jié)構(gòu)碳納米管/聚苯胺復(fù)合物修飾ito陽(yáng)極并用于構(gòu)建mfc傳感器，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)研究，解決藥敏試驗(yàn)靈敏度的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供了一種基于(cnts/pani)n-ito陽(yáng)極的mfc生物傳感器用于藥敏試驗(yàn)的方法，采用層層自組裝方法制備碳納米管/聚苯胺復(fù)合物修飾ito陽(yáng)極(即(cnts/pani)n-ito陽(yáng)極)，構(gòu)建微生物燃料電池(mfc)生物傳感器，并將其應(yīng)用于慶大霉素藥敏試驗(yàn)。本發(fā)明對(duì)傳統(tǒng)的抗生素藥敏試驗(yàn)方法提出了一種新方法，避免了微生物平板法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣、重復(fù)性差等問題，所構(gòu)建的微生物燃料電池生物傳感器操作簡(jiǎn)便，并且能夠?qū)崿F(xiàn)快速、實(shí)時(shí)、高靈敏度的藥敏試驗(yàn)。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種基于(cnts/pani)n-ito陽(yáng)極的微生物燃料電池生物傳感器用于藥敏試驗(yàn)的方法，包括：

1)將經(jīng)3～5％naoh溶液處理后的ito(氧化銦錫)電極浸入無水甲苯溶液中，加入aptes(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，其中aptes與無水甲苯的配方比例為1.0～1.2g：25ml；在氮?dú)夥諊谐胤胖?5～17h后，取出ito電極，依次用甲苯、乙醇和去離子水超聲清洗，最后氮?dú)獯蹈桑?/p>

2)用體積比1：2.5～3.5的飽和濃硝酸與濃硫酸的混合溶液對(duì)cnts(碳納米管)進(jìn)行23～25h超聲酸化處理，離心，用超純水洗滌，反復(fù)離心洗滌直至上清液呈中性為止；將離心得到的cnts凍干保存，然后用超純水配制成0.9～1.1mg/ml的cnts懸浮液；

3)將質(zhì)量比1：0.9～1.1的pani(聚苯胺)和hcsa(樟腦磺酸)溶解到氯仿中，攪拌至溶劑揮發(fā)完全，隨后用超純水超聲分散，配制成濃度為0.9～1.1mg/ml的hcsa摻雜的pani溶液；

4)將步驟1)得到的ito電極浸泡于步驟3)得到的hcsa摻雜的pani溶液中25～35min，取出用超純水浸泡清洗4～6min，再浸泡于步驟2)得到的cnts懸浮液中25～35min，取出超純水浸泡清洗4～6min，得到(cnts/pani)n-ito電極，其中n為修飾層數(shù)，n＝1；將所述n＝1的(cnts/pani)n-ito電極重復(fù)上述步驟，得到不同修飾層數(shù)的(cnts/pani)n-ito電極；

5)利用所述(cnts/pani)n-ito電極構(gòu)建單室微生物燃料電池生物傳感器：以所述(cnts/pani)n-ito電極為工作電極，pt為對(duì)電極，飽和ag/agcl電極為參比電極，單室生物傳感器中加入含有藥物的電解液，恒電位0.18～0.22v，恒溫36～38℃運(yùn)行25～35min后，加入菌液，觀測(cè)單室微生物燃料電池生物傳感器的電化學(xué)參數(shù)變化以進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；和/或，

利用所述(cnts/pani)n-ito電極構(gòu)建雙室微生物燃料電池生物傳感器：以所述(cnts/pani)n-ito電極為陽(yáng)極，碳布為陰極，陽(yáng)極室加入電解液和菌液，陰極室加入9～11mm鐵氰化鉀溶液，外阻1900～2100ω，恒溫36～38℃運(yùn)行24～26h后，加入藥物，觀測(cè)雙室微生物燃料電池生物傳感器的電化學(xué)參數(shù)變化以進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

一實(shí)施例中：所述n＝1、3、6、8、12、15。

一實(shí)施例中：所述n＝12。

一實(shí)施例中：所述菌液的菌為能夠產(chǎn)生胞外電子的病原微生物。

一實(shí)施例中：所述菌液的菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌、克雷伯菌中的至少一種。

一實(shí)施例中：所述菌液的菌為shewanellaloihicapv-4和/或escherichiacoli25922。

一實(shí)施例中：所述藥物為能殺滅病原微生物和/或能抑制病原微生物生長(zhǎng)和活性的藥物。

一實(shí)施例中：所述藥物為抗生素。

一實(shí)施例中：所述藥物為青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類抗生素中的至少一種。

一實(shí)施例中：所述藥物為慶大霉素。

本技術(shù)方案與背景技術(shù)相比，它具有如下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明利用微生物燃料電池構(gòu)建生物傳感器，用于慶大霉素藥敏試驗(yàn)研究，避免了傳統(tǒng)方法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)和操作繁瑣的不足。本發(fā)明制備了碳納米管/聚苯胺復(fù)合物修飾ito陽(yáng)極并將其用于微生物燃料電池生物傳感器，進(jìn)一步提高了傳感器的檢測(cè)靈敏度，并且實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

圖1為實(shí)施例1制備的不同層數(shù)cnts/pani修飾ito電極在微生物燃料電池中的時(shí)間-電流曲線。

圖2為實(shí)施例1制備的不同層數(shù)cnts/pani修飾ito電極對(duì)s.loihicapv-4粘附影響的sem圖，圖中，(a)修飾1層，(b)修飾3層，(c)修飾6層，(d)修飾8層，(e)修飾12層，(f)修飾15層。

圖3為實(shí)施例2中添加不同濃度慶大霉素條件下，基于(cnts/pani)12-ito陽(yáng)極的單室微生物燃料電池生物傳感器的電流響應(yīng)曲線。

圖4為實(shí)施例3中添加不同濃度慶大霉素條件下，基于(cnts/pani)12-ito陽(yáng)極的雙室微生物燃料電池生物傳感器的電壓響應(yīng)曲線。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例具體說明本發(fā)明的內(nèi)容：

實(shí)施例1

1)將經(jīng)4％naoh溶液處理后的ito(氧化銦錫)電極浸入25ml無水甲苯溶液中，加入約為1.1g的aptes(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，在氮?dú)夥諊谐胤胖?6h后，取出ito電極，依次用甲苯、乙醇和去離子水超聲清洗，最后氮?dú)獯蹈桑?/p>

2)用飽和濃硝酸與濃硫酸的混合溶液(v/v，1:3)對(duì)cnts(碳納米管)進(jìn)行24h超聲酸化處理，離心，用超純水洗滌直至上清液呈中性為止；將離心得到的cnts凍干保存，然后用超純水配制成1mg/ml的cnts懸浮液；

3)將100mg的pani(聚苯胺)和100mg的hcsa(樟腦磺酸)溶解到20ml氯仿中，攪拌至溶劑揮發(fā)完全，隨后用超純水超聲分散，配制成濃度為1mg/ml的hcsa摻雜的pani溶液；

4)將步驟1)得到的ito電極浸泡于步驟3)得到的hcsa摻雜的pani溶液中30min，取出用超純水浸泡清洗5min，再浸泡于步驟2)得到的cnts懸浮液中30min，取出超純水浸泡清洗5min，得到(cnts/pani)n-ito電極，其中n＝1；將所述n＝1的(cnts/pani)n-ito電極重復(fù)上述步驟，得到不同修飾層數(shù)的(cnts/pani)n-ito電極(n＝1，3，6，8，12，15)；

以(cnts/pani)n-ito電極為工作電極，pt為對(duì)電極，飽和ag/agcl電極為參比電極，反應(yīng)器中加入電解液，恒電位為0.2v，恒溫37℃運(yùn)行30min后，加入od600為2.0的shewanellaloihicapv-4菌液，進(jìn)行產(chǎn)電實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果如圖1和圖2所示，圖1為不同層數(shù)cnts/pani修飾ito電極在微生物燃料電池中的時(shí)間-電流曲線，由圖可知，修飾層數(shù)n＝12的(cnts/pani)12-ito電極產(chǎn)生的電流密度值最大(6.98μa/cm²)。圖2為不同層數(shù)cnts/pani修飾ito電極對(duì)s.loihicapv-4粘附影響的sem圖，由圖可知，s.loihicapv-4在修飾3層以上的電極上粘附性均較好。

實(shí)施例2

1)將經(jīng)4％naoh溶液處理后的ito電極浸入25ml無水甲苯溶液中，加入約為1.1g的aptes，在氮?dú)夥諊谐胤胖?6h后，取出ito電極，依次用甲苯、乙醇和去離子水超聲清洗，最后氮?dú)獯蹈桑?/p>

2)用飽和濃硝酸與濃硫酸的混合溶液(v/v，1:3)對(duì)cnts進(jìn)行24h超聲酸化處理，離心，用超純水洗滌直至上清液呈中性為止；將離心得到的cnts凍干保存，然后用超純水配制成1mg/ml的cnts懸浮液；

3)將100mg的pani和100mg的hcsa溶解到20ml氯仿中，攪拌至溶劑揮發(fā)完全，隨后用超純水超聲分散，配制成濃度為1mg/ml的hcsa摻雜的pani溶液；

4)將步驟1)得到的ito電極浸泡于步驟3)得到的hcsa摻雜的pani溶液中30min，取出用超純水浸泡清洗5min，再浸泡于步驟2)得到的cnts懸浮液中30min，取出超純水浸泡清洗5min；重復(fù)上述步驟至共進(jìn)行12次，得到修飾層數(shù)n＝12的(cnts/pani)12-ito電極；

5)利用所述(cnts/pani)12-ito電極構(gòu)建單室微生物燃料電池生物傳感器，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)：以所述(cnts/pani)12-ito電極為工作電極，pt為對(duì)電極，飽和ag/agcl電極為參比電極，單室生物傳感器中分別加入濃度為0mm、0.25mm、0.5mm、1mm、1.5mm的慶大霉素的電解液，恒電位0.2v，恒溫37℃運(yùn)行30min后，加入od600為2.0的escherichiacoli25922菌液，進(jìn)行產(chǎn)電實(shí)驗(yàn)，觀測(cè)單室微生物燃料電池生物傳感器的電化學(xué)參數(shù)變化以進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

圖3為添加不同濃度慶大霉素條件下，基于(cnts/pani)12-ito陽(yáng)極的單室微生物燃料電池生物傳感器的電流響應(yīng)曲線。由圖可知，隨著慶大霉素濃度的增大，傳感器的電流信號(hào)逐漸減小，慶大霉素的最低檢測(cè)限為0.25mm。

實(shí)施例3

1)將經(jīng)4％naoh溶液處理后的ito電極浸入25ml無水甲苯溶液中，加入約為1.1g的aptes，在氮?dú)夥諊谐胤胖?6h后，取出ito電極，依次用甲苯、乙醇和去離子水超聲清洗，最后氮?dú)獯蹈桑?/p>

2)用飽和濃硝酸與濃硫酸的混合溶液(v/v，1:3)對(duì)cnts進(jìn)行24h超聲酸化處理，離心，用超純水洗滌直至上清液呈中性為止；將離心得到的cnts凍干保存，然后用超純水配制成1mg/ml的cnts懸浮液；

3)將100mg的pani和100mg的hcsa溶解到20ml氯仿中，攪拌至溶劑揮發(fā)完全，隨后用超純水超聲分散，配制成濃度為1mg/ml的hcsa摻雜的pani溶液；

4)將步驟1)得到的ito電極浸泡于步驟3)得到的hcsa摻雜的pani溶液中30min，取出用超純水浸泡清洗5min，再浸泡于步驟2)得到的cnts懸浮液中30min，取出超純水浸泡清洗5min；重復(fù)上述步驟至共進(jìn)行12次，得到修飾層數(shù)n＝12的(cnts/pani)12-ito電極；

5)利用所述(cnts/pani)12-ito電極構(gòu)建雙室微生物燃料電池生物傳感器，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)：以所述(cnts/pani)12-ito電極為陽(yáng)極，碳布為陰極，陽(yáng)極室加入電解液和od600為2.0的escherichiacoli25922菌液，陰極室加入10mm鐵氰化鉀溶液，連上2000ω外阻，恒溫37℃運(yùn)行25h后，分別加入濃度為0mm、0.25mm、0.5mm、1mm、1.5mm的慶大霉素，進(jìn)行產(chǎn)電實(shí)驗(yàn)，觀測(cè)雙室微生物燃料電池生物傳感器的電化學(xué)參數(shù)變化以進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

圖4為添加不同濃度慶大霉素條件下，基于(cnts/pani)12-ito陽(yáng)極的雙室微生物燃料電池生物傳感器的電壓響應(yīng)曲線。由圖可知，接種菌液后電壓從0mv不斷上升，8h后約150mv，隨后穩(wěn)定在120mv左右。運(yùn)行25h后，隨著慶大霉素的加入電壓下降。慶大霉素濃度越高，傳感器的電壓信號(hào)下降約顯著，慶大霉素的最低檢測(cè)限為0.25mm，與單室微生物燃料電池生物傳感器的慶大霉素藥敏試驗(yàn)結(jié)果具有良好的一致性。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。