本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板受體gpiba胞外段酶切的方法。

背景技術(shù)：

gpib-ix-v復(fù)合物由gpiba、gpibb、gpix和gpv構(gòu)成(圖1)。gpiba與gpibb通過二硫鍵結(jié)合，再通過非共價鍵與gpix和gpv連接。gpiba是gpib-ix-v復(fù)合物中的主要配體結(jié)合亞基，由626個氨基酸殘基組成。gpiba是一種膜表達(dá)分子，由胞外段、跨膜區(qū)和胞內(nèi)段組成。作為血小板最重要的粘附分子，gpiba通過與相應(yīng)配體結(jié)合發(fā)揮多種生物學(xué)功能。

在血小板活化或者受到某種刺激后，gpiba胞外段將會發(fā)生酶切，具體主要是由金屬蛋白酶adam17所介導(dǎo)，切割gpiba胞外段，釋放出可溶性片段(也叫糖萼素，glycocalicin)，同時留下與細(xì)胞膜所結(jié)合的胞內(nèi)段(圖2)。gpiba酶切參與調(diào)控血小板多種生物學(xué)功能：如下調(diào)血小板gpiba的功能、參與血小板體內(nèi)的清除等。因此通過檢測gpiba的胞外段酶切，可以間接反映出血小板的功能。

目前關(guān)于檢測gpiba胞外段酶切的方法有兩種，一種是蛋白免疫印跡(westernblot)檢測；另外一種是酶聯(lián)免疫吸附(elisa)檢測。但是westernblot檢測需要一定量的細(xì)胞數(shù)目來獲得檢測所需的蛋白量，故在血小板減少的情況下，此方法不適合檢測gpiba胞外段酶切。此外，gpiba胞外段酶切是持續(xù)發(fā)生的(即使在靜息狀態(tài)下)，這樣就會導(dǎo)致血漿、血清或者血小板上清中的可溶性片段水平很高，造成elisa的背景值偏高。通過elisa方法檢測gpiba胞外段酶切，會降低檢測結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板受體gpiba胞外段酶切的方法，該方法適用于血小板數(shù)目減少的情況，且可靠性高。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一種基于流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板受體gpiba胞外段酶切的方法，包括以下步驟：

(1)樣本準(zhǔn)備和處理

a.收集人5ml靜脈血，采集到含抗凝劑枸櫞酸三鈉水溶液的試管中，抗凝劑枸櫞酸三鈉水溶液與靜脈血按1：9體積比例緩慢混勻；

b.室溫下，120×g離心20分鐘，吸取上層富含血小板血漿(prp)；

c.將吸取到的prp分別加入到5個ep管中，每個ep管中含血小板數(shù)目為1×10⁷個，補(bǔ)充含5mmoledta的1×ts緩沖液至100μl；5個ep管分別為：同型對照1(pe熒光標(biāo)記)、同型對照2(alexa熒光標(biāo)記)、pe-ak2(胞外段抗體pe熒光標(biāo)記)、alexa-tail(胞內(nèi)段抗體alexa熒光標(biāo)記)和雙標(biāo)記(pe-ak2+alexa-tail)；

d.在pe-ak2管和雙標(biāo)記管中加入2μg/mlpe標(biāo)記的抗gpiba胞外段抗體(ak2)，同時在同型對照1管加入同型對照抗體pe-igg，室溫避光孵育30分鐘，30分鐘后，同型對照1管和pe-ak2管直接進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測和分析，其余三管進(jìn)行alexa染色；

e.同型對照2管、alexa-tail管和雙標(biāo)記管中的血小板使用含5mmoledta的1×ts緩沖液洗滌，棄上清；使用1％的多聚甲醛(溶解在含5mmoledta的1×ts緩沖液中)避光固定10分鐘；使用含5mmoledta的1×ts緩沖液洗滌；

f.加入0.1％的皂角苷(saponin)(溶解在含5mmoledta的1×ts緩沖液中)進(jìn)行破膜，同時在alexa-tail管和雙標(biāo)記管中加入2μg/mlalexafluor488標(biāo)記的抗gpiba胞內(nèi)段抗體，同型對照2中加入alexafluor488標(biāo)記的同型對照抗體alexa-igg，避光孵育30分鐘；

g.用含0.1％的皂角苷(saponin)(溶解在含5mmoledta的1×ts緩沖液中)洗滌2次；將血小板重懸在500μl含5mmoledta的1×ts緩沖液中，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測；

(2)流式細(xì)胞儀檢測

a.使用同型對照1管，通過前向角散射(forwardscatter,fsc)和側(cè)向角散射(sidescatter,ssc)來鑒別血小板；

b.在鑒別的血小板群周圍畫一個區(qū)域r1，設(shè)定收集r1內(nèi)的1000個事件；

c.通過使用同型對照1管和同型對照2管設(shè)定fl1通道(alexafluor488熒光通道)和fl2通道(pe熒光通道)的電壓值；

d.使用pe-ak2管和alexa-tail管設(shè)定熒光補(bǔ)償，消除這兩種熒光的相互干擾；

e.設(shè)置完成后，進(jìn)行每管數(shù)據(jù)的收集；

(3)weasel軟件數(shù)據(jù)分析

a.使用alexa-tail管的數(shù)據(jù)，在alexa和ssc的模式下，畫出alexa-tail陽性區(qū)域r0；

b.將雙標(biāo)記的數(shù)據(jù)展示出來，使雙標(biāo)記的每個事件都來自于r0區(qū)域；

c.設(shè)定四個象限，通過同型對照1管和同型對照2管，設(shè)定pe和alexa的陽性和陰性區(qū)域，即在陽性和陰性交匯點畫條垂直的直線；

d.右上象限的數(shù)據(jù)即代表血小板膜表面多少gpiba保持完整型狀態(tài)。

進(jìn)一步，所述的枸櫞酸三鈉水溶液由1.6克枸櫞酸三鈉溶解于50ml蒸餾水中制成。

進(jìn)一步，所述的1×ts緩沖液的組成為：0.01moltris-hcl,0.15molnacl,ph7.4。

本發(fā)明的基本原理是通過使用兩種不同熒光標(biāo)記的抗體，分別為抗gpiba胞外段(只識別全長完整型的gpiba，酶切后的片段將會脫離血小板表面)抗體和抗gpiba胞內(nèi)段(可識別全長完整型gpiba，可以識別酶切后的gpiba)抗體，通過流式細(xì)胞術(shù)分析胞外段抗體與胞內(nèi)段抗體的結(jié)合的相對值，即可反映出gpiba胞外段酶切的程度，如圖3和圖4所示。

本發(fā)明的檢測方法不依賴于血小板數(shù)目的變化，適用于血小板數(shù)目減少的情況，且可靠性高，穩(wěn)定性好。

附圖說明

圖1是gpiba的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是gpiba胞外段酶切示意圖；

圖3是gpiba胞外段酶切檢測原理圖；

圖4是gpiba胞外段和胞內(nèi)段抗體的識別圖；

圖5是流式細(xì)胞術(shù)檢測gpiba胞外段酶切圖；

圖6是gpiba胞外段酶切數(shù)據(jù)分析圖；

圖7是流式細(xì)胞術(shù)檢測nem處理前后gpiba抗體的結(jié)合對比圖；

圖8是nem處理前后gpiba胞外段的酶切程度對比圖；

圖9是健康對照和血小板減少癥患者血小板gpiba胞外段酶切程度對比圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實施例1：檢測健康人血小板gpiba胞外段酶切

一種基于流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板受體gpiba胞外段酶切的方法，包括以下步驟：

(1)樣本準(zhǔn)備和處理

a.收集健康人5ml靜脈血，采集到含抗凝劑枸櫞酸三鈉水溶液(1.6克枸櫞酸三鈉溶解于50ml蒸餾水中)的試管中，抗凝劑枸櫞酸三鈉水溶液與靜脈血按1：9體積比例緩慢輕輕混勻；

b.室溫下，120×g離心20分鐘，使用塑料吸管輕輕的吸取上層的富含血小板血漿(prp)，不要吸取靠近中間層的prp，以免吸取到白細(xì)胞，造成污染；

c.將吸取到的prp分別加入到5個ep管中，每個ep管中含血小板數(shù)目為1×10⁷個，補(bǔ)充含5mmoledta的1×ts緩沖液(0.01moltris-hcl,0.15molnacl,ph7.4)至100μl；5個ep管分別為：同型對照1(pe熒光標(biāo)記)、同型對照2(alexa熒光標(biāo)記)、pe-ak2(胞外段抗體pe熒光標(biāo)記)、alexa-tail(胞內(nèi)段抗體alexa熒光標(biāo)記)和雙標(biāo)記(pe-ak2+alexa-tail)；

d.在pe-ak2管和雙標(biāo)記管中加入2μg/mlpe標(biāo)記的抗gpiba胞外段抗體(ak2)(實驗室常規(guī)方法自制，使用試劑盒進(jìn)行熒光pe標(biāo)記)，同時在同型對照1管加入同型對照抗體pe-igg，室溫避光孵育30分鐘，30分鐘后，同型對照1管和pe-ak2管直接進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測和分析，其余三管進(jìn)行alexa染色；

e.同型對照2管、alexa-tail管和雙標(biāo)記管中的血小板使用含5mmoledta的1×ts緩沖液洗滌，棄上清；使用1％的多聚甲醛(溶解在含5mmoledta的1×ts緩沖液中)避光固定10分鐘；使用含5mmoledta的1×ts緩沖液洗滌；

f.加入0.1％的皂角苷(saponin)(溶解在含5mmoledta的1×ts緩沖液中)進(jìn)行破膜，同時在alexa-tail管和雙標(biāo)記管中加入2μg/ml的alexafluor488標(biāo)記的抗gpiba胞內(nèi)段抗體(實驗室常規(guī)方法自制，使用試劑盒進(jìn)行熒光alexafluor488標(biāo)記)，同型對照2中加入alexafluor488標(biāo)記的同型對照抗體alexa-igg，避光孵育30分鐘；

g.用含0.1％的皂角苷(saponin)(溶解在含5mmoledta的1×ts緩沖液中)洗滌2次；將血小板重懸在500μl含5mmoledta的1×ts緩沖液中，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測；

(2)流式細(xì)胞儀(美國bd公司，型號為calibur)檢測

a.使用同型對照1管，通過前向角散射(forwardscatter,fsc)和側(cè)向角散射(sidescatter,ssc)來鑒別血小板；

b.在鑒別的血小板群周圍畫一個區(qū)域r1，設(shè)定收集r1內(nèi)的1000個事件(圖5a)；

c.通過使用同型對照1管和同型對照2管設(shè)定fl1通道(alexafluor488熒光通道)(圖5b)和fl2通道(pe熒光通道)(圖5c)的電壓值；

d.使用pe-ak2管和alexa-tail管設(shè)定熒光補(bǔ)償，消除這兩種熒光的相互干擾；

e.設(shè)置完成后，進(jìn)行每管數(shù)據(jù)的收集；

(3)數(shù)據(jù)分析(weasel軟件)

a.使用alexa-tail管的數(shù)據(jù)，在alexa和ssc的模式下，畫出alexa-tail陽性區(qū)域r0(圖6a)；

b.將雙標(biāo)記的數(shù)據(jù)展示出來，使雙標(biāo)記的每個事件都來自于r0區(qū)域；

c.設(shè)定四個象限，通過同型對照1管和同型對照2管，設(shè)定pe和alexa的陽性和陰性區(qū)域，即在陽性和陰性交匯點畫條垂直的直線；

d.右上象限的數(shù)據(jù)84％即代表血小板膜表面多少gpiba保持完整型狀態(tài)(圖6b)。

實施例2：檢測nem處理的健康人血小板gpiba胞外段酶切

采用n-乙基順丁烯二酰亞胺(n-ethylmaleimide,nem)，一種可以人為誘導(dǎo)gpiba胞外段酶切的試劑，來處理血小板，誘導(dǎo)gpiba發(fā)生酶切。

從圖7中可以看出，橫坐標(biāo)是胞內(nèi)段抗體的結(jié)合，縱坐標(biāo)是胞外段抗體的結(jié)合。圖中的4個框分別代表每個抗體的結(jié)合。左下象限代表陰性區(qū)域，即代表多少百分比的血小板既沒有胞外段抗體的結(jié)合也沒有胞內(nèi)段抗體的結(jié)合。左上象限代表多少百分比的血小板只有胞外段抗體的結(jié)合。右下象限代表血小板有胞內(nèi)段抗體的結(jié)合。右上象限代表多少百分比的血小板既含有胞外段抗體的結(jié)合，又含有胞內(nèi)段抗體的結(jié)合，也就是全長完整型的gpiba。左上加右上象限代表多少百分比的血小板含有胞外段抗體的結(jié)合；而右上加右下象限代表多少血小板含有胞內(nèi)段抗體的結(jié)合。

從上面可以看出，在nem處理前，右上象限代表的是全長完整型的gpiba(95％)，此數(shù)據(jù)的變化可以反映出gpiba胞外段酶切的程度。95％數(shù)據(jù)代表血小板膜表面有95％完整型的gpiba，其與5％的gpiba發(fā)生了酶切。此處可以看出，即使在靜息狀態(tài)下，血小板gpiba也發(fā)生了酶切，與眾多前期研究相一致。右上象限數(shù)據(jù)的大小與血小板gpiba胞外段酶切程度呈負(fù)相關(guān)。即數(shù)據(jù)降低，gpiba胞外段酶切增加。而經(jīng)nem處理后，血小板膜表面只有79％的gpiba保持在完整型狀態(tài)，提示gpiba胞外段發(fā)生了酶切。

此外，利用本發(fā)明的方法還檢測了來自于7例不同健康人血小板經(jīng)nem處理后的gpiba胞外段酶切，檢測結(jié)果如圖8所示，表明經(jīng)nem處理后，gpiba胞外段酶切顯著增加。由此驗證了本發(fā)明方法的可靠性。

實施例3：檢測血小板減少癥患者血小板gpiba胞外段酶切

收集了5例血小板減少癥患者的血小板，利用本發(fā)明的方法檢測gpiba胞外段酶切。從圖9中可以看出，血小板減少癥患者gpiba的完整型狀態(tài)顯著降低，提示胞外段酶切增加。此外，通過相關(guān)性分析，得出血小板減少癥患者中g(shù)piba胞外段酶切程度不依賴于血小板數(shù)目的變化(r2＝0.021，p＝0.815)，進(jìn)一步驗證了本發(fā)明的基于流式細(xì)胞術(shù)檢測gpiba胞外段酶切的方法不依賴于血小板數(shù)目的變化。