本發(fā)明涉及對那非類和拉非類成分的檢測領(lǐng)域，具體涉及一種pde-5抑制劑膠體金免疫層析試紙條及其制備和使用方法。

背景技術(shù)：

5型磷酸二酯酶(pde-5)屬于環(huán)核苷酸水解酶家族，主要存在于陰莖海綿體、平滑肌及血小板中，能特異性地與環(huán)鳥苷酸結(jié)合，是陰莖中環(huán)鳥苷酸代謝失活的主要同工酶。pde-5抑制劑可選擇性地抑制存在于陰莖海綿體的pde-5的活性，使局部環(huán)鳥苷酸濃度維持在較高的水平，促進海綿體平滑肌松弛、血流量增加達到治療陽痿的效果。目前，已獲準上市的pde-5抑制劑主要包括西地那非、伐地那非和他達拉非。

近年來，世界各國的科研機構(gòu)和藥品檢驗部門，不斷報道在天然保健品或中成藥中檢出了違法添加的pde-5抑制劑，其中不僅包括三種已經(jīng)獲準上市的藥物，而且還包括它們進行了輕微結(jié)構(gòu)改造的類似物。獲準上市的pde-5抑制劑藥品是處方藥，會產(chǎn)生不同程度的副作用。但消費者在不知情的情況下服用違法添加的pde-5抑制劑，主要有以下幾個方面的風險：

①pde-5抑制劑與硝酸酯藥物相互作用會導致嚴重低血壓；②pde-5抑制劑的類似物沒有經(jīng)過臨床研究，存在未知危險因素；③違法添加的pde-5藥物劑量往往超過安全使用劑量，對身體健康構(gòu)成嚴重威脅。

目前，檢測pde-5抑制劑的方法主要有高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，核磁共振色譜法等等。但是這些方法設(shè)備昂貴、運行費用高、操作過程復雜，不適合在基層部門廣泛開展，普通消費者也無法使用。另外，對于新出現(xiàn)的pde-5抑制劑藥物的結(jié)構(gòu)類似物，往往會規(guī)避常規(guī)方法的檢驗，產(chǎn)生假陰性的結(jié)果。

免疫檢測方法具有靈敏度高、特異性強、方便快捷、操作簡單、成本低廉，無需借助昂貴的設(shè)備等優(yōu)點，特別是膠體金免疫層析試紙條的出現(xiàn)，更加適合基層部門和普通消費者使用。

目前，市場上已有部分檢測pde-5抑制劑的膠體金免疫層析試紙條(如西地那非)，但大部分是只能同時檢測一種成分，給實際應用帶來了不便。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對以上現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種可同時檢測較多種那非類和拉非類成分的膠體金免疫層析試紙條，可用于壯陽類保健品及中成藥等產(chǎn)品中那非類和拉非類成分的快速檢測和初篩。

為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種pde-5抑制劑膠體金免疫層析試紙條，該試紙條包括pvc底板、樣品墊、金標墊、檢測線、控制線、硝基纖維素膜、吸水墊；所述樣品墊、金標墊、檢測線、控制線、硝基纖維素膜、吸水墊均設(shè)置在pvc底板的上方，所述樣品墊設(shè)置在pvc底板的一端的邊緣，金標墊設(shè)置在樣品墊內(nèi)側(cè)并與樣品墊部分重疊；吸水墊設(shè)置在pvc底板的另一端，硝基纖維素膜設(shè)置在金標墊與吸水墊之間并分別與兩者部分重疊；檢測線在硝基纖維素膜上靠近金標墊的一端，控制線噴涂在靠近吸水墊的一端，所述樣品墊和金標墊為玻璃纖維膜；金標墊上包被有膠體金標記的那非類通用抗體和拉非類通用抗體混合物；所述檢測線包被那非類通用半抗原(nfa)與載體蛋白的偶聯(lián)物，以及拉非類通用半抗原(lfa)與載體蛋白的偶聯(lián)物；所述控制線上包被兔抗鼠或羊抗鼠igg抗體；所述吸水墊為濾紙；所述那非類通用半抗原(nfa)如式ⅰ所示，所述拉非類通用半抗原(lfa)如式ⅱ所示。

本發(fā)明所述用于檢測那非類和拉非類成分的pde-5抑制劑膠體金免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟：

1.制備通用半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物：將那非類通用半抗原(nfa)或拉非類通用半抗原(lfa)與牛血清白蛋白(bsa)或卵清白蛋白(ova)，通過碳二亞胺法、活化酯法、混合酸酐法、重氮化法或戊二醛法等方法進行偶聯(lián)，制備通用半抗原-bsa偶聯(lián)物與通用半抗原-ova偶聯(lián)物；

2.制備那非類通用抗體和拉非類通用抗體：將通用半抗原-bsa偶聯(lián)物多次免疫小鼠，取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞在體外進行融合，制備雜交瘤細胞，將陽性雜交瘤細胞注入小鼠腹腔收集腹水，或以體外細胞培養(yǎng)的收集上清液的方式制備那非類通用抗體和拉非類通用抗體；

3.制備膠體金：以檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，膠體金溶液中膠體金顆粒直徑在20～40nm之間；

4.膠體金標記抗體：在膠體金溶液中加入那非類通用抗體和拉非類通用抗體，其中那非類通用抗體和拉非類通用抗體的比例為1:1，加入上述兩種抗體的量為每毫升膠體金溶液中加入1μg～20μg，加入后混勻，通過離心純化、濃縮，制備成膠體金標記的那非類通用抗體和拉非類通用抗體混合物；

5.將膠體金標記的那非類通用抗體和拉非類通用抗體混合物噴涂并固定在金標墊上，將nfa-ova偶聯(lián)物和lfa-ova偶聯(lián)物包被在檢測線上(稱作包被抗原)，將兔抗鼠或羊抗鼠igg抗體包被在控制線上，并充分干燥；

6.將硝基纖維素膜、金標墊、樣品墊、吸水墊依次粘合在pvc底板上，切成條狀，即制成檢測那非類和拉非類成分的膠體金免疫層析試紙條。

本發(fā)明所述的用于檢測那非類和拉非類成分的pde-5抑制劑膠體金免疫層析試紙條的使用方法如下：

樣品經(jīng)前處理后，用提取溶劑提取，提取溶劑為一定濃度的乙醇水溶液或磷酸鹽緩沖液或兩者混合物，得到樣品溶液。將適量樣品溶液滴加到樣品墊上，樣品溶液將會向吸水墊端移動，待一段時間后，根據(jù)檢測線和控制線的顯色情況，判斷樣品中是否含有那非類或拉非類成分，判斷方法如下：

(1)檢測線顯紅色，控制線顯紅色——陰性結(jié)果，樣品中不含那非類和拉非類成分；

(2)檢測線不顯紅色，控制線顯紅色——陽性結(jié)果，樣品中含有那非類或拉非類成分；

(3)無論檢測線顯不顯紅色，控制線不顯紅色——試紙條失效。

本發(fā)明所述的檢測那非類和拉非類成分的膠體金免疫層析試紙條的檢測原理如下：

滴加待測樣品溶液后，樣品溶液在各種膜的毛細作用下，沿著樣品墊向吸水墊端移動，移動到金標墊時，樣品溶液溶解膠體金標記的抗體，當樣品中含有待測物時，將與膠體金標記的抗體結(jié)合并一起向吸水墊端移動，到達固定有包被抗原的檢測線時，包被抗原將和待測物競爭結(jié)合膠體金標記抗體，樣品中待測物含量越高，競爭越明顯，檢測線上的包被抗原與膠體金標記抗體結(jié)合越少，當包被抗原所結(jié)合的膠體金標記抗體少于一定數(shù)量時，檢測線將不顯紅色，無論樣品中含不含有待測物，過量的膠體金標記抗體或其與待測物結(jié)合物都會與控制線的兔抗鼠或羊抗鼠igg抗體結(jié)合，形成一條紅色線，若控制線不顯紅色，則說明試紙條失效，需要重新更換試紙條進行檢測。

本發(fā)明所述的檢測那非類和拉非類成分的膠體金免疫層析試紙條具有以下優(yōu)勢：

(1)本發(fā)明首次采用檢測范圍更寬的那非類通用半抗原nfa，其具有與大部分那非類成分相似的通用結(jié)構(gòu)，制成的那非類通用抗體可對大部分那非類成分進行特異性識別，檢測范圍寬，靈敏度高；

(2)本發(fā)明首次采用拉非類通用半抗原lfa制備通用抗體，擴大了拉非類成分的檢測范圍；

(3)本發(fā)明首次將那非類通用抗體與拉非類通用抗體一起包被于金標墊上，且將nfa-ova偶聯(lián)物和lfa-ova偶聯(lián)物共同包被于檢測線，可同時對那非類和拉非類成分進行檢測，大大提高了檢測效率。

附圖說明

圖1為本發(fā)明膠體金免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例進一步詳細描述本發(fā)明的技術(shù)方案。

在本發(fā)明中，dmso為二甲基亞砜，nhs為n-羥基琥珀酰亞胺，edc為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，nfa為那非類通用半抗原，lfa為拉非類通用半抗原，pbs為磷酸緩沖鹽溶液；bsa為牛血清白蛋白。

如圖1所示：一種pde-5抑制劑膠體金免疫層析試紙條，該試紙條包括pvc底板1、樣品墊2、金標墊3、檢測線4、控制線5、硝基纖維素膜6、吸水墊7；所述樣品墊2、金標墊3、檢測線4、控制線5、硝基纖維素膜6、吸水墊7均設(shè)置在pvc底板1的上方，所述樣品墊2設(shè)置在pvc底板1的一端的邊緣，金標墊3設(shè)置在樣品墊2內(nèi)側(cè)并與樣品墊2部分重疊；吸水墊7設(shè)置在pvc底板1的另一端，硝基纖維素膜6設(shè)置在金標墊3與吸水墊7之間并分別與兩者部分重疊；檢測線4在硝基纖維素膜6上靠近金標墊3的一端，控制線5噴涂在靠近吸水墊7的一端。

進一步的，所述樣品墊2和金標墊3為玻璃纖維膜，金標墊3上包被有膠體金標記的那非類通用抗體和拉非類通用抗體混合物；

進一步的，所述檢測線4包被那非類通用半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，以及拉非類通用半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；

進一步的，所述控制線5上包被兔抗鼠或羊抗鼠igg抗體；

進一步的，所述吸水墊7為濾紙；所述那非類通用半抗原(nfa)如式ⅰ所示，所述拉非類通用半抗原(lfa)如式ⅱ所示：

本發(fā)明的具體實施例如下：

實施例1：通用半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的制備：

以nfa-bsa偶聯(lián)物的制備為例：本發(fā)明所采用的那非類通用半抗原中含有羧基基團，采用碳二亞胺法，使羧基與載體蛋白中的氨基結(jié)合反應，將那非類通用半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，具體操作如下：稱取0.1069gnfa，0.0345gnhs和0.0575gedc，溶于3mldmso中，磁力攪拌過夜，得到edc溶液。稱取0.12gbsa，溶解在5ml濃度為0.1mol/l，ph7.0的碳酸氫鈉緩沖液中，得到bsa溶液，在攪拌狀態(tài)下，將edc溶液緩慢滴加到bsa溶液中，反應過夜，所得溶液用蒸餾水于4℃透析5天，每天每隔8h換一次透析液，最后將溶液-20℃冷凍干燥，即得nfa-bsa偶聯(lián)物。

實施例2：應用實施例：

取市售壯陽類保健品(膠囊劑)約1/2粒，內(nèi)容物加入5％乙醇水溶液振蕩提取，放置分層，吸取上清液，滴加到那非類和拉非類膠體金免疫層析試紙條樣品墊上，反應5～10min，觀察檢測線和控制線的顯色情況，若檢測線和控制線均顯紅色，則結(jié)果為陰性，表明樣品中不含那非類成分和拉非類成分；若檢測線不顯紅色，控制線顯紅色，則結(jié)果為陽性，表明樣品中含有那非類或拉非類成分；若控制線不顯紅色，說明試紙條失效，需使用新的試紙條進行檢測。

實施例3：靈敏度測試：

用本發(fā)明的試紙條對9種那非類成分和3種拉非類成分進行檢測，每種成分均配制成不同的濃度，如表1所示：

表1試紙條靈敏度及特異性測試結(jié)果

結(jié)果顯示，西地那非、紅地那非、伐地那非、偽伐地那非、豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非、那紅地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非等9種那非類成分檢測結(jié)果均為陽性，最低檢測限在0.2mg/kg～2mg/kg之間3種拉非類成分中，他達拉非、氨基他達拉非、二乙氨基前他達拉非的檢測結(jié)果均為陽性，最低檢測限在0.1mg/kg～5mg/kg之間，說明本發(fā)明的試紙條可對多數(shù)那非類成分和拉非類成分進行檢測。

實施例4：特異性測試：

用本發(fā)明的試紙條對4種減肥類保健品非法添加化學成分以及5種降糖類保健品非法添加化學成分進行檢測，結(jié)果如表1所示，西布曲明、去甲基西布曲明、雙去甲基西布曲明、酚酞等4種減肥類保健品非法添加化學成分以及格列本脲、格列美脲、羅格列酮、苯乙雙胍、二甲雙胍等5種降糖類保健品非法添加化學成分的檢測結(jié)果均為陰性，說明本發(fā)明的試紙條可對壯陽類保健品中非法添加的那非類和拉非類成分進行特異性檢測，而對其它類型的成分無特異性反應。

實施例5：穩(wěn)定性測試；

將用本發(fā)明方法制作好的試紙條裝入密封袋內(nèi)，內(nèi)置干燥劑，置于45℃烘箱內(nèi)保存，分別于7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天、56天取出，檢測試紙條的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，45℃保存7天、14天、21天、28天、35天、42天，檢測結(jié)果均無明顯變化。45℃保存49天，金標墊上膠體金標記的抗體出現(xiàn)復溶現(xiàn)象，檢測線和控制線的顏色變淺，靈敏度下降。45℃保存到56天，檢測限顏色已經(jīng)很微弱。45℃保存49天，相當于常溫保存18個月。