本發(fā)明涉及一種血滯通膠囊中有效成分紫丁香苷的定量檢測方法，尤其涉及一種采用高效液相色譜法定量檢測血滯通膠囊中有效成分紫丁香苷含量的方法，屬于血滯通膠囊有效成分的定量檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

血滯通膠囊為由中藥薤白經(jīng)加工制成的膠囊；功能與主治：通陽散結(jié)，行氣導滯；用于高血脂癥血瘀痰阻所致的胸悶、乏力、腹脹等。薤白為百合科植物小根蒜alliummacrostemonbge.或薤alliumchinenseg.don的干燥鱗莖。經(jīng)研究，薤白中含有多種成分，如皂苷、揮發(fā)油、含氮化合物、酸性成分、多糖、無機元素等多種成分，含硫化合物為其主要活性成分。薤白中還含有紫丁香苷、異甘草素等成分，其中紫丁香苷具有鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗炎等免疫調(diào)節(jié)作用。

血滯通膠囊質(zhì)量標準中的含量測定為采用氧瓶燃燒法測定樣品中的結(jié)合硫含量，然而由于含硫化合物不穩(wěn)定，因此該方法具有很大的誤差性。高效液相色譜法是測定藥物和天然產(chǎn)物中活性成分最常用的方法之一，具有快速、高效、靈敏等優(yōu)點。因此，以紫丁香苷為指標，建立一種血滯通膠囊中紫丁香苷含量的hplc測定方法，對于更加準確、全面的控制血滯通膠囊藥品質(zhì)量，具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種血滯通膠囊中有效成分紫丁香苷的定量檢測方法，該方法具有準確度高、精密度、穩(wěn)定性和重復性良好等優(yōu)點，能夠應用于血滯通膠囊的質(zhì)量控制或質(zhì)量評價。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明公開了一種血滯通膠囊中有效成分紫丁香苷的定量檢測方法，包括以下步驟：(1)利用提取溶劑提取待檢測血滯通膠囊中的紫丁香苷，得到提取液；(2)將提取液純化，得到供試品溶液；(3)將供試品溶液采用高效液相色譜(hplc)進行定量測定。

其中，步驟(3)所述高效液相色譜的色譜條件包括：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為甲醇-水溶液；流速為1.0ml/min；柱溫為40℃；檢測波長為265nm(理論塔板數(shù)按紫丁香苷峰計算應不低于4000)；進樣量為10-20μl，優(yōu)選為20μl。按照體積比計，所述流動相中甲醇：水溶液＝10-20：90-80；優(yōu)選的，甲醇：水溶液＝15-20：85-80；更優(yōu)選的，甲醇：水溶液＝17：83。

步驟(3)所述高效液相色譜的色譜柱為c18色譜柱；優(yōu)選為agilentsbc18色譜柱，規(guī)格為4.6×250mm，5μm；graceapolloc18色譜柱，規(guī)格為4.6mm×250mm，5μm；agilentzorbaxsbc18色譜柱，規(guī)格為4.6×250mm，5μm；shimadzainsertsuctainc18色譜柱，規(guī)格為4.6×250mm，5μm；wondacractods-2c18色譜柱，規(guī)格為4.6×250mm，5μm；或者insertsustainc18色譜柱，規(guī)格為4.6×250mm，5μm中的任意一種。所述高效液相色譜的高效液相色譜儀為agilent1200或shimadzalc-20at中的任意一種。

步驟(1)所述提取溶劑選自30％甲醇、50％甲醇、100％甲醇、50％乙醇或95％乙醇(均為體積百分比)中的任意一種；優(yōu)選為30％甲醇或50％甲醇；最優(yōu)選為50％甲醇。進一步優(yōu)選的，步驟(1)按照g/ml計，血滯通膠囊內(nèi)容物：50％甲醇＝2：50。

步驟(1)所述提取的方式選自超聲提取、加熱回流提取或索氏提取器提取中的任意一種，優(yōu)選為超聲提取。更優(yōu)選的，所述超聲提取的時間為10-60分鐘，優(yōu)選為30-60分鐘，最優(yōu)選為30分鐘；所述超聲提取的功率為250w，頻率為40khz。

步驟(2)所述純化采用中性氧化鋁柱層析；優(yōu)選的，所述中性氧化鋁柱中的中性氧化鋁的用量為3-5g，優(yōu)選為4-5g，最優(yōu)選為4g；所述中性氧化鋁的粒度為100-200目；所述中性氧化鋁柱的內(nèi)徑為1cm。

進一步的，步驟(2)所述純化包括：將提取液濾過，取續(xù)濾液，蒸干；將蒸干后得到的殘渣加50％甲醇(體積百分比，下同)溶解，(分多次)加在中性氧化鋁柱上，用50％甲醇洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干；將蒸干后得到的殘渣用50％甲醇溶解(定容至2ml)，即得。優(yōu)選的，取續(xù)濾液10ml蒸干，將蒸干后得到的殘渣加50％甲醇5ml溶解，加在中性氧化鋁柱上，用50％甲醇90ml洗脫。

步驟(3)所述定量測定采用外標法；優(yōu)選的，所述定量測定包括：分別精密量取紫丁香苷對照品溶液和供試品溶液一定量，進樣(即注入液相色譜儀，色譜條件同上)，記錄色譜圖；分別測量紫丁香苷對照品溶液的色譜圖中紫丁香苷的峰面積以及供試品溶液的色譜圖中待測紫丁香苷的峰面積，按下式計算紫丁香苷的含量：cx＝cr×ax/ar；其中，cx為供試品溶液中待測紫丁香苷的濃度，ax為供試品溶液的色譜圖中待測紫丁香苷的峰面積，ar為對照品溶液的色譜圖中紫丁香苷的峰面積，cr為對照品溶液中紫丁香苷的濃度。所述紫丁香苷對照品溶液的制備包括：將紫丁香苷對照品用50％甲醇(體積百分比)溶解，使每1ml對照品溶液中含紫丁香苷20μg。對照品溶液的進樣量優(yōu)選為10μl。

本發(fā)明對供試品溶液的制備方法以及高效液相色譜的色譜條件進行了優(yōu)化。提取溶劑優(yōu)化結(jié)果表明，分別以不同濃度的甲醇、乙醇作為提取溶劑，結(jié)果50％甲醇、30％甲醇提取的紫丁香苷分離度最好，周圍雜峰最少；而且50％甲醇提取的紫丁香苷含量最高。因此，本發(fā)明選擇50％甲醇作為提取溶劑。對于提取方法，本發(fā)明選擇超聲提取法、加熱回流提取法、索氏提取器提取法三種提取方法進行比較，結(jié)果采用此三種方法提取供試品中紫丁香苷的含量相差不多。由于超聲處理法最簡單，因此本發(fā)明選擇超聲提取法。提取時間是影響超聲提取效率的重要指標，本發(fā)明選擇3個不同的提取時間，結(jié)果表明超聲處理30分鐘時紫丁香苷的含量穩(wěn)定，再增加提取時間，紫丁香苷含量基本沒有變化。因此，本發(fā)明選擇提取30分鐘作為超聲提取時間。提取溶劑加樣量的考察結(jié)果表明，血滯通膠囊樣品取樣量為2g，加入50ml提取溶劑超聲處理后，紫丁香苷被提取完全。

為了達到基線分離，本發(fā)明考察了多種流動相及流動相比例，結(jié)果當流動相為甲醇-水(15：85)時，供試品色譜圖中紫丁香苷的分離度最好。然而相同的色譜條件，使用不同品牌的色譜柱，分離效果差異很大，可能是因為供試品中，雜質(zhì)特別多，極性稍有變化，將極大的影響紫丁香苷的分離度，無法保證在其它儀器及色譜柱上的重現(xiàn)；且供試品溶液中的雜質(zhì)多，對色譜柱的損害大。因此，為了達到更好的分離效果，本發(fā)明對供試品進行進一步純化，去除雜質(zhì)。

本發(fā)明對供試品續(xù)濾液純化方法的優(yōu)化結(jié)果表明，采用溶劑萃取純化法不能將供試品溶液中雜質(zhì)去除；采用spe固相萃取小柱純化，由于供試品中雜質(zhì)特別多，極性稍有變化，將極大的影響紫丁香苷的分離度；另外，流動相極性對紫丁香苷的分離也會產(chǎn)生較大影響，采用流動相甲醇-水(15:85)進行分離時，分離效果差異很大，因此確定流動相為甲醇-水(20:80)。采用固相萃取小柱純化樣品后，雜質(zhì)減少，應用流動相甲醇:水(20:80)即可達到很好的分離，但是同一廠家不同批次的固相萃取小柱對供試品的吸附能力不同，因此不適宜作為含量測定的純化方法。本發(fā)明采用中性氧化鋁柱層析的純化效果好，方法簡便且中性氧化鋁價格低廉。本發(fā)明進一步考察了中性氧化鋁柱純化樣品中影響紫丁香含量的重要參數(shù)，結(jié)果表明，將供試品續(xù)濾液蒸干后再經(jīng)過中性氧化鋁柱，上樣的樣品帶窄，分離效果好；中性氧化鋁的用量為4-5g的分離效果好，在同等分離效果的情況下，為了減少死吸附，提高回收率，選擇4g用量；50％甲醇洗脫用量為90ml，即能將紫丁香苷從中性氧化鋁柱上完全洗脫。

在供試品續(xù)濾液采用中性氧化鋁柱純化的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進一步考察了流動相甲醇-水的不同比例，結(jié)果流動相為甲醇-水(20：80)時，紫丁香苷峰并未完全達到基線分離；而在甲醇-水(17：83)時，色譜峰分離度較好，能呈正態(tài)分布。因此，本發(fā)明選擇甲醇-水(17：83)作為流動相。

耐用性試驗表明，利用不同品牌的c18色譜柱和兩個不同品牌的高效液相色譜儀，按照本發(fā)明優(yōu)化的方法檢測對照品及供試品溶液，結(jié)果均達到方法的系統(tǒng)適用性的要求，證明本發(fā)明方法的耐用性良好。

線性關(guān)系考察結(jié)果表明，以對照品進樣量為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，紫丁香苷回歸方程為y＝2224.8x-2.2037(r＝1)，表明紫丁香苷在0.0208-0.52μg范圍內(nèi)，進樣量與峰面積呈線性關(guān)系，符合外標法定量測定的要求。

精密度試驗結(jié)果表明，供試品溶液重復進樣6次，紫丁香苷峰面積積分值rsd<2.0％，表明精密度良好。穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，同一供試品溶液分別于0-24h進行測定，結(jié)果紫丁香苷平均峰面積rsd<1.0％，證明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。重復性試驗結(jié)果表明，同一批供試品按本發(fā)明方法獨立測定6份，結(jié)果紫丁香苷平均含量為53.55μg/g(rsd＝2.52％，n＝6)，重復性良好?；厥章试囼灲Y(jié)果表明，紫丁香苷的平均回收率為92.96％，rsd＝1.51％；證明本發(fā)明方法的回收率好，準確度較高。本發(fā)明血滯通膠囊中只含有薤白一味藥材，其它均為輔料，在本發(fā)明色譜條件下，輔料均沒有干擾峰。證明，本發(fā)明血滯通膠囊中有效成分紫丁香苷的定量檢測方法，專屬性強。

本發(fā)明測定了20個批次血滯通膠囊中紫丁香苷的含量，結(jié)果平均含量17.34μg/粒。綜合考慮到血滯通膠囊大生產(chǎn)過程中的損耗、樣品的存放及藥材的來源等各方面因素的影響，暫定限度為：本品每粒以紫丁香苷(c17h24o9)計，不得少于15.0μg。利用本發(fā)明方法測定薤白藥材中紫丁香苷的含量，確定紫丁香苷的轉(zhuǎn)移率為80.01％。

本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

本發(fā)明采用高效液相色譜法對血滯通膠囊中有效成分紫丁香苷的含量進行定量檢測，通過對提取溶劑、提取方法以及色譜條件等參數(shù)進行優(yōu)化，能夠準確的測定血滯通膠囊中紫丁香苷的含量。本發(fā)明所述定量檢測方法的耐用性良好，而且精密度、穩(wěn)定性及重復性好，輔料均沒有干擾峰。綜上，本發(fā)明血滯通膠囊中有效成分紫丁香苷的定量檢測方法，在血滯通膠囊的質(zhì)量控制或質(zhì)量評價中具有重要應用前景。

附圖說明

圖1為血滯通膠囊供試品經(jīng)過第二次超聲處理的液相色譜圖；

圖2為血滯通膠囊供試品在流動相為甲醇-0.4％磷酸緩沖液(20:80)條件下的液相色譜圖；

圖3為血滯通膠囊供試品在流動相為甲醇-0.4％磷酸緩沖液(15:85)條件下的液相色譜圖；

圖4為血滯通膠囊供試品在流動相為甲醇-0.4％磷酸緩沖液(10:90)條件下的液相色譜圖；

圖5為血滯通膠囊供試品在流動相為甲醇-水溶液(10:90)條件下的液相色譜圖；

圖6為血滯通膠囊供試品在流動相為甲醇-水溶液(20:80)條件下的液相色譜圖；

圖7為血滯通膠囊供試品在流動相為甲醇-水溶液(15:85)條件下的液相色譜圖；

圖8為血滯通膠囊供試品采用色譜柱insertsustainc18(4.6×250mm，5μm)的液相色譜圖；

圖9為供試品經(jīng)三氯甲烷萃取的液相色譜圖；

圖10為供試品經(jīng)乙酸乙酯萃取的液相色譜圖；

圖11為供試品經(jīng)水飽和正丁醇萃取的液相色譜圖；

圖12為供試品經(jīng)水飽和正丁醇萃取水液部分的液相色譜圖；

圖13為供試品經(jīng)c18水洗脫的液相色譜圖；

圖14為供試品經(jīng)c1850％甲醇洗脫的液相色譜圖；

圖15為供試品經(jīng)中性氧化鋁純化，流動相為甲醇-水溶液(20：80)的液相色譜圖；

圖16為供試品經(jīng)中性氧化鋁純化，流動相為甲醇-水溶液(17：83)的液相色譜圖；

圖17為對照品經(jīng)色譜儀：agilent1200，色譜柱：graceapolloc18(4.6×250mm,5μm)檢測的色譜圖；

圖18為供試品經(jīng)色譜儀：agilent1200，色譜柱：graceapolloc18(4.6×250mm,5μm)檢測的色譜圖；

圖19為對照品經(jīng)色譜儀：agilent1200，色譜柱：agilentzorbaxsbc18(4.6×250mm,5μm)檢測的色譜圖；

圖20為供試品經(jīng)色譜儀：agilent1200，色譜柱：agilentzorbaxsbc18(4.6×250mm,5μm)檢測的色譜圖；

圖21為對照品經(jīng)色譜儀：agilent1200，色譜柱：shimadzainsertsuctainc18(4.6×250mm,5μm)檢測的色譜圖；

圖22為供試品經(jīng)色譜儀：agilent1200，色譜柱：shimadzainsertsuctainc18(4.6×250mm,5μm)檢測的色譜圖；

圖23為對照品經(jīng)色譜儀：shimadzalc-20at，色譜柱：apolloc18(4.6×250mm,5μm)檢測的色譜圖；

圖24為供試品經(jīng)色譜儀：shimadzalc-20at，色譜柱：apolloc18(4.6×250mm,5μm)檢測的色譜圖；

圖25為陰性對照溶液的色譜圖；

圖26為紫丁香苷線性圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。

實施例1hplc測定血滯通膠囊中紫丁香苷的含量

1、材料與方法

1.1儀器與試藥

儀器：agilent1200高效液相色譜儀，島津lc-20at高效液相色譜儀。紫丁香苷對照品(批號：111574-200603，供含量測定用)由中國藥品生物制品檢定所提供。流動相所用甲醇為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

血滯通膠囊由吉林省東方制藥有限公司提供。

1.2對照品溶液的制備

取紫丁香苷對照品適量，精密稱定，加50％甲醇制成每1ml含紫丁香苷20μg的溶液，即得。

1.3測定波長的選擇

參照《中國藥典》2010年版一部刺五加項下紫丁香苷含量測定方法，選擇265nm為本發(fā)明的測定波長。

1.4供試品溶液處理方法的考察

1.4.1提取溶劑的考察

紫丁香苷溶于甲醇、乙醇，微溶于冷水，不溶于三氯甲烷等溶劑。醇類提取溶劑的提取效率最高，故本發(fā)明選擇甲醇及不同濃度的甲醇、乙醇作為提取溶劑進行考察。

供試品溶液的處理：取同一批次血滯通膠囊樣品，各2g，精密稱定，分別加入50ml甲醇及不同濃度的甲醇、乙醇(溶劑均為體積比)，稱重，超聲處理(功率250w，頻率40khz)30分鐘，放冷，加相應的溶劑補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液20ml，蒸干，殘渣加相應的溶劑定容至5ml，取續(xù)濾液，即得。

色譜條件：agilentsbc18色譜柱(4.6×250mm，5μm)；波長：265nm；流速：1.0ml/min；柱溫：40℃；流動相：甲醇-水(15:85)。

結(jié)果見表1，50％甲醇、30％甲醇提取的紫丁香苷分離度最好，周圍雜峰最少；50％甲醇提取的紫丁香苷含量最高，故選擇50％甲醇作為供試品的提取溶劑。

表1不同提取溶劑提取供試品中紫丁香苷的含量

1.4.2提取方法的考察

含量測定中常用的溶劑提取方法有浸漬法、超聲提取法、加熱回流提取法、索氏提取器提取法；后三種方法提取效率高且最常用，故本發(fā)明選擇此三種方法進行比較。

供試品溶液的處理：

超聲處理及加熱回流處理方法：取同一批次樣品，各2g，精密稱定，加入50ml50％甲醇溶液，稱重，分別采用超聲處理(功率250w，頻率40khz)1h，加熱回流1h，放冷，加溶劑補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液20ml，蒸干，殘渣加50％甲醇定容至5ml，取續(xù)濾液，即得。

索氏提取器處理方法：取上述批次樣品2g，精密稱定，加入50ml50％甲醇溶液用索氏提取器提取8h，將提取液傾出，提取液蒸干，殘渣加50％甲醇定容至10ml，取續(xù)濾液，即得。

色譜條件：同上1.4.1。

結(jié)果見表2，采用此三種方法提取紫丁香苷的含量相差不多，因超聲處理法最簡單，故本發(fā)明選擇超聲處理法作為提取方法。

表2不同提取方法提取供試品中紫丁香苷的含量

1.4.3提取時間的考察

提取時間是影響超聲提取效率的重要指標，本發(fā)明選擇3個不同的提取時間，提取方法及色譜條件同1.4.1，結(jié)果見表3。可見，超聲處理30分鐘時紫丁香苷的含量穩(wěn)定，再增加提取時間，含量沒有變化，故選擇提取30分鐘作為超聲提取時間。

表3不同提取時間提取供試品中紫丁香苷的含量

1.4.4樣品取樣量與提取溶劑加樣量的考察

樣品中紫丁香苷含量較低，為了使樣品色譜峰面積合理，減小系統(tǒng)誤差，故本發(fā)明設(shè)定提取溶劑加入量為50ml的前提下，盡量增加樣品取樣量。

設(shè)定樣品取樣量為2g，為了考察紫丁香苷是否能夠提取完全，本發(fā)明將2g樣品加入50％甲醇超聲處理后(超聲提取方法同1.4.1)，濾過，殘渣再加入上述溶劑超聲處理，濾液蒸干，殘渣加入50％甲醇溶解，注入液相色譜儀，色譜儀：agilent1200；流動相：甲醇-水溶液(15：85)；色譜柱：agilentsbc18色譜柱(4.6×250mm，5μm)；檢測波長：265nm；流速：1.0ml/min，柱溫：40℃。結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，在與對照品色譜峰相應的位置上，沒有紫丁香苷的色譜峰，故樣品2g，加入50ml提取溶劑超聲處理后，紫丁香苷被提取完全。

綜上所述，血滯通膠囊樣品中紫丁香苷的提取方法為：供試品2g，加入50％甲醇50ml超聲處理(功率250w，頻率40khz)30分鐘。

1.4.5供試品的色譜檢測條件與純化

1.4.5.1色譜條件的考察

agilentsbc18色譜柱(4.6×250mm，5μm)；色譜儀：agilent1200；波長：265nm；流速：1.0ml/min；柱溫：40℃。

在上述色譜條件基礎(chǔ)上，為了達到基線分離，本發(fā)明考察了多種流動相、流動相比例(均為體積比)；流動相分別為：甲醇-0.4％磷酸緩沖液(20:80)，甲醇-0.4％磷酸緩沖液(15:85)，甲醇-0.4％磷酸緩沖液(10:90)，甲醇-水溶液(10:90)，甲醇-水溶液(20：80)，甲醇-水溶液(15：85)。

結(jié)果見圖2-7。結(jié)果表明，當流動相為甲醇-水(15：85)時，供試品色譜圖中，紫丁香苷的分離度最好。

故本發(fā)明更換其它品牌的色譜柱，考察供試品在其它色譜柱上的分離情況。色譜儀：agilent1200；流動相：甲醇-水溶液(15：85)；色譜柱：insertsustainc18(4.6×250mm，5μm)；檢測波長：265nm；流速：1.0ml/min，柱溫：40℃。結(jié)果見圖8，可見相同的色譜條件，但不同品牌的色譜柱，分離效果差異很大，可能是因為供試品中，雜質(zhì)特別多，極性稍有變化，將極大的影響紫丁香苷的分離度，無法保證在其它儀器及色譜柱上的重現(xiàn)；且供試品溶液中的雜質(zhì)多，對色譜柱的損害大。故為了達到更好的分離效果，供試品需進一步純化去除雜質(zhì)。

1.4.5.2供試品的純化

取裝量差異項下的本品內(nèi)容物，研勻，精密稱取約2g，置具塞錐形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250w，頻率40khz)30分鐘，放冷，再稱定重量，用50％甲醇補足減失的重量，混勻，濾過，濾液備用，即供試品濾液。

①溶劑萃取純化法

上述濾液取10ml，蒸干，殘渣加10ml水溶解并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，依次用三氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和的正丁醇萃取，各萃取2次，各萃取液及水液分別蒸干，溶解后進hplc。色譜儀：agilent1200；流動相：甲醇-水溶液(15：85)；色譜柱：wondacractods-2c18(4.6×250mm，5μm)；檢測波長：265nm；流速：1.0ml/min，柱溫：40℃。結(jié)果見圖9-12。

結(jié)果表明，三氯甲烷和乙酸乙酯萃取液中不含有紫丁香苷，水飽和的正丁醇和水液部分中均含有紫丁香苷，故此方法不能將供試品溶液中雜質(zhì)去除。

②采用spe固相萃取小柱純化

固相萃取小柱為商品化的小柱，雖然價格較貴，但性能較為穩(wěn)定，故本發(fā)明優(yōu)先考慮固相萃取小柱純化樣品。

固相萃取小柱的活化：臨用前用甲醇5ml洗脫，再用10ml水洗脫，放置10分鐘后備用。

供試品濾液10ml，蒸干，殘渣加水定容至5ml，精密吸取1ml經(jīng)過c18固相萃取小柱(1g，6ml)，先用水洗，再用50％甲醇洗脫，分別收集水洗液10ml及50％甲醇洗脫液5ml，過濾，取續(xù)濾液即得。吸取20μl注入液相色譜儀。流動相：甲醇-水(20:80)，流速：1.0ml/min，其它色譜條件：色譜儀：agilent1200；色譜柱：wondacractods-2c18(4.6×250mm，5μm)；檢測波長：265nm；柱溫：40℃。由于供試品中雜質(zhì)特別多，極性稍有變化，將極大的影響紫丁香苷的分離度；另外，流動相極性對紫丁香苷的分離也會產(chǎn)生較大影響，原流動相甲醇-水(15:85)進行分離時，分離效果差異很大，所以確定流動相為：甲醇-水(20:80)。

結(jié)果見圖13-14。如圖所示，水洗脫液中不含有紫丁香苷，且可以除去大部分極性大的雜質(zhì)；50％甲醇洗脫液中含有紫丁香苷，且分離度好，紫丁香苷附近雜質(zhì)少，干擾少，保留時間較短(采用固相萃取小柱純化樣品后，雜質(zhì)減少，應用流動相甲醇：水(20：80)即可達到很好的分離)。

本發(fā)明按照上述純化方法進行大量樣品制備時，發(fā)現(xiàn)同一廠家不同批次的固相萃取小柱對供試品的吸附能力不同，有的批次小柱對樣品并不吸附，水洗脫液中即含有紫丁香苷。本發(fā)明分別考察了兩個廠家的固相萃取小柱，經(jīng)過實驗反復驗證，均有相同情況出現(xiàn)。上述情況表明，固相c18萃取小柱不適宜作為含量測定的純化方法。

③采用中性氧化鋁柱純化

中性氧化鋁是含量測定中常用的純化方法，此純化方法簡便，且中性氧化鋁價格低廉。

供試品溶液處理方法：取供試品濾液的續(xù)濾液10ml，蒸干，殘渣加50％甲醇約5ml分多次加在中性氧化鋁柱(100-200目，4g，內(nèi)徑1cm)上，用50％甲醇90ml洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘渣加50％甲醇定容至2ml量瓶中，搖勻，即得。

本發(fā)明同時分別考察了流動相甲醇-水的不同比例，色譜儀：agilent1200；色譜柱：wondacractods-2c18(4.6×250mm，5μm)；檢測波長：265nm；流速：1.0ml/min，柱溫：40℃；流動相分別為：甲醇-水溶液(20：80)，甲醇-水溶液(17：83)。

結(jié)果見圖15-16。如圖所示，流動相為甲醇-水(20：80)時，紫丁香苷峰并未完全達到基線分離，但在甲醇-水(17：83)時，色譜峰分離度較好，能呈正態(tài)分布。因此，本發(fā)明選擇甲醇-水(17:83)作為流動相。

本發(fā)明進一步考察了中性氧化鋁純化樣品中影響紫丁香含量的重要參數(shù)。

③-①關(guān)于濾液蒸干后再經(jīng)過中性氧化鋁柱

本方法中“取供試品濾液的續(xù)濾液10ml，蒸干，殘渣加50％甲醇約5ml分多次加在中性氧化鋁柱”，本發(fā)明將濾液蒸干后加少量50％甲醇經(jīng)過中性氧化鋁柱，此種方法雖比10ml濾液直接過柱增加一步，但上樣的樣品帶窄，分離效果好。

③-②中性氧化鋁的用量

本發(fā)明考察了中性氧化鋁(3g、4g、5g)的用量，結(jié)果3g的分離效果不如4g、5g好，4g、5g無明顯差異，在同等分離效果的情況下，為了減少吸附，提高回收率，故選擇4g用量。

③-③50％甲醇洗脫用量的考察

為了保證50％甲醇能將紫丁香苷從中性氧化鋁柱上完全洗脫，本發(fā)明考察了洗脫劑的用量。本發(fā)明先收集90ml的流出液及洗脫液，然后再繼續(xù)收集20ml洗脫液，每10ml收集一份，分別蒸干，殘渣加50％甲醇定容至2ml量瓶，取續(xù)濾液，注入液相色譜儀。結(jié)果，收集第100ml、第110ml洗脫液中不含有紫丁香苷。故本發(fā)明收集流出液及洗脫液共90ml時，紫丁香苷即可以被完全洗脫。

1.4.6供試品的色譜檢測條件的確定

綜上所述，本發(fā)明確定了供試品溶液的制備方法以及色譜條件，具體如下：

供試品溶液的制備：取裝量差異項下的本品內(nèi)容物，研勻，精密稱取約2g，置具塞錐形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250w，頻率40khz)30分鐘，放冷，再稱定重量，用50％甲醇補足減失的重量，混勻，濾過，取續(xù)濾液10ml，蒸干，殘渣加50％甲醇約5ml分多次加在中性氧化鋁柱(100-200目，4g，內(nèi)徑1cm)上，用50％甲醇90ml洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘渣加50％甲醇定容至2ml量瓶中，搖勻，即得。

對照品溶液的制備：取紫丁香苷對照品適量，精密稱定，加50％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。

色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水溶液(17：83)為流動相；流速：1.0ml/min；柱溫：40℃；檢測波長為265nm。理論塔板數(shù)按紫丁香苷峰計算應不低于4000。

測定方法：分別精密吸取對照品溶液10μl與供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，進行測定，即得。

定量測定采用外標法，包括：分別精密量取紫丁香苷對照品溶液和供試品溶液一定量，進樣，記錄色譜圖；分別測量紫丁香苷對照品溶液的色譜圖中紫丁香苷的峰面積以及供試品溶液的色譜圖中待測紫丁香苷的峰面積，按下式計算紫丁香苷的含量：cx＝cr×ax/ar；其中，cx為供試品溶液中待測紫丁香苷的濃度，ax為供試品溶液的色譜圖中待測紫丁香苷的峰面積，ar為對照品溶液的色譜圖中紫丁香苷的峰面積，cr為對照品溶液中紫丁香苷的濃度。

2、方法學驗證

2.1耐用性試驗

使用不同廠家/品牌的色譜柱、不同品牌液相色譜儀進行考察：取供試品溶液分別用三個不同品牌的c18色譜柱和兩個不同品牌的高效液相色譜儀，按上述1.4.6確定的方法，進樣，測定；流動相：甲醇-水溶液(17：83)；檢測波長：265nm；流速：1ml/min；柱溫：40℃。色譜儀分別為：agilent1200，shimadzalc-20at；色譜柱及結(jié)果見表4。

表4不同廠家/品牌的色譜柱的考察結(jié)果

圖17-24為不同色譜柱及儀器檢測的對照品及供試品色譜圖。結(jié)果顯示，表4所選用的三種色譜柱均達到方法系統(tǒng)適用性的要求，該方法耐用性良好。

2.2陰性對照溶液的測定

本處方中只含有薤白一味藥材，其它均為輔料，在本發(fā)明色譜條件下(色譜儀：agilent1200；流動相：甲醇-水溶液(17：83)；色譜柱：apolloc18(4.6×250mm,5μm)；檢測波長：265nm；流速：1ml/min；柱溫：40℃)，輔料均沒有干擾峰(圖25)。

2.3理論塔板數(shù)的計算

本品暫定為理論塔板數(shù)不低于4000。

2.4精密度試驗

精密吸取供試品溶液20μl，注入液相色譜儀(色譜條件同1.4.6)，重復6次，測定其色譜峰面積值，結(jié)果(表5)紫丁香苷峰面積積分值rsd<2.0％，表明儀器進樣精密度良好。

表5精密度試驗結(jié)果

2.5穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0、2、6、10、12、18、24h按本發(fā)明確定的色譜條件測定，結(jié)果(表6)供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表6穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.6線性關(guān)系考察

分別精密吸取對照品溶液(0.0208mg/ml)1、5、10、15、20、25μl，在本發(fā)明色譜條件下測定(色譜儀：agilent1200，色譜柱：apolloc18(4.6×250mm,5μm))，以對照品進樣量為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，紫丁香苷回歸方程為y＝2224.8x-2.2037(r＝1)，表明紫丁香苷在0.0208-0.52μg范圍內(nèi)，進樣量與峰面積呈線性關(guān)系，符合外標法定量測定的要求(表7、圖26)。

表7紫丁香苷標準曲線數(shù)據(jù)

2.7重復性試驗

取同一批供試品(批號：20130705)，按本發(fā)明確定的方法獨立測定6份，結(jié)果(表8)紫丁香苷平均含量為53.55μg/g(rsd＝2.52％，n＝6)，表明本法的重復性良好。

表8重復性試驗結(jié)果

2.8回收率試驗

采取半量加樣回收法，取已知含量的供試品(批號：20130705含紫丁香苷53.55μg/g)1.0g，共6份，分別置具塞錐形瓶中，精密量取對照品的50％甲醇溶液(紫丁香苷5.20mg→10ml，再取1ml→10ml)1ml，再分別精密加入50％甲醇溶液49ml，稱定重量，依本發(fā)明方法測定回收率。結(jié)果(表9)測得紫丁香苷的平均回收率為92.96％，rsd＝1.51％。結(jié)果表明本發(fā)明方法回收率較好，準確度較高。

表9紫丁香苷回收率試驗結(jié)果

2.9樣品測定結(jié)果及限度

按本發(fā)明確定的紫丁香苷含量測定方法，測定了20個批次的血滯通膠囊中的紫丁香苷的含量。測定結(jié)果見表10，樣品的平均含量17.34μg/粒。

考慮到血滯通膠囊大生產(chǎn)過程中的損耗、樣品的存放及藥材的來源等各方面的影響，綜合以上因素，暫定限度為：本品每粒以紫丁香苷(c17h24o9)計，不得少于15.0μg。

表10二十批樣品中紫丁香苷含量測定結(jié)果

2.10藥材測定結(jié)果及轉(zhuǎn)移率

按本發(fā)明確定的紫丁香苷含量測定方法，測定了10批薤白藥材中紫丁香苷的含量。測定結(jié)果見表11，藥材的平均含量2.71μg/g。本制劑的工藝是8000g薤白藥材制成1000粒膠囊，故紫丁香苷的轉(zhuǎn)移率為80.01％。

表11十批薤白藥材中紫丁香苷含量測定結(jié)果