本發(fā)明屬于化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種赭曲霉素a免疫親和柱的制備方法。

背景技術(shù)：

赭曲霉毒素是繼黃曲霉毒素后又一個(gè)引起世界廣泛關(guān)注的霉菌毒素。它是由曲霉屬的7種曲霉和青霉屬的6種青霉菌產(chǎn)生的一組重要的、污染食品的真菌毒素。其中毒性最大、分布最廣、產(chǎn)毒量最高、對農(nóng)產(chǎn)品的污染最重、與人類健康關(guān)系最密切的是赭曲霉毒素a。與黃曲霉毒素的檢測方法一樣，赭曲霉毒素a的檢測方法有薄層層析法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫測定法、免疫親和層析柱-高效液相色譜法、免疫親和層析柱-熒光光度法等。目前免疫親和層析柱-高效液相色譜法和免疫親和層析柱-熒光光度法，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，已被國家標(biāo)準(zhǔn)gb/t18979-2003所采用。免疫親和層析柱-高效液相色譜法和免疫親和層析柱-熒光光度法的核心技術(shù)就是制備性能穩(wěn)定、安全可靠，結(jié)果可以信賴的免疫親和柱。目前親和柱固定基質(zhì)的選擇分幾大類：高分子材料、生物大分子、生物高分子材料。在上述幾種材料中，生物高分子材料具有環(huán)境友好，價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為研發(fā)的熱點(diǎn)。

殼聚糖作為一種廉價(jià)易得的生物高分子材料已經(jīng)越來越得到廣泛地應(yīng)用于各種生化檢測材料中。殼聚糖分子中具有氨基和羥基，因此改性的方式多，反應(yīng)靈活。經(jīng)過改性，殼聚糖也能形成結(jié)構(gòu)規(guī)整的微球。目前殼聚糖的改性交聯(lián)主要通過其結(jié)構(gòu)上的氨基與醛類形成席夫堿來實(shí)現(xiàn)。殼聚糖上的氨基完全席夫堿化留下的羥基則能夠保證下一步與抗體偶聯(lián)反應(yīng)的均一性和穩(wěn)定性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種赭曲霉素a免疫親和柱的制備方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取技術(shù)方案是：一種赭曲霉素a免疫親和柱的制備方法，所述方法包括交聯(lián)殼聚糖基質(zhì)的制備、抗體與交聯(lián)殼聚糖的偶聯(lián)以及裝柱工序，具體工藝步驟如下所述：

1)交聯(lián)殼聚糖基質(zhì)的制備：

稱取殼聚糖溶于體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液中，攪拌并超聲至完全溶解；殼聚糖經(jīng)過二醛交聯(lián)、單醛交聯(lián)，真空干燥得到交聯(lián)殼聚糖基質(zhì)；

2)抗體與交聯(lián)殼聚糖的偶聯(lián)：

a.取步驟1)交聯(lián)殼聚糖，懸浮于甲基環(huán)氧氯丙烷中，緩慢滴加氫氧化鈉水溶液，于50-70℃恒溫水浴振蕩器上活化反應(yīng)4-8h，反應(yīng)結(jié)束后，用水反復(fù)洗滌，真空干燥，得到活化殼聚糖備用；

b.將活化殼聚糖分散于赭曲霉素a抗體的緩沖液中，于35-39℃恒溫水浴振蕩器上活化反應(yīng)，直至溶液中赭曲霉素a抗體的濃度不發(fā)生變化為止，待反應(yīng)結(jié)束后，得到偶聯(lián)抗體的交聯(lián)殼聚糖混懸液；

3)裝柱：

取步驟2)制備的混懸液裝柱，沉降，分別用純水、磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌至赭曲霉素a抗體不能檢出，在4℃下磷酸鹽緩沖液中保存，即得到赭曲霉素a免疫親和柱。

優(yōu)選地，所述步驟1)中的所述二醛交聯(lián)、單醛交聯(lián)方法為：待殼聚糖在1％醋酸溶液中完全溶解后，將二醛緩慢的滴入瓶中交聯(lián)固化，攪拌反應(yīng)；然后將單醛緩慢的滴入瓶中交聯(lián)固化，攪拌反應(yīng)，冷卻，加入與水互溶的溶劑幫助沉淀，過濾，濾餅用與水不互溶的溶劑洗滌，將過濾得到的濾餅于真空干燥，得到白色粉末，即為交聯(lián)殼聚糖基質(zhì)。

優(yōu)選地，所述步驟1)中二醛交聯(lián)，二醛添加量為殼聚糖質(zhì)量的1-2倍；攪拌反應(yīng)時(shí)間為2-4h，攪拌反應(yīng)溫度為20-40℃。

優(yōu)選地，所述步驟1)中單醛交聯(lián)，單醛加量為殼聚糖質(zhì)量的0.5-1.5倍；攪拌反應(yīng)時(shí)間為2-4h，攪拌反應(yīng)溫度為20-40℃。

優(yōu)選地，所述步驟2)中氫氧化鈉水溶液的濃度為40wt％，交聯(lián)殼聚糖與氫氧化鈉水溶液質(zhì)量比為1：1-2；所述交聯(lián)殼聚糖與活化劑質(zhì)量比為1：4-6。

優(yōu)選地，所述步驟1)中的殼聚糖交聯(lián)所用的二醛為鏈長2-6個(gè)碳的二醛；殼聚糖交聯(lián)所用的單醛為鏈長1-5個(gè)碳的單醛。

優(yōu)選地，所述步驟1)中殼聚糖經(jīng)過二醛交聯(lián)、單醛交聯(lián)后，加入與水互溶的溶劑幫助沉淀；所述與水互溶的溶劑為鏈長1-4個(gè)碳的單醇、丙酮中的任意一種；所述水互溶的溶劑體積用量為殼聚糖質(zhì)量的8-12倍，所述質(zhì)量單位為g，所述體積單位為ml。

優(yōu)選地，所述步驟1)中殼聚糖經(jīng)過二醛交聯(lián)、單醛交聯(lián)后，過濾，得到濾餅用與水不互溶的溶劑洗滌；所述與水不互溶的溶劑為乙醚、沸點(diǎn)30-60的石油醚、沸點(diǎn)60-90的石油醚、正己烷、環(huán)己烷中的任意一種或幾種；所述水不互溶的溶劑體積用量為殼聚糖質(zhì)量的8-12倍，所述質(zhì)量單位為g，所述體積單位為ml。

優(yōu)選地，所述步驟1)中殼聚糖與醋酸溶液質(zhì)量體積比為1：8-12，所述質(zhì)量單位為g，所述體積單位為ml；所述真空干燥溫度為50-70℃。

優(yōu)選地，所述步驟2)中赭曲霉素a抗體的磷酸鹽緩沖液的濃度為3-5g/l，緩沖液的ph為7.4-8.2，體積用量為活化殼聚糖質(zhì)量15-25倍，所述體積單位為l，所述質(zhì)量單位為g。

本發(fā)明設(shè)計(jì)思路如下：1)首先利用二醛對殼聚糖進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，形成交聯(lián)殼聚糖；2)利用單醛對交聯(lián)殼聚糖進(jìn)行再交聯(lián)，使殼聚糖上未反應(yīng)的氨基反應(yīng)完全，并且限定了交聯(lián)殼聚糖微球中孔道的內(nèi)徑大小與疏水結(jié)構(gòu)；3)利用甲基環(huán)氧氯丙烷而不是環(huán)氧氯丙烷進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，通過空間位阻以及疏水相互作用，很好的避免了赭曲霉素a單抗中的結(jié)合活性位置與交聯(lián)殼聚糖的非特異性相互作用；甲基環(huán)氧氯丙烷上的甲基也很好的降低了交聯(lián)后暴露出的羥基的反應(yīng)活性；4)交聯(lián)殼聚糖的活化反應(yīng)與偶聯(lián)抗體的反應(yīng)分開進(jìn)行，從而最大限度的保證了赭曲霉素a單抗的活性。

本發(fā)明偶聯(lián)率檢測及計(jì)算方法如下：

g1＝(c0-c1)*v0/w1

g1：偶聯(lián)率(g/g)；

c0：赭曲霉素a抗體的起始濃度(g/l)

c1：赭曲霉素a抗體的最終濃度(g/l)

v0：赭曲霉素a抗體溶液的體積(l)

w1：活化殼聚糖的質(zhì)量(g)

本發(fā)明赭曲霉素a抗體的檢測方法:利用紫外分光光度法確定赭曲霉素a抗體的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定抗體的濃度。

采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于：1、本發(fā)明利用二醛和單醛分別對殼聚糖進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，形成氨基反應(yīng)完全且富含羥基的交聯(lián)殼聚糖基質(zhì)。2、本發(fā)明將抗體的非結(jié)合活性區(qū)域fc端定向偶聯(lián)到交聯(lián)殼聚糖上，更好地保持抗體的活性；利用交聯(lián)殼聚糖與甲基環(huán)氧氯丙烷進(jìn)行交聯(lián)活化反應(yīng)，避免了赭曲霉素a抗體中的結(jié)合活性位置與交聯(lián)殼聚糖的非特異性相互作用，使絕大部分抗體處于游離狀態(tài)。3、本發(fā)明交聯(lián)殼聚糖的活化反應(yīng)與偶聯(lián)抗體的反應(yīng)分開進(jìn)行，從而最大限度的保證了赭曲霉素a抗體的活性。4、本發(fā)明偶聯(lián)率最高達(dá)到0.68g/g，偶聯(lián)效率高，本發(fā)明制備的以殼聚糖為載體的免疫親和柱能夠與赭曲霉素a特異性結(jié)合，能得到純度較高的赭曲霉素a；免疫親和柱對赭曲霉素a最大結(jié)合容量約為391ng/g，回收率達(dá)到97.2％。

附圖說明

圖1為活化殼聚糖與殼聚糖偶聯(lián)赭曲霉素a的制備圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

實(shí)施例1

本實(shí)施例赭曲霉素a免疫親和柱的制備方法包括交聯(lián)殼聚糖基質(zhì)的制備、抗體與交聯(lián)殼聚糖的偶聯(lián)以及裝柱工序，具體工藝步驟如下所述：

1)交聯(lián)殼聚糖基質(zhì)的制備：

稱取殼聚糖1.05g溶于10ml體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液中，攪拌并超聲至完全溶解，待殼聚糖完全溶解后，將1.5g戊二醛緩慢的滴入瓶中交聯(lián)固化，35℃攪拌反應(yīng)3h；然后將1.0g乙醛緩慢的滴入瓶中交聯(lián)固化，35℃攪拌反應(yīng)3h，冷卻，加入與10ml丙酮幫助沉淀，過濾，濾餅用10ml石油醚(沸點(diǎn)30-60)洗滌3次，將過濾得到的濾餅于60℃真空干燥，得到白色粉末，即為交聯(lián)殼聚糖基質(zhì)。

2)抗體與交聯(lián)殼聚糖的偶聯(lián)：

a.取步驟1)交聯(lián)殼聚糖1.28g，懸浮于5.5g活化劑甲基環(huán)氧氯丙烷中，緩慢滴加1.3g的40wt％氫氧化鈉水溶液，于60℃恒溫水浴振蕩器上活化反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后，用水反復(fù)洗滌，干燥，得到活化殼聚糖備用；

b.將活化殼聚糖1.54g分散于赭曲霉素a抗體的磷酸鹽緩沖液(30ml，4g/l，ph7.6)中，于37℃恒溫水浴振蕩器上活化反應(yīng)，直至溶液中赭曲霉素a抗體的濃度不發(fā)生變化為止，待反應(yīng)結(jié)束后，得到偶聯(lián)抗體的交聯(lián)殼聚糖混懸液；

3)裝柱：

取步驟2)制備的混懸液裝柱，沉降，分別用純水、ph7.6磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌，在4℃下磷酸鹽緩沖液中保存，即得到赭曲霉素a免疫親和柱。

本實(shí)施例制備赭曲霉素a免疫親和柱檢測偶聯(lián)率為0.68g/g。

實(shí)施例2

本實(shí)施例赭曲霉素a免疫親和柱的制備方法包括交聯(lián)殼聚糖基質(zhì)的制備、抗體與交聯(lián)殼聚糖的偶聯(lián)以及裝柱工序，具體工藝步驟如下所述：

1)交聯(lián)殼聚糖基質(zhì)的制備：

稱取殼聚糖1.07g溶于10ml體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液中，攪拌并超聲至完全溶解，待殼聚糖完全溶解后，將1.4g乙二醛緩慢的滴入瓶中交聯(lián)固化，35℃攪拌反應(yīng)3h；然后將1.1g丙醛緩慢的滴入瓶中交聯(lián)固化，35℃攪拌反應(yīng)3h，冷卻，加入與10ml甲醇幫助沉淀，過濾，濾餅用10ml正己烷洗滌3次，將過濾得到的濾餅于60℃真空干燥，得到白色粉末，即為交聯(lián)殼聚糖基質(zhì)。

2)抗體與交聯(lián)殼聚糖的偶聯(lián)：

a.取步驟1)交聯(lián)殼聚糖1.31g，懸浮于5.8g活化劑甲基環(huán)氧氯丙烷中，緩慢滴加1.5g的40wt％氫氧化鈉水溶液，于60℃恒溫水浴振蕩器上活化反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后，用水反復(fù)洗滌，干燥，得到活化殼聚糖備用；

b.將活化殼聚糖1.61g分散于赭曲霉素a抗體的磷酸鹽緩沖液(30ml，4g/l，ph7.8)中，于37℃恒溫水浴振蕩器上活化反應(yīng)，直至溶液中赭曲霉素a抗體的濃度不發(fā)生變化為止，待反應(yīng)結(jié)束后，得到偶聯(lián)抗體的交聯(lián)殼聚糖混懸液；

3)裝柱：

取步驟2)制備的混懸液裝柱，沉降，分別用純水、ph7.8磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌，在4℃下磷酸鹽緩沖液中保存，即得到赭曲霉素a免疫親和柱。

本實(shí)施例制備赭曲霉素a免疫親和柱檢測偶聯(lián)率為0.67g/g。

實(shí)施例3

本實(shí)施例赭曲霉素a免疫親和柱的制備方法包括交聯(lián)殼聚糖基質(zhì)的制備、抗體與交聯(lián)殼聚糖的偶聯(lián)以及裝柱工序，具體工藝步驟如下所述：

1)交聯(lián)殼聚糖基質(zhì)的制備：

稱取殼聚糖1.08g溶于10ml體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液中，攪拌并超聲至完全溶解，待殼聚糖完全溶解后，將1.3g丙二醛緩慢的滴入瓶中交聯(lián)固化，35℃攪拌反應(yīng)3h；然后將0.8g甲醛緩慢的滴入瓶中交聯(lián)固化，35℃攪拌反應(yīng)3h，冷卻，加入與10ml乙醇幫助沉淀，過濾，濾餅用10ml環(huán)己烷洗滌3次，將過濾得到的濾餅于60℃真空干燥，得到白色粉末，即為交聯(lián)殼聚糖基質(zhì)。

2)抗體與交聯(lián)殼聚糖的偶聯(lián)：

a.取步驟1)交聯(lián)殼聚糖1.34g，懸浮于5.7g活化劑甲基環(huán)氧氯丙烷中，緩慢滴加1.4g的40wt％氫氧化鈉水溶液，于60℃恒溫水浴振蕩器上活化反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后，用水反復(fù)洗滌，干燥，得到活化殼聚糖備用；

b.將活化殼聚糖1.65g分散于赭曲霉素a抗體的磷酸鹽緩沖液(30ml，4g/l，ph7.9)中，于37℃恒溫水浴振蕩器上活化反應(yīng)，直至溶液中赭曲霉素a抗體的濃度不發(fā)生變化為止，待反應(yīng)結(jié)束后，得到偶聯(lián)抗體的交聯(lián)殼聚糖混懸液；

3)裝柱：

取步驟2)制備的混懸液裝柱，沉降，分別用純水、ph7.9磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌，在4℃下磷酸鹽緩沖液中保存，即得到赭曲霉素a免疫親和柱。

本實(shí)施例制備赭曲霉素a免疫親和柱檢測偶聯(lián)率為0.65g/g。

實(shí)施例4

本實(shí)施例赭曲霉素a免疫親和柱的制備方法包括交聯(lián)殼聚糖基質(zhì)的制備、抗體與交聯(lián)殼聚糖的偶聯(lián)以及裝柱工序，具體工藝步驟如下所述：

1)交聯(lián)殼聚糖基質(zhì)的制備：

稱取殼聚糖1.0g溶于12ml體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液中，攪拌并超聲至完全溶解，待殼聚糖完全溶解后，將1g丁二醛緩慢的滴入瓶中交聯(lián)固化，20℃攪拌反應(yīng)4h；然后將0.5g丁醛緩慢的滴入瓶中交聯(lián)固化，20℃攪拌反應(yīng)4h，冷卻，加入與12ml丙醇幫助沉淀，過濾，濾餅用12ml乙醚洗滌3次，將過濾得到的濾餅于70℃真空干燥，得到白色粉末，即為交聯(lián)殼聚糖基質(zhì)。

2)抗體與交聯(lián)殼聚糖的偶聯(lián)：

a.取步驟1)交聯(lián)殼聚糖1g，懸浮于4g活化劑甲基環(huán)氧氯丙烷中，緩慢滴加1g的40wt％氫氧化鈉水溶液，于50℃恒溫水浴振蕩器上活化反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束后，用水反復(fù)洗滌，干燥，得到活化殼聚糖備用；

b.將活化殼聚糖1g分散于赭曲霉素a抗體的磷酸鹽緩沖液(25ml，3g/l，ph8.0)中，于35℃恒溫水浴振蕩器上活化反應(yīng)，直至溶液中赭曲霉素a抗體的濃度不發(fā)生變化為止，待反應(yīng)結(jié)束后，得到偶聯(lián)抗體的交聯(lián)殼聚糖混懸液；

3)裝柱：

取步驟2)制備的混懸液裝柱，沉降，分別用純水、ph8.0磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌，在4℃下磷酸鹽緩沖液中保存，即得到赭曲霉素a免疫親和柱。

本實(shí)施例制備赭曲霉素a免疫親和柱檢測偶聯(lián)率為0.67g/g。

實(shí)施例5

1)交聯(lián)殼聚糖基質(zhì)的制備：

稱取殼聚糖1.0g溶于8ml體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液中，攪拌并超聲至完全溶解，待殼聚糖完全溶解后，將2g己二醛緩慢的滴入瓶中交聯(lián)固化，40℃攪拌反應(yīng)2h；然后將1.5g戊醛緩慢的滴入瓶中交聯(lián)固化，40℃攪拌反應(yīng)2h，冷卻，加入與8ml丁醇幫助沉淀，過濾，濾餅用8ml石油醚(沸點(diǎn)60-90)洗滌3次，將過濾得到的濾餅于50℃真空干燥，得到白色粉末，即為交聯(lián)殼聚糖基質(zhì)。

2)抗體與交聯(lián)殼聚糖的偶聯(lián)：

a.取步驟1)交聯(lián)殼聚糖1g，懸浮于6.0g活化劑甲基環(huán)氧氯丙烷中，緩慢滴加2.0g的40wt％氫氧化鈉水溶液，于70℃恒溫水浴振蕩器上活化反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后，用水反復(fù)洗滌，干燥，得到活化殼聚糖備用；

b.將活化殼聚糖1g分散于赭曲霉素a抗體的磷酸鹽緩沖液(15ml，5g/l，ph8.2)中，于39℃恒溫水浴振蕩器上活化反應(yīng)，直至溶液中赭曲霉素a抗體的濃度不發(fā)生變化為止，待反應(yīng)結(jié)束后，得到偶聯(lián)抗體的交聯(lián)殼聚糖混懸液；

3)裝柱：

取步驟2)制備的混懸液裝柱，沉降，分別用純水、ph8.2的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌，在4℃下磷酸鹽緩沖液中保存，即得到赭曲霉素a免疫親和柱。

本實(shí)施例制備赭曲霉素a免疫親和柱檢測偶聯(lián)率為0.66g/g。

實(shí)施例6

本實(shí)施例對制備的赭曲霉素a免疫親和柱柱容量進(jìn)行測定。以赭曲霉素a的稀碳酸氫鈉溶液(100ppb)為洗脫液，上柱，直至流出液中赭曲霉素a的濃度恢復(fù)到初始濃度為止(結(jié)果見表1)。

柱容量計(jì)算方法如下：

g1＝c0*v0/w1

g1：柱容量(g/g)

c0：赭曲霉素a的起始濃度(g/l)

v0：流出液的體積(l)

w1：抗體交聯(lián)活化殼聚糖的質(zhì)量(g)

實(shí)施例7

本實(shí)施例對實(shí)施例1-5制備的赭曲霉素a免疫親和柱加標(biāo)回收率的測定。用4mol/l的氯化鎂溶液進(jìn)行洗脫，至流出液中赭曲霉素a不能檢出。用熒光光度計(jì)測定流出液中赭曲霉素a濃度(結(jié)果見表1)。

表1實(shí)施例1-5親和柱的偶聯(lián)率、柱容量以及回收率

以上實(shí)施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：依然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。