本發(fā)明屬于藥物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種離子流色譜的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

雷公藤紅素是雷公藤的主要成分，是其有效成分也是其毒性成分，在抗腫瘤、免疫抑制、抗炎及神經(jīng)退行性疾病等領(lǐng)域有良好的作用，課題組前期研究成果顯示不同產(chǎn)地雷公藤毒價(jià)與其成分相關(guān)性，研究結(jié)果顯示雷公藤紅素、雷公藤甲素是造成肝毒性的主要成分，本研究與其實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

雷公藤紅素和雷公藤甲素既是雷公藤毒性成分，又是其有效成分，并且與劑量有依賴性，在不同劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出不同的作用。

甘草炮制雷公藤后，其成分溶出增多，控制其劑量的同時(shí)增強(qiáng)雷公藤活性成分。炮制后雷公藤紅素和雷公藤甲素含量升高，但對(duì)l02細(xì)胞毒性并未增強(qiáng)，原因可能是甘草炮制雷公藤使雷公藤甲素和雷公藤紅素含量升高，但并未升高至表現(xiàn)毒性的范圍，而是表現(xiàn)出增效的過程，其結(jié)果有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

鐘麗芳研究發(fā)現(xiàn)雷公藤酯甲對(duì)cona和lps誘導(dǎo)的t淋巴細(xì)胞、b淋巴細(xì)胞增值有較強(qiáng)的免疫抑制作用。

王曉玉等研究新風(fēng)膠囊配伍雷公藤后，雷公藤內(nèi)雷公藤酯甲含量降低，并且未發(fā)現(xiàn)雷公藤不良反應(yīng)，表明其可能與雷公藤毒性有一定的相關(guān)性。炮制后雷公藤酯甲含量較炮制前低，且藥材細(xì)胞抑制率降低，表明雷公藤酯甲可能是引起肝毒性的主要物質(zhì)，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。雷公藤晉堿炮制后含量降低，藥材細(xì)胞抑制率也降低，考慮其可能與甘草炮制減毒作用相關(guān)。

鄭幼蘭等研究發(fā)現(xiàn)雷公藤中雷公藤春堿是一種免疫抑制劑，對(duì)體液免疫具有明顯的抑制作用，但雷公藤春堿未見肝毒性報(bào)道。炮制前后雷公藤春堿含量沒有明顯改變，考慮其與甘草炮制雷公藤減毒機(jī)制無相關(guān)性較小。雷公藤次堿具有抗炎效應(yīng)，炮制后雷公藤次堿含量升高，且抑制率降低，提示甘草炮制雷公藤后可增強(qiáng)雷公藤抗炎效應(yīng)，進(jìn)而減輕其引起的肝損傷程度。綜上所述，雷公藤晉堿、雷公藤酯甲對(duì)甘草炮制雷公藤減毒有較大影響。雷公藤毒性與產(chǎn)地有一定的相關(guān)性。

本研究是采用了優(yōu)選的離子流色譜的應(yīng)用方法，并在雷公藤9種炮制品的基礎(chǔ)上進(jìn)行分析，開拓了離子流色譜的應(yīng)用新領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種離子流色譜的應(yīng)用，其特征在于：包括如下步驟：

(1)用純品配制已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液；

(2)制備粗提物，

粗提物的制備方法為

以溶劑、水、甲醇或乙醇萃取新鮮的產(chǎn)品，再濃縮得到粗提物；

將粗提物置于索氏提取器中，依次用石油醚、乙醚和氯仿分別進(jìn)行回流提取2～3小時(shí)，殘余物加水溶解過濾去除雜質(zhì)，并經(jīng)適當(dāng)稀釋，即得待測樣品液，

(3)將標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行hplc-esi/ms分析，再積分計(jì)算得到該標(biāo)準(zhǔn)液的保留時(shí)間、質(zhì)量數(shù)，計(jì)算提取離子流色譜峰的積分面積，即標(biāo)準(zhǔn)面積a1；

(4)將待測樣品液進(jìn)行同樣條件的hplc-esi/ms分析，以標(biāo)準(zhǔn)液的保留時(shí)間、質(zhì)量數(shù)的對(duì)照，再積分計(jì)算得到該待測樣品保留時(shí)間、質(zhì)量數(shù)，提取離子流色譜峰的積分面積，即樣品面積a2；

(5)將標(biāo)準(zhǔn)面積a1和樣品面積a2進(jìn)行比較，得出待測樣品液中待測物質(zhì)的含量，計(jì)算公式如下

待測樣品液中待測物的含量＝標(biāo)準(zhǔn)液中待測物的含量×a2/a1；

(6)根據(jù)待測物待測樣品液中待測物的含量計(jì)算得出待測的產(chǎn)品中的待測物的含量。

本發(fā)明提供一種離子流色譜的應(yīng)用，其特征在于：所述粗提物的制備方法為：以溶劑在40℃的溫度下超聲提取，再真空濃縮，即得所述粗提物。

本發(fā)明提供一種離子流色譜的應(yīng)用，其特征在于：提取雷公藤主要成分的樣品的離子流色譜圖鑒定了：雷公藤甲素、雷公藤堿戊、雷公藤春堿、雷公藤堿、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷酚內(nèi)酯、demethylzeylasteral、雷公藤紅素、雷公藤脂甲；

本發(fā)明提供一種離子流色譜的應(yīng)用，其特征在于：提取雷公藤主要成分的樣品的離子流色譜圖鑒定了：雷公藤甲素、雷公藤堿戊、雷公藤春堿、雷公藤堿、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷酚內(nèi)酯、demethylzeylasteral、雷公藤紅素、雷公藤脂甲；

超聲提取雷公藤樣品，配制成1mg/ml的雷公藤溶液，0.22μm濾膜過濾，備用，

色譜條件：色譜柱xselecthsst33.5μm；2.1x100mmcolumnwaters

流動(dòng)相：a0.1％的甲酸水；b0.1％的甲酸乙腈

檢測波長：254nm；柱溫：40℃；流速：0.2ml/min；進(jìn)樣量：8μl；

液相梯度洗脫程序：

質(zhì)譜條件

電離模式：esi±；掃描范圍：100-1000m/z；離子源電壓：4.5kv；霧化器流量：1.5l/min；干燥器n2：100kpa；脫溶劑部溫度：200℃；ionaccumulationtime：30msec；cidenergy：50％；檢測器電壓1.80-2.10kv。

本發(fā)明涉及一種雷公藤提取物方法：

稱取600g雷公藤生藥材，打粉機(jī)打碎成大小約2～3cm左右的不規(guī)則條塊兒狀，8倍體積60％的乙醇浸泡12h，超聲提取3次，每次45min，合并3次濾液，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積后，冷凍干燥成粉末，備用。(1.1)

本發(fā)明涉及甘草配伍雷公藤制備方法：

(1)雷公藤：甘草＝3:1：稱取雷公藤藥材粗顆粒600g，打粉機(jī)打碎成粗顆粒狀，生甘草片200g，置于同一容器，8倍體積60％的乙醇浸泡12h后，超聲提取3次，每次45min，過濾，合并3次濾液，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積后，冷凍干燥成粉末，備用；或

(2)雷公藤：甘草＝6:1：稱取雷公藤藥材粗顆粒600g，打粉機(jī)打碎成粗顆粒狀，生甘草片100g，置于同一容器，8倍體積60％的乙醇浸泡12h后，超聲提取3次，每次45min，過濾，合并3次濾液，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積后，冷凍干燥成粉末，備用；

(3)雷公藤：甘草＝9:1：稱取雷公藤藥材粗顆粒600g，打粉機(jī)打碎成粗顆粒狀，生甘草片66.6667g，置于同一容器，8倍體積60％的乙醇浸泡12h后，超聲提取3次，每次45min，過濾，合并3次濾液，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積后，冷凍干燥成粉末，備用。

甘草炮制雷公藤制備方法：

稱取雷公藤生藥材600g，雷公藤打碎成大小約2～3cm左右的不規(guī)則條塊兒狀，及生甘草飲片200g。

炮制方法如下：

①甘草汁制備方法：8倍體積的純凈水浸泡甘草飲片30min，每次煎煮20min，煎煮液濾出，相同步驟重復(fù)煎煮兩次后合并濾液，濃縮至合適體積，甘草汁的量需能完全浸泡雷公藤，備用。

②甘草汁炮制雷公藤方法：用上述所得甘草汁浸泡雷公藤，待甘草汁基本被雷公藤藥材吸盡，炒10min至雷公藤藥材表面不粘手，得雷公藤炮制品。

③雷公藤炮制樣品的提取方法：取出炮制后的雷公藤藥材按(1.1)提取方法提取，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積后，冷凍干燥成粉末，備用。

附圖說明

圖1雷公藤甲素正離子模式下提取離子流圖m/z:361.1640

圖2雷公藤堿戊正離子模式下提取離子流圖m/z:780.2709

圖3雷公藤春堿正離子模式下提取離子流圖m/z:874.2764

圖4雷公藤堿正離子模式下提取離子流圖m/z:884.2972

圖5雷公藤晉堿正離子模式下提取離子流圖m/z:858.2815

圖6雷公藤次堿正離子模式下提取離子流圖m/z:868.3022

圖7雷酚內(nèi)酯正離子模式下提取離子流圖m/z:313.1798

圖8demethylzeylasteral正離子模式下提取離子流圖m/z:481.2585

圖9雷公藤紅素正離子模式下提取離子流圖m/z:451.2843

圖10雷公藤酯甲正離子模式下提取離子流圖m/z:455.3520

圖11不同比例甘草配伍雷公藤樣品對(duì)l02細(xì)胞的抑制率

圖12高內(nèi)涵染色技術(shù)分析雷公藤不同樣品對(duì)肝細(xì)胞的作用

圖13雷公藤不同樣品的細(xì)胞抑制率

圖14不同比例甘草炮制雷公藤對(duì)l02細(xì)胞抑制率

圖15小鼠肝組織石蠟切片he染色光鏡觀察結(jié)果

圖16小鼠血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果

圖17大鼠肝組織石蠟切片he染色光鏡觀察結(jié)果

圖18大鼠血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果

圖19大鼠血清中炎癥因子il-1β、il-6、tnf-α檢測結(jié)果

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1甘草汁提取工藝篩選

藥材信息及試劑

生甘草飲片購自于北京友誼醫(yī)院中藥房，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院趙奎君教授鑒定為豆科植物甘草glycyrrhizauralensisfisch的干燥根。

甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品：批號(hào)：151014，購自于成都普非德生物技術(shù)有限公司。

甲醇、乙腈為色譜級(jí)，其余試劑為分析純，水為超純水。實(shí)驗(yàn)方法

甘草汁提取工藝篩選

表1甘草汁提取工藝設(shè)計(jì)因素和水平表

根據(jù)甘草汁制備工藝特點(diǎn)，選擇浸泡時(shí)間，加水量，煎煮時(shí)間，煎煮次數(shù)為考察因素，見(表1)。每個(gè)因素各取3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以甘草酸提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇l9(3⁴)正交表(見表2)，稱取生甘草飲片9份，每份30g，按(表2)煎煮，濃縮至相同體積，備用。

甘草酸含量的測定

表2正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

儀器條件：

色譜柱：島津odsc18150mm×4.6mm/5um

流動(dòng)相：a(0.1％甲酸)水；b(0.1％甲酸乙腈)

流速：0.8ml/min；柱溫：40℃；檢測波長：254nm；進(jìn)樣量：5μl。

流動(dòng)相條件：見表3

表3梯度洗脫條件

對(duì)照品溶液的制備

取甘草酸標(biāo)品25mg，精密稱定，置于5ml容量瓶中，加純凈水5ml，超聲溶解，補(bǔ)加溶劑至刻度，搖勻，0.22μm濾膜過濾，配制成5mg/ml的對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備。

按表2制備的9份甘草汁分別渦旋混勻，各取2ml，0.22μm濾膜過濾，備用。

方法學(xué)考察

選擇出峰時(shí)間穩(wěn)定、峰面積大、分離度較好的色譜峰作為共有峰，對(duì)其相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

精密度試驗(yàn)

取1號(hào)甘草汁，按色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間一致，相對(duì)峰面積的rsd小于3％，實(shí)驗(yàn)精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)

取1號(hào)甘草汁6份，按色譜條件分別進(jìn)樣，結(jié)果顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間一致，相對(duì)峰面積的rsd小于3％，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1號(hào)甘草汁6份，按色譜條件，分別在0、4、8、12、16、24h，6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測定。結(jié)果顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間一致，相對(duì)峰面積的rsd小于3％，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性良好。

線性關(guān)系考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別精密配制對(duì)照品溶液濃度為5，2.5，1，0.5，0.25ml的對(duì)照品溶液，搖勻。分別進(jìn)樣，測定峰面積。

以峰面積(a)為橫坐標(biāo)，濃度(c)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：

c＝6×10^-6a+0.0407，r²＝0.9985。

結(jié)果顯示，33min處為甘草酸保留時(shí)間，其保留時(shí)間穩(wěn)定，峰型較好。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

9種提取方法中，甘草酸保留時(shí)間穩(wěn)定，分離效果較好，基本達(dá)到基線。采用島津lcms-solution工作站，對(duì)9種不同提取方法中甘草酸峰面積進(jìn)行積分，計(jì)算峰面積，比較發(fā)現(xiàn)9種不同提取工藝甘草酸峰面積差異較大。

表49批樣品中檢測到的甘草酸濃度及含量

表4結(jié)果顯示：9種不同提取工藝其甘草酸峰面積差異較大，通過計(jì)算，3號(hào)、4號(hào)、7號(hào)、8號(hào)樣品中甘草酸含量較高，8號(hào)樣品中甘草酸含量最高。

甘草汁提取工藝的篩選

炮制工藝極差分析

表5炮制工藝極差分析

結(jié)果顯示4因素中煎煮次數(shù)對(duì)甘草酸含量影響較大，其次分別是浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、加水量。因素1最優(yōu)水平為3水平，因素2最優(yōu)水平為2水平，因素3最優(yōu)水平為3水平，因素4最優(yōu)水平為3水平，最優(yōu)組合為a3b2c3d3。

甘草汁提取工藝方差分析結(jié)果

表6主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)

a.r²＝0.882(調(diào)整r²＝0.861)

b.*表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)；**表示有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)

表6結(jié)果顯示：方差分析結(jié)果顯示a因素(浸泡時(shí)間)、c因素(煎煮時(shí)間)、d因素(煎煮次數(shù))對(duì)提取工藝中甘草酸含量有影響(p＜0.05)；b因素(加水量)對(duì)提取工藝中甘草酸含量無影響。

綜上所述，結(jié)合極差分析及方差分析結(jié)果甘草汁制備最佳工藝為a3b2c3d3

浸泡時(shí)間：30min；加水量：8倍水；煎煮時(shí)間60min；煎煮次數(shù)3次。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照上述煎煮條件進(jìn)行驗(yàn)證，在相同色譜條件下進(jìn)樣5μl，測定結(jié)果為每克甘草中的甘草酸含量為28.533mg/g，較9種提取工藝都好。

實(shí)施例2正交試驗(yàn)優(yōu)選甘草炮制雷公藤工藝

實(shí)驗(yàn)儀器

lcms-it-tof高效液相色儀串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(日本島津)、xs205電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)、dtf-200型手提式高速萬能粉碎機(jī)(浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司)、kq5200e型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、101-1a型型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、mt-4612紅外線測溫儀(上海寶工實(shí)業(yè)股份有限公司)。

藥材

雷公藤生藥材購自福建三明，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院趙奎君教授鑒定，為衛(wèi)矛科雷公藤tripterygiumwilfordii的干燥根；

生甘草飲片購自于北京友誼醫(yī)院中藥房，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院趙奎君教授鑒定為豆科植物甘草glycyrrhizauralensisfisch的干燥根。

試劑

mts檢測試劑盒(promega，批號(hào)：0000113740)，rpmi1640完全培養(yǎng)基，胰蛋白酶(gibco)，胎牛血清(gibco)，青霉素，鏈霉素，二甲基亞砜(dmso)，對(duì)乙酰氨基酚(購自中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100018-201409)，無水乙醇，錫箔紙，除菌濾器(25mm，0.22μm，津騰)，去離子水經(jīng)(18.2mω)milliporemilli-q系統(tǒng)(milliporeco.美國)超凈水器凈化。

實(shí)驗(yàn)方法

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)甘草汁炮制雷公藤制備工藝特點(diǎn)，選擇浸泡時(shí)間(d)，甘草汁的量(ml)，炒溫(℃)，炒時(shí)(min)為考察因素，每個(gè)因素各取3個(gè)水平(見表7)，進(jìn)行正交試驗(yàn)；以炮制后雷公藤對(duì)l02細(xì)胞的抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇l9(3⁴)正交表，(見表8)。稱取9份雷公藤，每份約85～90g(打碎成小塊狀)，甘草約30g，甘草汁按之前實(shí)施例2篩選的結(jié)果工藝進(jìn)行煎煮，煎煮體積按表8。

表7甘草汁炮制雷公藤工藝設(shè)計(jì)因素和水平表

表8正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表7、8中甘草汁體積按雷公藤的質(zhì)量計(jì)算，本實(shí)驗(yàn)中50ml為浸泡雷公藤1/2的體積，85ml為雷公藤完全被浸泡的體積，170ml為2倍體積浸泡雷公藤。

樣品制備及出膏率計(jì)算

2.1.1雷公藤提取物制備

稱取適量雷公藤生藥材，打粉機(jī)打碎成粗顆粒狀，8倍體積60％的乙醇，超聲45min，提取3次，合并濾液，減壓濃縮回收乙醇,真空干燥得粗提物,雷公藤提取率為7.62％，臨用前用去離子水配制成相應(yīng)濃度(按雷公藤生藥量配制)。

2.1.2甘草汁炮制雷公藤樣品制備

稱取適量雷公藤生藥材(打粉機(jī)打碎成不規(guī)則條塊兒狀)及生甘草飲片，雷公藤:甘草＝3:1。

①8倍體積的純凈水浸泡甘草飲片30min，煎煮20min，煎煮液濾出，相同步驟煎煮3次后合并濾液，濃縮至合適體積，甘草汁的量需能完全浸泡雷公藤，備用。

②取制備好的甘草汁浸泡雷公藤生藥材0.5h-12h，待甘草汁基本被雷公藤藥材吸盡，100℃，炒10min至雷公藤藥材表面不粘手，得雷公藤炮制品。提取方法同(2.1.1)，臨用前配制成相應(yīng)濃度(按雷公藤生藥量配制)。

9種炮制品炮制后藥材用8倍體積60％的乙醇，超聲45min，提取3次，合并濾液，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積后，冷凍干燥，并計(jì)算藥材出膏率，備用。

表99種方法炮制雷公藤出膏率

實(shí)施例3離子流色譜在分析甘草炮制雷公降低其肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)的初步研究

實(shí)驗(yàn)儀器

lcms-it-tof高效液相色儀串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(日本島津)、xs205電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、dtf-200型手提式高速萬能粉碎機(jī)(浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司)、kq5200e型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、數(shù)顯控溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)、101-1a型型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)、re-52a旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、循環(huán)水真空泵(上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司)、去離子水經(jīng)(18.2mω)milliporemilli-q系統(tǒng)(milliporeco.美國)超凈水器凈化。

藥材信息及試劑

雷公藤生藥材購自福建三明，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院趙奎君教授鑒定，為衛(wèi)矛科雷公藤tripterygiumwilfordiihook.f.的干燥根；

生甘草飲片購自于北京友誼醫(yī)院中藥房，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院趙奎君教授鑒定為豆科植物甘草glycyrrhizauralensisfisch的干燥根。

甲醇、乙腈為色譜級(jí)，其余試劑為分析純，水為超純水。

實(shí)驗(yàn)方法

基于課題組前期研究方法采用液質(zhì)聯(lián)用的技術(shù)檢測雷公藤主要成分并記錄其相對(duì)峰面積。

實(shí)驗(yàn)樣品

譜效相關(guān)分析待測樣品

待測樣品為實(shí)施例2種炮制的9種炮制品，編號(hào)為①-⑨，超聲提取雷公藤樣品①-⑨，配制成1mg/ml的雷公藤溶液，0.22μm濾膜過濾，備用。

炮制前后雷公藤主要成分含量比較樣品

按照實(shí)施例2中實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選的方法(即按雷公藤與甘草3:1的比例,分別取各自飲片適量，甘草飲片加8倍體積水，浸泡30min，分3次煎煮，每次煎煮60min，合并煎煮液，減壓濃縮與雷公藤質(zhì)量比為1:1，得甘草汁；將甘草汁加入雷公藤飲片中，浸泡12h,不斷攪拌，使雷公藤飲片與甘草汁充分接觸，待甘草汁充分吸收，于100℃，炒約10min,至雷公藤表面不粘手為度，晾干，備用。)制備雷公藤樣品及炮制品。

實(shí)驗(yàn)條件

色譜條件：色譜柱xselecthsst33.5μm；2.1x100mmcolumnwaters

流動(dòng)相：a0.1％的甲酸水；b0.1％的甲酸乙腈

檢測波長：254nm；柱溫：40℃；流速：0.2ml/min；進(jìn)樣量：8μl；

液相梯度洗脫程序：(見表10)

表10液相梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件

電離模式：esi±；掃描范圍：100-1000m/z；離子源電壓：4.5kv；霧化器流量：1.5l/min；

干燥器(n2)：100kpa；脫溶劑部溫度：200℃；ionaccumulationtime：30msec；cid

energy：50％；檢測器電壓1.80-2.10kv。

方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)

?、偬?hào)樣品，按上述色譜條件和梯度洗脫程序連續(xù)測定6次，計(jì)算共有峰的相對(duì)峰面積與保留時(shí)間。顯示共有峰的相對(duì)保留時(shí)間一致，相對(duì)峰面積的rsd均小于3％，方法精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)

平行制備6份①號(hào)樣品做為供試品溶液，按上述色譜條件和梯度洗脫程序進(jìn)行測定，記錄保留時(shí)間并計(jì)算各共有峰色譜峰的相對(duì)峰面積。顯示共有峰保留時(shí)間一致，相對(duì)峰面積的rsd小于3％，方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)

?、偬?hào)樣品制備好后，按上述色譜條件和梯度洗脫程序，在第0h、2h、6h、12h、16h、24h進(jìn)行測定，記錄保留時(shí)間并計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積。顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間一致，相對(duì)峰面積的rsd均小于3％，表明供試品24h內(nèi)穩(wěn)定。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)通過提取雷公藤主要成分的離子流色譜圖初步鑒定了樣品中10種主要成分，分別為雷公藤甲素、雷公藤堿戊、雷公藤春堿、雷公藤堿、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷酚內(nèi)酯、demethylzeylasteral、雷公藤紅素、雷公藤脂甲。(見圖1-10)

正離子模式下10種主要成分提取離子流圖(eic)

表11雷公藤10種有效成分的提取

表12正離子模式下9批樣品中雷公藤10種主要成分峰面積

為9批樣品中雷公藤10種主要成分峰面積，采用島津公司lcmssolution工作站軟件進(jìn)行色譜峰檢測識(shí)別，積分計(jì)算峰面積。

實(shí)施例4正常人肝l02細(xì)胞的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法

采用l02人正常肝細(xì)胞，在含有10％的胎牛血清、100u·ml^-1的青霉素、100μg·ml^-1的鏈霉素的培養(yǎng)基中，37℃、5％co2條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞生長對(duì)數(shù)期進(jìn)行。細(xì)胞均勻接種在96孔板中，每孔5000個(gè)細(xì)胞，鋪板24h后給藥(由于雷公藤提取物不易溶于水，每孔細(xì)胞加入0.1％的dmso助溶)，待給藥24h后進(jìn)行熒光染色。

采用二重?zé)晒鈽?biāo)記法，用濃度為1μmol·l^-1的orangenucleicacidstain(abs/em:547/570nm)標(biāo)記死細(xì)胞的細(xì)胞核顯橙色，用質(zhì)量濃度為1μg·ml^-1的hochest33342(ex/em:350/461nm)標(biāo)記所有細(xì)胞的細(xì)胞核顯藍(lán)色，于37℃避光孵育15min后，由高內(nèi)涵儀器直接對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像分析。記錄結(jié)果，并分析各孔的細(xì)胞存活情況。

細(xì)胞抑制率檢測方法按試劑盒方法進(jìn)行。

數(shù)據(jù)分析及處理

用imagexpressmicroxl高內(nèi)涵軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以graphpadprism5.0、originpro8.5、ibmspssstatistics20軟件處理，所有數(shù)據(jù)均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，設(shè)p＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)驗(yàn)設(shè)10個(gè)濃度梯度，分別為(12、9、6、3、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625)mg·ml^-1，使用imagexpressmicroxl高內(nèi)涵儀器，二重?zé)晒鈽?biāo)記法，hochest33342標(biāo)記所有細(xì)胞，orangenucleicacidstain標(biāo)記死細(xì)胞，以每孔活細(xì)胞的百分比作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用graphpadprism5.0軟件處理，結(jié)果為：logic50值為-0.1273，計(jì)算ic50為0.746mg·ml^-1。

雷公藤配伍甘草對(duì)肝細(xì)胞減毒作用的比例篩選

為進(jìn)一步篩選甘草減弱雷公藤對(duì)肝細(xì)胞毒性作用的適宜比例，本實(shí)驗(yàn)采用雷公藤對(duì)l02細(xì)胞的ic50值(0.746mg·ml^-1)與不同濃度的甘草進(jìn)行配伍，雷公藤與甘草的比例分別是0.75:0.25mg/ml(3:1)，0.75:0.125mg/ml(6:1)，0.75:0.083mg/ml(9:1)。

3:1與6:1的比例在肝細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)上都能達(dá)到有效的減毒效果。但考慮到甘草在體內(nèi)的首過效應(yīng)等問題，為保證體內(nèi)減毒效果，故選擇較大的甘草的比例(雷公藤與甘草比例：3:1)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

雷公藤不同樣品作用于肝細(xì)胞的毒性情況，雷公藤不同樣品作用于肝細(xì)胞的高內(nèi)涵成像結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)取雷公藤對(duì)肝細(xì)胞毒性的ic50值濃度為0.75mg·ml^-1，對(duì)乙酰氨基酚3mg·ml^-1作為肝細(xì)胞毒性的陽性對(duì)照，甘草與雷公藤的配伍比例為1:3，甘草汁炮制雷公藤的比例為1:3，分析比較雷公藤單用、甘草炮制雷公藤、雷公藤配伍甘草作用于細(xì)胞的毒性差異。

配制高濃度的雷公藤溶液，稀釋為0.75mg·ml^-1(含0.1％的dmso)，配制含等濃度雷公藤的甘草汁炮制品(雷公藤炮品)和雷公藤配伍甘草的樣品(雷公藤配品)，稀釋的終濃度樣品同樣含有0.1％的dmso，陽性對(duì)照和空白對(duì)照也加入0.1％的dmso。將各樣品均勻加入到預(yù)先種好的細(xì)胞中，復(fù)6孔，24h后染色分析。用imagexpressmicroxl高內(nèi)涵儀器分析，采用二重?zé)晒鈽?biāo)記法(hochest33342標(biāo)記所有細(xì)胞顯藍(lán)色，orangenucleicacidstain標(biāo)記死細(xì)胞顯橙色)，以細(xì)胞抑制率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用originpro8.5軟件作圖。

從細(xì)胞核染色情況來看，陽性對(duì)照組與雷公藤組的細(xì)胞毒性作用較大，死細(xì)胞數(shù)目較多，而甘草配伍雷公藤組與甘草炮制雷公藤炮品組的死細(xì)胞數(shù)目相對(duì)較少，則藥物對(duì)細(xì)胞毒性較小。

細(xì)胞抑制率反映出對(duì)乙酰氨基酚和雷公藤對(duì)細(xì)胞的毒性作用大，甘草炮制雷公藤與雷公藤組比較，可有效減低肝細(xì)胞的毒性(p＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其減毒效果與雷公藤配伍甘草相當(dāng)。

按照雷公藤與甘草為3:1，6:1，9:1(即稱取適量雷公藤生藥材(打粉機(jī)打碎成不規(guī)則條塊兒狀)及生甘草飲片，分別為雷公藤:甘草＝3:1，6:1與9:1。8倍體積的純凈水浸泡甘草飲片30min，煎煮20min，煎煮液濾出，相同步驟煎煮3次后合并濾液，濃縮至合適體積，甘草汁的量需能完全浸泡雷公藤，備用。取制備好的甘草汁浸泡雷公藤生藥材0.5h-12h，待甘草汁基本被雷公藤藥材吸盡，100℃，炒10min至雷公藤藥材表面不粘手，得雷公藤炮制品。)，三個(gè)比例，給藥，每個(gè)比例設(shè)6孔，進(jìn)行比較。

不同比例甘草炮制雷公藤與雷公藤組比較，雷公藤與甘草用量比為3:1與6：1時(shí)可有效降低雷公藤對(duì)肝細(xì)胞的毒性(p＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(見圖11-14)

實(shí)施例5

雷公藤生藥材購自福建三明，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院趙奎君教授鑒定，為衛(wèi)矛科雷公藤tripterygiumwilfordiihook.f.的干燥根；

生甘草飲片購自于北京友誼醫(yī)院中藥房，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院趙奎君教授鑒定為豆科植物甘草glycyrrhizauralensisfisch的干燥根。protectiveeffectsofgeniposideagainsttripterygiumglycosides-inducedliverinjuryanditsmechanisms

實(shí)驗(yàn)試劑

血清白蛋白檢測試劑盒；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶檢測試劑盒；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

大鼠白介素1β酶聯(lián)免疫試劑盒(ratinterleukin1βelisakit)，批號(hào)(w07036997)；大鼠白介素6酶聯(lián)免疫試劑盒(ratinterleukin6elisakit)批號(hào)(w09036996)；大鼠腫瘤壞死因子-α酶聯(lián)免疫試劑盒(tnf-αelisakit)批號(hào)(u27036998)(cusabio)；無水乙醇，純凈水。

實(shí)驗(yàn)方法

樣品制備

雷公藤提取物制備

稱取適量雷公藤生藥材，打粉機(jī)打碎成粗顆粒狀，8倍體積60％的乙醇，超聲45min，提取3次，合并濾液，減壓濃縮回收乙醇,真空干燥得粗提物,雷公藤提取率為7.62％，臨用前用去離子水配制成相應(yīng)濃度(按雷公藤生藥量配制)。

甘草汁炮制雷公藤樣品制備

稱取適量雷公藤生藥材(打粉機(jī)打碎成不規(guī)則條塊兒狀)及生甘草飲片，雷公藤:甘草＝3:1。

①8倍體積的純凈水浸泡甘草飲片30min，煎煮20min，煎煮液濾出，相同步驟煎煮3次后合并濾液，濃縮至合適體積，甘草汁的量需能完全浸泡雷公藤，備用。

②取制備好的甘草汁浸泡雷公藤生藥材0.5h-12h，待甘草汁基本被雷公藤藥材吸盡，100℃，炒10min至雷公藤藥材表面不粘手，得雷公藤炮制品。提取方法同2.1.1，臨用前配制成相應(yīng)濃度(按雷公藤生藥量配制)。

小鼠預(yù)實(shí)驗(yàn)(給藥劑量的確定)

spf級(jí)雄性小鼠50只，體重20±2g，正常飼養(yǎng)5天，隨機(jī)分成5組(n＝10)，空白組、低劑量組(3g/kg)、中劑量組(6g/kg)、高劑量組(12g/kg)和超高劑量(24g/kg)(以雷公藤生藥材計(jì))，連續(xù)給藥14天。

草汁炮制雷公藤減毒小鼠實(shí)驗(yàn)

spf級(jí)雄性小鼠30只，體重20±2g，正常飼養(yǎng)5天，隨機(jī)分成3組(n＝10)，空白組、雷公藤組(15g/kg)、甘草炮制雷公藤組(15g/kg)(以雷公藤生藥材計(jì))，連續(xù)給藥14天。

甘草汁炮制雷公藤減毒大鼠實(shí)驗(yàn)

sd大鼠，spf級(jí)，180±20g，30只，正常飼養(yǎng)5天，隨機(jī)分成3組(n＝10)，空白組、雷公藤組(15g/kg)、甘草炮制雷公藤組(15g/kg)(以雷公藤生藥材計(jì))，連續(xù)給藥14天。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于中國人民解放軍第三〇二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。每天上午9:00-10:00間灌胃，正常組每天給予等量生理鹽水。

肝組織病理形態(tài)學(xué)檢查

取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織1.5cm×1cm×0.5cm，10％甲醛固定,常規(guī)病理切片,he染色,光鏡下觀察，拍照。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取血及血清處理

實(shí)驗(yàn)組小鼠及大鼠給藥兩周后在灌胃后一天眼眶取血，冷凍離心(4℃，3500rpm，10min)，取上清，全自動(dòng)生化及酶標(biāo)儀檢測ast、alt、alb、cre、bun、urea。炎癥因子il-1β、il-6、tnf-α檢測按照試劑盒說明進(jìn)行。

統(tǒng)計(jì)分析方法

采用spss18.0軟件統(tǒng)計(jì)，各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，進(jìn)行組間數(shù)據(jù)比較，若符合正態(tài)分布用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料單因素方差分析。兩樣本比較，其中方差齊性者采用lsd法檢驗(yàn)，方差不齊者采用dulmet.s法檢驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同給藥劑量小鼠存活率結(jié)果

超高劑量組在第8d所有實(shí)驗(yàn)小鼠已全部死亡，存活率為0％；高劑量組實(shí)驗(yàn)小鼠2周存活率為90％，中劑量組實(shí)驗(yàn)小鼠2周存活率為90％；低劑量組實(shí)驗(yàn)小鼠2周存活率為90％；空白組實(shí)驗(yàn)小鼠2周存活率為100％；因此實(shí)驗(yàn)組(小鼠實(shí)驗(yàn)及大鼠實(shí)驗(yàn))給藥劑量在高劑量組12g/kg(以雷公藤生藥材計(jì))基礎(chǔ)上提高為15g/kg(以雷公藤生藥材計(jì))給藥。

甘草汁炮制雷公藤減毒小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖15)

空白對(duì)照組小鼠肝組織著色均勻、肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、肝索排列整齊、肝細(xì)胞形態(tài)完好。雷公藤組肝索排列明顯紊亂，炎細(xì)胞浸潤、結(jié)構(gòu)破壞、肝細(xì)胞渾濁、伴有大量水腫和脂肪變性，大量片狀萎縮壞死、胞漿內(nèi)有明顯的大小不等的空泡以及數(shù)量不一的肝細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；肝組織呈輕微嗜堿性。甘草炮制雷公藤組肝索排列輕度紊亂，肝細(xì)胞伴有少量水腫，肝細(xì)胞輕度退變，肝細(xì)胞形態(tài)完好。提示甘草炮制雷公藤可減輕其肝損傷程度。

小鼠血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果(見圖16)

雷公藤組與空白組比較ast、alt升高(p＜0.05)、cre升高(p＜0.01)；alb降低(p＜0.01)，bun沒有明顯差異；甘草炮制雷公藤組與雷公藤組比較ast、alt、bun沒有明顯差異，cre降低(p＜0.01)；alb升高(p＜0.05)；每組實(shí)際檢測的動(dòng)物數(shù)(n＝8)。

甘草汁炮制雷公藤減毒大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖17)

空白對(duì)照組大鼠肝組織著色均勻、肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、肝索排列整齊、肝細(xì)胞形態(tài)完好。雷公藤組肝索排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹、渾濁、伴有少量水腫和脂肪變性少量壞死，結(jié)構(gòu)破壞、局部區(qū)域出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡和局灶性炎性。甘草炮制雷公藤組肝組織著色均勻、肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、肝索排列整齊、肝細(xì)胞形態(tài)完好，無明顯肝損傷表現(xiàn)。

大鼠生化指標(biāo)檢測結(jié)果(見圖18)

雷公藤組與空白組比較ast、alt、cre升高(p＜0.01)、urea升高(p＜0.05)，alb降低(p＜0.01)；甘草炮制雷公藤組與雷公藤組比較ast、alt、cre、urea降低(p＜0.01)，alb升高(p＜0.01)。提示甘草炮制雷公藤可顯著降低其肝毒性；每組實(shí)際檢測的動(dòng)物數(shù)(n＝8)。

大鼠血清細(xì)胞因子il-1β、il-6、tnf-α檢測結(jié)果(見圖19)

雷公藤組與空白組比較il-1β、il-6、tnf-α顯著升高(p＜0.01)；甘草炮制雷公藤組與雷公藤組比較il-1β、il-6、tnf-α顯著降低(p＜0.01)；每組實(shí)際檢測的動(dòng)物數(shù)(n＝8)。

實(shí)施例6炮制品對(duì)l02細(xì)胞抑制率與其主要成分的簡單相關(guān)分析

采用簡單相關(guān)分析，考察炮制品中雷公藤主要成分與抑制率之間的相關(guān)性，以炮制后雷公藤對(duì)l02細(xì)胞的抑制率為因變量y，以炮制后雷公藤樣品中10種主要成分：雷公藤甲素、雷公藤堿戊、雷公藤春堿、雷公藤堿、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷酚內(nèi)酯、demethylzeylasteral、雷公藤紅素、雷公藤脂甲的質(zhì)譜峰的面積為自變量x1-x10，采用spss軟件對(duì)其進(jìn)行簡單相關(guān)分析。

正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果

由表可知，除變量x8以外，其余所有變量均滿足正態(tài)分布，x8因素先排除，對(duì)有相關(guān)分析采用pearman簡單相關(guān)進(jìn)行研究。

表13正態(tài)性檢驗(yàn)

a.lilliefors顯著水平修正

*.這是真實(shí)顯著水平的下限。

簡單相關(guān)分析結(jié)果

雷公藤甲素(x1)與雷公藤毒價(jià)(y)的相關(guān)分

表14變量x1抑制率y的簡單相關(guān)分析結(jié)果

*.在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

通過簡單相關(guān)分析，得到x1與y的簡單相關(guān)分析結(jié)果，相關(guān)系數(shù)為0.705(p＜0.05)，見雷公藤甲素相對(duì)含量與l02細(xì)胞抑制率具有較強(qiáng)相關(guān)性。

雷公藤堿戊(x2)與雷公藤毒價(jià)(y)的相關(guān)分析

表15變量x2抑制率y的簡單相關(guān)分析結(jié)果

通過簡單相關(guān)分析，得到x2與y的簡單相關(guān)分析結(jié)果，相關(guān)系數(shù)為0.276(p＞0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢娎坠賶A戊相對(duì)含量與l02細(xì)胞抑制率具有較差。

雷公藤春堿(x3)與雷公藤毒價(jià)(y)的相關(guān)分析

表16變量x3抑制率y的簡單相關(guān)分析結(jié)果

*.在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

得到x3與y的簡單相關(guān)分析結(jié)果，相關(guān)系數(shù)為-0.724(p＜0.05)，雷公藤春堿相對(duì)含量與l02細(xì)胞抑制率具有較強(qiáng)相關(guān)性。

雷公藤堿(x4)與雷公藤毒價(jià)(y)的相關(guān)分析

表17變量x4抑制率y的簡單相關(guān)分析結(jié)果

x4與y的簡單相關(guān)分析結(jié)果，相關(guān)系數(shù)為-0.645(p＞0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見雷公藤堿相對(duì)含量與l02細(xì)胞抑制率相關(guān)性較差。

雷公藤晉堿(x5)與雷公藤毒價(jià)(y)的相關(guān)分析

表18變量x5抑制率y的簡單相關(guān)分析結(jié)果

x5與y的簡單相關(guān)分析結(jié)果，相關(guān)系數(shù)為0.142(p＞0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雷公藤堿相對(duì)含量與l02細(xì)胞抑制率相關(guān)性較差。

雷公藤次堿(x6)與雷公藤毒價(jià)(y)的相關(guān)分析

表19變量x6抑制率y的簡單相關(guān)分析結(jié)果

x5與y的簡單相關(guān)分析結(jié)果，相關(guān)系數(shù)為0.346(p＞0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雷公藤次堿相對(duì)含量與l02細(xì)胞抑制率相關(guān)性較差。

雷酚內(nèi)酯(x7)與雷公藤毒價(jià)(y)的相關(guān)分析

x7與y的簡單相關(guān)分析結(jié)果，相關(guān)系數(shù)為0.602(p＞0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雷公藤內(nèi)酯相對(duì)含量與l02細(xì)胞抑制率相關(guān)性較差。

雷公藤紅素(x9)與雷公藤毒價(jià)(y)的相關(guān)分析

表21變量x9抑制率y的簡單相關(guān)分析結(jié)果

*.在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

x9與y的簡單相關(guān)分析結(jié)果，相關(guān)系數(shù)為0.734(p＜0.05)，雷公藤紅素相對(duì)含量與l02細(xì)胞抑制率具有較強(qiáng)相關(guān)性。

雷公藤脂甲(x10)與雷公藤毒價(jià)(y)的相關(guān)分析

表22變量x10抑制率y的簡單相關(guān)分析結(jié)果

表22得到x10與y的簡單相關(guān)分析結(jié)果，相關(guān)系數(shù)為0.469(p＞0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雷公藤酯甲相對(duì)含量與l02細(xì)胞抑制率相關(guān)性較差。

表23雷公藤主要成分與抑制率的簡單相關(guān)分析結(jié)果總結(jié)

*表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)

相關(guān)性分析是衡量兩個(gè)變量因素的相關(guān)程度的方法。評(píng)判的標(biāo)準(zhǔn)為：r值(pearsoncorrelation)為皮爾遜相關(guān)系數(shù)。：當(dāng)r＞0表示兩變量正相關(guān)，r＜0表示兩變量負(fù)相關(guān)。當(dāng)|r|＞0.8時(shí)，可以認(rèn)為兩變量間高度相關(guān)；當(dāng)0.5＜|r|＜0.8時(shí)，可以認(rèn)為兩變量中度相關(guān)；當(dāng)0.3＜|r|＜0.5時(shí)，可以認(rèn)為兩變量低度相關(guān)；當(dāng)0＜|r|＜0.3時(shí)，說明相關(guān)程度弱，基本上不相關(guān)。

表23中可以看出雷公藤甲素、雷公藤春堿、雷公藤紅素與l02細(xì)胞抑制率有中度相關(guān)性，且雷公藤甲素與雷公藤紅素與l02細(xì)胞抑制率呈正相關(guān)，雷公藤春堿呈負(fù)相關(guān)。

多元線性相關(guān)分析結(jié)果

本研究采用spss18.0軟件統(tǒng)計(jì)，采用多元線性回歸的方法分析9種雷公藤炮制品中10種主要成分與l02細(xì)胞抑制率之間的相關(guān)性。模型中以9種炮制品對(duì)l02細(xì)胞抑制率因變量y1，以雷公藤炮制品中10種主要成分：雷公藤甲素、雷公藤堿戊、雷公藤春堿、雷公藤堿、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷酚內(nèi)酯、demethylzeylasteral、雷公藤紅素、雷公藤脂甲提取離子流圖中質(zhì)譜峰的峰面積為自變量x1-x10，假如自變量之間存在共線性的問題，共線性會(huì)使其回歸方程不穩(wěn)定，會(huì)有自變量與因變量相關(guān)性被掩蓋的問題，因此我們進(jìn)行了共線性診斷。

表24

多個(gè)維度的特征值(eigenvalue)接近0時(shí)，證明存在多重共線性，同時(shí)條件指數(shù)(conditionindex)大于10，提示可能存在多重共線性

表26解釋的總方差

提取方法：主成份分析。

取主成分對(duì)應(yīng)的特征值大于1的主成分。特征值可以被看成是表示主成分影響力度大小的指標(biāo)，將特征值大于1的主成分納入。通過表26可知，可提取2個(gè)主成分，分別為z1，z2。

表27成分矩陣

從(初始因子載荷矩陣)可知雷公藤甲素、雷公藤春堿、雷公藤堿、雷公藤內(nèi)酯、demethylzeylastera、雷公藤紅素在第一主成分上有較高載荷,第一主成分可以表示這些指標(biāo)的信息；雷公藤堿戊、雷公藤晉堿和雷公藤次堿指標(biāo)在第二主成分上有較高載荷,第二主成分可以表示這些指標(biāo)的信息。取兩個(gè)主成分替換原來的十個(gè)變量。初始因子載荷矩陣的載荷量表示主成分與對(duì)應(yīng)變量的相關(guān)系數(shù)。

將初始因子載荷矩陣中的兩列數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)樽兞縜1、a2。

z1＝0.360zx1+0.065zx2-0.347zx3-0.344zx4+0.171zx5+0.210zx6+0.363zx7+0.349zx8+0.359zx9+0.203zx10(公式1)

z2＝-0.143zx1+0.526zx2+0.077zx3+0.205zx4+0.501zx5+0.510zx6-0.114zx7-0.026zx8-0.094zx9+0.313zx10(公式2)

主成分綜合模型的權(quán)重計(jì)算是以每個(gè)主成分對(duì)應(yīng)的特征值占所提取主成分總的特征值之和的比例為標(biāo)準(zhǔn),用第一主成分每個(gè)指標(biāo)對(duì)應(yīng)的系數(shù)乘上其所對(duì)應(yīng)的貢獻(xiàn)率再除以兩個(gè)主成分貢獻(xiàn)率之和7.074/(7.074+2.466),所得結(jié)果加上按上述方法所得的結(jié)果即2.466/(7.074+2.466),兩項(xiàng)和即b1*7.074/(7.074+2.466)+b2*2.466/(7.074+2.466)，即可得到綜合得分模型：

z＝0.230zx1+0.184zx2-0.237zx3-0.202zx4+0.257zx5+0.287zx6+0.240zx7+0.252zx8+0.242zx9+0.231zx10(公式3)

自變量y1與原始變量x1-x10之間的線性回歸方程按照標(biāo)準(zhǔn)化公式zx＝(x-mean)/std求出，結(jié)果為：

y1＝1221503x1+18959200x2-151452540x3-4431065.4x4+67738626.2x5+76521366.5x6+1042073.62x7+18761625.1x8+37207332.5x9+130216670x(公式4)

綜上所述：雷公藤春堿、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素、雷公藤酯甲對(duì)l02細(xì)胞抑制率影響較大。

結(jié)合簡單相關(guān)分析及多元線性回歸分析結(jié)果，雷公藤甲素、雷公藤春堿、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素、雷公藤酯甲對(duì)l02細(xì)胞抑制率較大，且雷公藤春堿與細(xì)胞抑制率呈負(fù)相關(guān)，雷公藤甲素、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素、雷公藤酯甲與細(xì)胞抑制率呈正相關(guān)。

炮制前后雷公藤6種主要成分含量變化

取制備好的雷公藤樣品及雷公藤炮制品，配制成相同濃度，0.22μl濾膜濾過，按表10連續(xù)進(jìn)樣，積分，計(jì)算相對(duì)峰面積，計(jì)算平均值，以雷公藤中6種成分峰面積為基數(shù)，結(jié)果顯示雷公藤炮制后雷公藤甲素、雷公藤次堿、雷公藤紅素含量升高，雷公藤晉堿、雷公藤酯甲含量降低，雷公藤春堿含量沒有明顯改變。