本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學病理技術領域，具體涉及一種用于宮頸液基細胞的p16^ink4a免疫標記顯色試劑盒。

背景技術：

宮頸癌是婦科最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于乳腺癌，位居女性惡性腫瘤第二位，嚴重威脅著女性的身體健康和生活質量。中國是宮頸癌的高發(fā)國家，發(fā)生率及死亡率約占全世界的1/3。宮頸癌也是目前唯一病因明確，通過有效的早期診斷及治療可以完全治愈的癌癥。

當前宮頸癌及癌前的病變的早期診斷分為“三階梯”。第一步為陰道脫落細胞學檢查，篩查出可疑病例。第二步為陰道鏡檢查，在陰道鏡下對可疑病例取活檢組織。然后進行第三步活體組織檢查，最終確診。

做為宮頸癌及癌前病變診斷的第一步，陰道脫落細胞學檢查起著非常重要的門戶作用，當前脫落細胞學的主要檢查技術為液基薄層制片技術。

液基薄層細胞制片術改良自傳統(tǒng)“巴氏涂片法”，使用獨特的細胞保存液和液基薄層制片機器，代替?zhèn)鹘y(tǒng)巴氏的手工涂片法，可制出均勻薄層的細胞有利于病理醫(yī)院鏡下觀察，降低了傳統(tǒng)巴氏的漏診率和假陽性、假陰性率。

然而液基薄層細胞制片術采用的依舊是非特異性的巴氏/he染色，并未從根源上彌補細胞學檢查的技術缺陷。受取材、染色、及病理醫(yī)生的主觀判斷等因素的影響，仍存在假陰性率高、靈敏度和特異性不理想等缺點。特別是對病理醫(yī)生的要求較高，且我國病理醫(yī)生缺乏、病理醫(yī)生的工作量大，易出現(xiàn)人為因素導致漏檢的情況。

液基細胞學的技術缺陷促進了宮頸癌及癌前病變篩查輔助技術的發(fā)展，當前主要的輔助篩查技術為hpv檢測，目前hpv的檢測方法有多種，靈敏度和特異度較高的有雜交捕獲二代檢測系統(tǒng)(hc-ii)、熒光定量pcr技術等。

研究己揭示高危型人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus,hpv)的持續(xù)感染是導致宮頸癌的主要原因。目前已知的hpv亞型有近200種，大多數(shù)不會引起宮頸癌，只有14種高危型，是引起宮頸癌的主要原因。女性的一生中，感染hpv的風險超過50％，而這些感染者有90％以上可在一至兩年內(nèi)通過人體自身的免疫力清楚掉hpv，即轉陰自愈。因而hpv檢測作為一個篩查指標明顯缺乏特異性，易導致病人的心理恐慌和過渡醫(yī)療。且hpv分子生物學檢測技術對實驗環(huán)境和人員的要求較高，檢測價格較貴，限制了其在臨床上的廣泛應用。

尋找新的靈敏度和特異度更好的分子生物標志物用于宮頸癌的早期診斷具有重要意義。

p16^ink4a是一種重要的抑癌基因，特異性的與cdk4結合，抑制cdk4的活性，從而抑制細胞從g1期進入s期，使細胞無法持續(xù)增殖。p16ink4a蛋白的表達通常受到另兩種抑癌蛋白p53和prb調控，在正常增殖的細胞中處于低水平表達狀態(tài)。

已知宮頸癌發(fā)生的主要原因是持續(xù)性的人乳頭瘤病毒(hpv)感染(99％以上)。hpv的持續(xù)感染會導致病毒的致癌基因蛋白e6和e7含量升高，e6和e7作用是分別與人體抑癌基因蛋白p53和prb結合，e6通過抑制p53而阻斷凋亡，e7通過抑制prb使細胞周期失控。在宮頸癌及癌前病變中p53和prb功能常處于被抑制狀態(tài)，導致p16^ink4a蛋白從被抑制狀態(tài)釋放出來，過量表達。研究顯示，p16^ink4a蛋白的過度表達和宮頸癌及癌前病變的分級顯著相關，隨著病變等級的越高p16^ink4a蛋白的表達量越高，固在宮頸癌及癌前病變細胞中檢測p16^ink4a蛋白的表達量即可預測這些細胞的病變轉化程度。

p16^ink4a做為高危hpv的代表和宮頸癌前病變的發(fā)展密切相關，具有較高的特異性和靈敏度，在宮頸組織活檢樣本中，已經(jīng)得到普遍被認可與應用。將p16^ink4a免疫標記應用于液基細胞學，可利用抗原抗體的特異性結合，在液基細胞學中提供特異性的染色技術，避免宮頸癌前篩查易受病理醫(yī)生經(jīng)驗和人員缺乏等影響因素。

然而宮頸液基細胞樣本的特殊性限制了其應用的發(fā)展：(1)宮頸液基樣本常含有較多的炎癥細胞、紅細胞等干擾成分，含豐富的內(nèi)源性過氧化物酶，易導致免疫染色的非特異性；(2)當前液基細胞的保存液不能很好的保存細胞的p16^ink4a抗原，易導致染色結果的假陰性。

許振國等人在“p16^ink4a作為分子標記物在宮頸癌篩查中的應用”中采用的p16^ink4a免疫細胞化學染色方法為：將液基細胞保存液中的剩余標本離心沉淀后制成涂片，丙酮固定10min，4℃冰箱保存。采用maxvisiontm法檢測，染色步驟為：①細胞片在抗原修復液中95℃～100℃處理1～2min，室溫下冷卻10min，用流水沖壓力鍋外壁直至冷卻；②取出玻片用流水沖洗干凈，用pbs(ph值7.4)沖洗3次，3min/次；③除去pbs液，每張玻片滴加50μl曲拉通x－100液，室溫孵育10min，pbs(ph值7.4)沖洗3次，3min/次；④除去pbs液，每張玻片滴加1∶200稀釋的100μlp16^ink4a單克隆抗體至室溫下孵育60min或4℃冰箱過夜；⑤滴加maxvisiontm試劑；⑥二甲基聯(lián)苯胺(dab)顯色；⑦自來水沖洗，蘇木素復染，酒精脫水，二甲苯透明，封片。陽性細胞為細胞核和細胞質出現(xiàn)棕黃色顆粒，以異形的陽性染色細胞數(shù)≥10個判定為陽性。

技術實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于宮頸液基細胞p16^ink4a免疫標記顯色試劑盒。本發(fā)明宮頸液基細胞的p16^ink4a免疫標記顯色試劑盒在當前陰道脫落液基細胞學的基礎上，利用抗原抗體的特異性結合提供了一種特異性的染色方法，彌補了當前液基細胞學非特異性巴氏染色、全靠肉眼形態(tài)判斷的特異性低，容易漏診的缺陷。

本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)：

一種用于宮頸液基細胞p16^ink4a免疫標記顯色試劑盒，所述試劑盒包括：p16^ink4a抗原保存液，第一抗體，第二抗體，dab顯色液，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，封閉液，緩沖液，陽性對照品和陰性對照品。

優(yōu)選地，所述p16^ink4a抗原保存液由以下成分及其濃度組成：nacl60-100mmol/l、kcl2-10mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉1-5mmol/l、尿素30-50mmol/l、檸檬酸鈉1-5mmol/l、蔗糖5-20mmol/l、peg-4004-10mmol/l、多聚甲醛2％-3％、甘油2-10mmol/l和二硫蘇糖醇10-20mmol/l。

優(yōu)選地，所述p16^ink4a抗原保存液由以下成分及其濃度組成：nacl85mmol/l、kcl7.5mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉3.5mmol/l、尿素42mmol/l、檸檬酸鈉3.6mmol/l、蔗糖16mmol/l、peg-4006.5mmol/l、多聚甲醛2％、甘油8.4mmol/l和二硫蘇糖醇16.5mmol/l。

優(yōu)選地，所述第一抗為宮頸液基細胞p16^ink4a鼠抗人單克隆抗體；所述第二抗體為標記了辣根過氧化物酶的兔抗小鼠igg抗體。

優(yōu)選地，所述內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑為0.5％-1％高碘酸溶液；封閉液為動物非免疫羊血清。

優(yōu)選地，所述緩沖液為含有0.1％-0.5％吐溫20的ph值為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液。

優(yōu)選地，所述陽性對照品為高表達p16^ink4a蛋白的宮頸鱗癌細胞siha；陰性對照品為低表達p16^ink4a蛋白的正常宮頸細胞。

本發(fā)明還提供了一種用于宮頸液基細胞p16^ink4a免疫標記顯色試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

(1)用一次性宮頸刷刷取女性患者宮頸移形區(qū)的細胞樣本，用p16^ink4a抗原保存液保存細胞，并用jy-3200型自動制片機進行自動制片；

(2)制片后用4％多聚甲醛固定5-10min，后60℃烘干10min；

(3)烘干結束后用1-2ml的緩沖液清洗3-5次，3-5min/次；

(4)清洗過后滴加封閉液，32℃恒溫孵育10-20min后拋干；

(5)滴加第一抗體，根據(jù)樣本面積覆蓋完全，32℃恒溫孵育30-60min；

(6)孵育結束后用1-2ml的緩沖液清洗3-5次，3-5min/次；

(7)滴加第二抗體，根據(jù)樣本面積覆蓋完全，32℃恒溫孵育15-30min；

(8)孵育結束后用1-2ml的緩沖液清洗3-5次，3-5min/次；

(9)滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，根據(jù)樣本面積覆蓋完全，32℃恒溫孵育2-5min；

(11)用1-2ml的緩沖液清洗3-5次，3-5min/次；

(12)滴dab顯色液，顯色5-10min；

(13)用1-2ml的緩沖液清洗3-5次，3-5min/次；

(14)用蘇木素復染后，中性樹膠封片。

試劑盒使用過程中，首先使用了p16^ink4a抗原保存液，在細胞收集階段就很好的保存了細胞p16^ink4a抗原決定簇，防止其受其它化學物質影響而封閉；制片后使用4％多聚甲醛固定液代替了傳統(tǒng)液基的乙醇/甲醇固定液，從而對p16^ink4a抗原具有更好的保護效果；與傳統(tǒng)免疫組織化學的緩沖液相比，本發(fā)明在ph值為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液中添加了0.1％-0.5％吐溫20的表面活性劑，使反應過程中清洗更徹底。

本發(fā)明用低濃度的強氧化劑hio3替代了傳統(tǒng)的內(nèi)源性過氧化物阻斷劑中現(xiàn)配現(xiàn)用的h2o2溶液，縮短了反應時間，提高了內(nèi)源性過氧化物酶的阻斷效果；并且hio3溶液不需現(xiàn)配現(xiàn)用，可長期保存。此外，本發(fā)明將內(nèi)源性過氧化物酶阻斷步驟在二抗孵育節(jié)后進行，與傳統(tǒng)操作步驟中將內(nèi)源性過氧化物酶阻斷步驟在一抗反應前進行相比，避免了氧化劑對抗原的影響。

本發(fā)明p16^ink4a免疫標記顯色試劑盒中含有p16^ink4a抗原保存液，并對免疫顯色體系及流程進行了優(yōu)化，能夠有效檢測p16^ink4a的表達，從而解決了將免疫顯色技術應用于宮頸液基細胞學的限制。本發(fā)明試劑盒與現(xiàn)有相比具有以下突出優(yōu)點：

(1)本發(fā)明試劑盒特異性強，利用抗原抗體特異性結合的染色方法，克服了當前液基細胞學非特異性巴氏染色、全靠肉眼形態(tài)判斷的特異性低的缺陷；

(2)本發(fā)明試劑盒靈敏度高，穩(wěn)定性強，成本低，操作方便。

附圖說明

圖1：陰性對照品：p16低表達的正常宮頸細胞；

圖2：樣品：p16高表達的宮頸病變細胞；

圖3：陽性對照品：p16高表達的宮頸鱗癌細胞株siha。

具體實施方式

下面將結合說明書附圖和實施例進一步的詳細說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發(fā)明要求保護的技術方案的舉例說明，并非對這些技術方案的任何限制。本發(fā)明的保護范圍以所附權利要求書記載的內(nèi)容為準。

多聚甲醛，cas號30525-89-4。

實施例1一種用于宮頸液基細胞p16^ink4a免疫標記顯色試劑盒

所述試劑盒包括：p16^ink4a抗原保存液，第一抗體，第二抗體，dab顯色液，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，封閉液，緩沖液，陽性對照品和陰性對照品。

其中，所述p16^ink4a抗原保存液由以下成分及其濃度組成：nacl85mmol/l、kcl7.5mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉3.5mmol/l、尿素42mmol/l、檸檬酸鈉3.6mmol/l、蔗糖16mmol/l、peg-4006.5mmol/l、多聚甲醛2％、甘油8.4mmol/l和二硫蘇糖醇16.5mmol/l。

所述第一抗體為p16^ink4a鼠抗人單克隆抗體；所述第二抗體為標記了辣根過氧化物酶的兔抗小鼠igg抗體。

所述內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑為0.75％高碘酸溶液；所述封閉液為動物非免疫羊血清。

所述緩沖液為含有0.3％吐溫20的ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液。

所述陽性對照品為高表達p16蛋白的宮頸鱗癌細胞siha；陰性對照品為低表達p16蛋白的正常宮頸細胞。

實施例2一種用于宮頸液基細胞p16^ink4a免疫標記顯色試劑盒

一種用于宮頸液基細胞p16^ink4a免疫標記顯色試劑盒，所述試劑盒包括：p16^ink4a抗原保存液，第一抗體，第二抗體，dab顯色液，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，封閉液，緩沖液，陽性對照品和陰性對照品。

所述p16^ink4a抗原保存液由以下成分及其濃度組成：nacl60mmol/l、kcl2mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉1mmol/l、尿素30mmol/l、檸檬酸鈉1mmol/l、蔗糖5mmol/l、peg-4004mmol/l、多聚甲醛2％、甘油2mmol/l和二硫蘇糖醇10mmol/l。

其中，所述第一抗為p16^ink4a鼠抗人單克隆抗體；所述第二抗體為標記了辣根過氧化物酶的兔抗小鼠igg抗體。

所述內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑為0.5％高碘酸溶液；所述封閉液為動物非免疫羊血清。

所述緩沖液為含有0.1％吐溫20的ph值為7.2的磷酸鹽緩沖液。

所述陽性對照品為高表達p16蛋白的宮頸鱗癌細胞siha；陰性對照品為低表達p16蛋白的正常宮頸細胞。

實施例3一種用于宮頸液基細胞p16^ink4a免疫標記顯色試劑盒

一種用于宮頸液基細胞p16^ink4a免疫標記顯色試劑盒，所述試劑盒包括：p16^ink4a抗原保存液，第一抗體，第二抗體，dab顯色液，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，封閉液，緩沖液，陽性對照品和陰性對照品。

其中，所述p16^ink4a抗原保存液由以下成分及其濃度組成：nacl100mmol/l、kcl10mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉5mmol/l、尿素50mmol/l、檸檬酸鈉5mmol/l、蔗糖20mmol/l、peg-40010mmol/l、多聚甲醛2.5％、甘油10mmol/l和二硫蘇糖醇20mmol/l。

所述第一抗為p16^ink4a鼠抗人單克隆抗體；所述第二抗體為標記了辣根過氧化物酶的兔抗小鼠igg抗體。

所述內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑為1％高碘酸溶液；所述封閉液為動物非免疫羊血清。

所述緩沖液為含有0.5％吐溫20的ph值為7.6的磷酸鹽緩沖液。

所述陽性對照品為高表達p16蛋白的宮頸鱗癌細胞siha；陰性對照品為低表達p16蛋白的正常宮頸細胞。

實施例4一種用于宮頸液基細胞p16^ink4a免疫標記顯色試劑盒的使用方法

所述用于宮頸液基細胞p16^ink4a免疫標記顯色試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

(1)用一次性宮頸刷刷取女性患者宮頸移形區(qū)的細胞樣本，用p16^ink4a抗原保存液保存細胞，并用jy-3200型自動制片機進行自動制片；

(2)制片后用4％多聚甲醛固定5-10min，后60℃烘干10min；

(3)烘干結束后用1-2ml的緩沖液清洗3-5次，3-5min/次；

(4)清洗過后滴加封閉液，32℃恒溫孵育10-20min后拋干；

(5)滴加第一抗體，根據(jù)樣本面積覆蓋完全，32℃恒溫孵育30-60min；

(6)孵育結束后用1-2ml的緩沖液清洗3-5次，3-5min/次；

(7)滴加第二抗體，根據(jù)樣本面積覆蓋完全，32℃恒溫孵育15-30min；

(8)孵育結束后用1-2ml的緩沖液清洗3-5次，3-5min/次；

(9)滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，根據(jù)樣本面積覆蓋完全，32℃恒溫孵育2-5min；

(11)用1-2ml的緩沖液清洗3-5次，3-5min/次；

(12)滴dab顯色液，顯色5-10mi；

(13)用1-2ml的緩沖液清洗3-5次，3-5min/次；

(14)用蘇木素復染后，中性樹膠封片。

對比例1一種用于宮頸液基細胞p16^ink4a免疫標記顯色試劑盒

所述試劑盒與實施例1的區(qū)別在于，所用保存液為cps03保存液，其與成分均與實施例1類似。

對比例2一種用于宮頸液基細胞p16^ink4a免疫標記顯色試劑盒

所述試劑盒與實施例1的區(qū)別在于，所用內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑為現(xiàn)配現(xiàn)用的h2o2溶液，其與成分均與實施例1類似。

試驗例1不同樣品p16^ink4a蛋白免疫標記染色

利用實施例1試劑盒按實施例4使用方法，對p16^ink4a高表達的宮頸病變細胞進行p16^ink4a蛋白免疫標記染色，并與本發(fā)明試劑盒中陽性對照品、陰性對照品進行比較，試驗結果如圖1、圖2和圖3所示。

由圖1、圖2和圖3可知，本發(fā)明試劑盒能夠對p16^ink4a蛋白免疫標記進行特異性染色，從而能夠實現(xiàn)對p16^ink4a表達的準確檢測。

試驗例2不同試劑盒p16^ink4a蛋白免疫標記染色情況比較

利用實施例1、對比例1和對比例2試劑盒按實施例4使用方法對p16高表達的宮頸病變細胞進行p16^ink4a蛋白免疫標記染色，觀察p16^ink4a蛋白免疫標記染色程度，并計算陽性細胞顏色比例，結果如表1所示。

表1不同試劑盒p16^ink4a蛋白免疫標記染色情況

注：+表示大于10％的細胞呈現(xiàn)微弱，不完全染色；+++表示大于10％的細胞呈現(xiàn)強的、完整的細胞染色。

由表1可知，本發(fā)明試劑盒p16^ink4a蛋白免疫標記染色情況明顯優(yōu)于對比例1、對比例2；與對比例1相比，本發(fā)明試劑盒陽性染色細胞比例提高了2.9倍，這說明本發(fā)明試劑盒中所用p16^ink4a抗原保存液比普通保存液更能促進p16^ink4a蛋白免疫標記染色；與對比例2相比，本發(fā)明試劑盒陽性染色細胞比例提高了1.2倍，這說明本發(fā)明用低濃度的強氧化劑hio3替代內(nèi)源性過氧化物阻斷劑中現(xiàn)配現(xiàn)用的h2o2溶液，效果更為明顯。

試驗例3、用于宮頸液基細胞p16^ink4a免疫標記顯色試劑盒的穩(wěn)定性

1、凍融穩(wěn)定性

為模擬試劑盒在運輸過程中，低溫環(huán)境下試劑盒各組分反復凍融對試劑盒穩(wěn)定性的影響，將本發(fā)明實施例1整套試劑盒在-20℃的低溫下冷凍過夜，然后在室溫下復溶，然后再置于-20℃的低溫下冷凍過夜，如此反復凍融5次，然后按實施例4的使用方法進行檢測。結果如表2所示。

表2：試劑盒凍融穩(wěn)定性結果

由表2可以看出，本發(fā)明試劑盒經(jīng)反復凍融5次后，試劑盒的陰性對照、陽性對照、細胞形態(tài)以及重復性等均滿足要求。這說明，本發(fā)明試劑盒具有較好的凍融穩(wěn)定性。

2、模擬運輸穩(wěn)定性

為模擬試劑盒在運輸過程中，車輛的顛簸以及高溫環(huán)境對試劑盒穩(wěn)定性的影響，將實施例1整套試劑盒固定在微量振蕩器上，放置于37℃恒溫箱振蕩7天后按實施例4使用方法進行檢測。結果如表3所示。

表3：試劑盒模擬運輸穩(wěn)定性結果

由表3可以看出，本發(fā)明試劑盒放置于37℃恒溫箱振蕩7天后，試劑盒的陰性對照、陽性對照、細胞形態(tài)以及重復性等均滿足要求。這說明，本發(fā)明試劑盒具有較好的運輸穩(wěn)定性。