本發(fā)明涉及一種水生動(dòng)物的標(biāo)記方法，特別是涉及曼氏無針烏賊耳石的鈣黃綠素標(biāo)記方法及其檢測手段。

背景技術(shù)：

曼氏無針烏賊(sepiellajaponica)曾是我國漁場的四大漁業(yè)之一，對(duì)溫度的適應(yīng)性較強(qiáng)，在我國沿海分布很廣，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的傳統(tǒng)漁業(yè)種類。20世紀(jì)70年代以來，由于拖網(wǎng)、張網(wǎng)等多種漁具大量捕撈幼烏賊和越冬烏賊，致使曼氏無針烏賊由生長型過度捕撈向補(bǔ)充型過度捕撈轉(zhuǎn)變，破壞了漁業(yè)資源的生態(tài)平衡，導(dǎo)致浙江漁場的曼氏無針烏賊資源近乎枯竭。自2006年以來，浙江沿海開展了曼氏無針烏賊受精卵和幼體的大規(guī)模增殖放流。而了解人工放流的烏賊卵和幼體的存活及分布情況，對(duì)曼氏無針烏賊的增殖放流效果評(píng)價(jià)至關(guān)重要。水生生物的標(biāo)志技術(shù)（markingtechnique）是研究水生生物生活史以及對(duì)其進(jìn)行資源評(píng)估的重要工具。特別是對(duì)于魚類的增殖放流，基于標(biāo)志技術(shù)的標(biāo)志增殖放流可用于研究魚類洄游和資源動(dòng)態(tài)，根據(jù)回捕地點(diǎn)記錄可推測放流魚類游動(dòng)的方向、路線、范圍和速度。此外結(jié)合回捕魚體的全長、濕重和年齡資料，推測出放流群體在野外的生長和種群變動(dòng)規(guī)律，進(jìn)而檢驗(yàn)增殖放流的效果。

耳石因其極強(qiáng)的生物惰性比利用鱗片、鰭條、鰓蓋骨等進(jìn)行年齡鑒定更加有效，耳石是最先鈣化的組織，其生長的持續(xù)性受環(huán)境影響極小，在魚體停止生長條件下仍能持續(xù)生長，因此其上的年輪更加精準(zhǔn)的表明了魚體的實(shí)際年齡。近年來，隨著魚類耳石研究的深入，耳石因其獨(dú)有的生物和化學(xué)特性逐漸成為極佳的標(biāo)記載體，越發(fā)得到廣泛應(yīng)用。利用熒光物質(zhì)能在魚類耳石上沉積的化學(xué)標(biāo)記，因其效果明顯、檢測便捷在多種魚類得以應(yīng)用。

現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號(hào)為cn101731161b的中國發(fā)明專利，公開了曼氏無針烏賊皮下熒光標(biāo)記方法專用試劑，該標(biāo)記試劑按照重量份數(shù)含有1份的茜素絡(luò)合指示劑粉末和4份至8份的酸奶。該試劑在相對(duì)集中的皮下區(qū)域形成標(biāo)記，較一般的染色標(biāo)記具有更高的可識(shí)別性，在烏賊復(fù)蘇后，無需暫養(yǎng)除去浮色，可以立即放流。但是烏賊幼體階段個(gè)體很小，注射標(biāo)記很困難，對(duì)烏賊幼體有損傷，影響其成活率，且不能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的放流標(biāo)記。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種標(biāo)記方法簡單，能達(dá)到無損標(biāo)記的目的，能夠一次性實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的放流標(biāo)記活動(dòng)，發(fā)光信號(hào)較強(qiáng)，標(biāo)記時(shí)間持久，檢測方便的曼氏無針烏賊耳石的鈣黃綠素標(biāo)記方法及其檢測手段。

本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：曼氏無針烏賊耳石的鈣黃綠素標(biāo)記方法，包括以下步驟：

養(yǎng)殖水預(yù)處理：將經(jīng)凈化的海水放入緩釋標(biāo)記養(yǎng)殖箱并微充氣，作為養(yǎng)殖水體，然后向養(yǎng)殖水體內(nèi)加入edta，每噸養(yǎng)殖水中edta的添加量為4-8g，充分溶解后備用，該步驟中的edta能與海水中游離的鈣離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成穩(wěn)定的水溶性絡(luò)合物，避免而后標(biāo)記步驟所使用的鈣黃綠素由于干擾離子而造成的損耗，確保標(biāo)記濃度穩(wěn)定及標(biāo)記效果的穩(wěn)定；

標(biāo)記浸泡液配制：將鈣黃綠素加入養(yǎng)殖水中，制成濃度為200-400mg/l的溶液，暴曬11-13h，然后再加入米賽林，鈣黃綠素與米賽林的重量比為1:0.2-0.3，混合均勻，即得標(biāo)記浸泡液，該步驟中米賽林能與鈣黃綠素、曼氏無針烏賊耳石的鈣化組織形成具有高強(qiáng)度熒光的混合配合物，比單一用鈣黃綠素標(biāo)記效果更明顯，使得耳石在后續(xù)熒光檢測時(shí)能產(chǎn)生較強(qiáng)的發(fā)光信號(hào)，方便觀察結(jié)果及對(duì)比，同時(shí)混合配合物的穩(wěn)定性更強(qiáng)，使得標(biāo)記時(shí)間更持久，且鈣黃綠素與米賽林不會(huì)影響曼氏無針烏賊貝類的存活性，該步驟中暴曬是為了恢復(fù)海水的ph，使曼氏無針烏賊能更好的在標(biāo)記浸泡液中存活；

浸泡：將待標(biāo)記的曼氏無針烏賊饑餓2-3d，然后置于標(biāo)記浸泡液中，浸泡密度為18-23尾/l，浸泡22-26h，浸泡結(jié)束后將曼氏無針烏賊放入新鮮海水浸泡清洗2-3h以除去殘余染料，繼續(xù)飼養(yǎng)，即完成對(duì)曼氏無針烏賊耳石的標(biāo)記，通過浸泡可使標(biāo)記物質(zhì)與耳石的鈣化組織形成穩(wěn)定的混合配合物，從而在耳石上生成生長標(biāo)記，這種耳石上的標(biāo)記能夠在熒光顯微鏡下被清晰地檢測觀察，該標(biāo)記方法能夠減少對(duì)魚體的操作、降低脅迫和死亡率，能達(dá)到無損標(biāo)記的目的，并且能夠一次性實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的放流標(biāo)記活動(dòng)，最大限度降低人工操作對(duì)魚苗的影響。

曼氏無針烏賊耳石的鈣黃綠素標(biāo)記方法的檢測手段：樣品采集后，將曼氏無針烏賊放入濃度80-120mg/l的麻醉劑溶液中進(jìn)行麻醉，然后用新鮮海水清洗后，再用解剖針剖取出耳石，剝離附屬組織，用蒸餾水洗滌、無水乙醇清洗、干燥，封存于載玻片上，耳石重疊的部分需要被磨制觀察，用熒光顯微鏡檢測耳石中的熒光標(biāo)記，記錄相應(yīng)的標(biāo)記清晰度即可，上述麻醉劑成分美托咪啶中右旋美托咪啶與左旋美托咪啶的質(zhì)量比為97/3-94/6。純右旋美托咪啶可快速加深全身麻醉，使曼氏無針烏賊迅速地進(jìn)入麻醉誘導(dǎo)期，但麻醉維持時(shí)間短，鎮(zhèn)痛效果差，若加大用藥量，會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定的副作用。將右旋美托咪啶與左旋美托咪啶復(fù)配而成的麻醉劑，麻醉維持時(shí)間長，且還有一定的鎮(zhèn)痛效果，為激素的包埋提供了良好的條件。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1）本發(fā)明標(biāo)記方法簡單，能夠減少對(duì)魚體的操作、降低脅迫和死亡率，能達(dá)到無損標(biāo)記的目的，并且能夠一次性實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的放流標(biāo)記活動(dòng)，最大限度降低人工操作對(duì)魚苗的影響；2）該標(biāo)記方法安全可靠、毒性極低，對(duì)曼氏無針烏賊的存活無不良影響，能形成具有高強(qiáng)度熒光的混合配合物，使得耳石在后續(xù)熒光檢測時(shí)能產(chǎn)生較強(qiáng)的發(fā)光信號(hào)，方便觀察結(jié)果及對(duì)比，同時(shí)混合配合物的穩(wěn)定性更強(qiáng)，使得標(biāo)記時(shí)間更持久；3）該標(biāo)記方法具有操作快速、簡便、穩(wěn)定可靠、成功率高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)從魚卵到魚苗、幼魚或成魚不同階段都是可行的，可為曼氏無針烏賊的增殖放流效果評(píng)價(jià)提供有效的手段。

具體實(shí)施例

下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方案作進(jìn)一步說明：

實(shí)施例1：

曼氏無針烏賊耳石的鈣黃綠素標(biāo)記方法，包括以下步驟：

1）養(yǎng)殖水預(yù)處理：將經(jīng)凈化的海水放入緩釋標(biāo)記養(yǎng)殖箱并微充氣，作為養(yǎng)殖水體，然后向養(yǎng)殖水體內(nèi)加入edta，每噸養(yǎng)殖水中edta的添加量為6g，充分溶解后備用，該步驟中的edta能與海水中游離的鈣離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成穩(wěn)定的水溶性絡(luò)合物，避免而后標(biāo)記步驟所使用的鈣黃綠素由于干擾離子而造成的損耗，確保標(biāo)記濃度穩(wěn)定及標(biāo)記效果的穩(wěn)定；

2）標(biāo)記浸泡液配制：將鈣黃綠素加入養(yǎng)殖水中，制成濃度為300mg/l的溶液，暴曬12h，然后再加入米賽林，鈣黃綠素與米賽林的重量比為1:0.25，混合均勻，即得標(biāo)記浸泡液，該步驟中米賽林能與鈣黃綠素、曼氏無針烏賊耳石的鈣化組織形成具有高強(qiáng)度熒光的混合配合物，比單一用鈣黃綠素標(biāo)記效果更明顯，使得耳石在后續(xù)熒光檢測時(shí)能產(chǎn)生較強(qiáng)的發(fā)光信號(hào)，方便觀察結(jié)果及對(duì)比，同時(shí)混合配合物的穩(wěn)定性更強(qiáng)，使得標(biāo)記時(shí)間更持久，且鈣黃綠素與米賽林不會(huì)影響曼氏無針烏賊貝類的存活性，該步驟中暴曬是為了恢復(fù)海水的ph，使曼氏無針烏賊能更好的在標(biāo)記浸泡液中存活；

3）浸泡：將待標(biāo)記的曼氏無針烏賊饑餓2.5d，然后置于標(biāo)記浸泡液中，浸泡密度為20尾/l，浸泡24h，浸泡結(jié)束后將曼氏無針烏賊放入新鮮海水浸泡清洗2.5h以除去殘余染料，最后轉(zhuǎn)移至正常水體中繼續(xù)飼養(yǎng)，期間觀察標(biāo)記引起的幼魚急性死亡率，即完成對(duì)曼氏無針烏賊耳石的標(biāo)記，通過浸泡可使標(biāo)記物質(zhì)與耳石的鈣化組織形成穩(wěn)定的混合配合物，從而在耳石上生成生長標(biāo)記，這種耳石上的標(biāo)記能夠在熒光顯微鏡下被清晰地檢測觀察，該標(biāo)記方法能夠減少對(duì)魚體的操作、降低脅迫和死亡率，能達(dá)到無損標(biāo)記的目的，并且能夠一次性實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的放流標(biāo)記活動(dòng)，最大限度降低人工操作對(duì)魚苗的影響，此外，鈣黃綠素溶液有一定的酸性，浸泡時(shí)每小時(shí)監(jiān)測cal染液ph一次，并用碳酸氫鈉進(jìn)行緩沖調(diào)節(jié)，使染液的ph維持在7.5–8.2。

曼氏無針烏賊耳石的鈣黃綠素標(biāo)記方法的檢測手段：飼養(yǎng)60天后進(jìn)行樣品采集，將曼氏無針烏賊放入濃度100mg/l的麻醉劑溶液中進(jìn)行麻醉，然后用新鮮海水清洗后，再用解剖針剖取出耳石，剝離附屬組織，用蒸餾水洗滌、無水乙醇清洗、干燥，封存于載玻片上，耳石重疊的部分需要被磨制觀察，nikonds-fi1高清數(shù)碼攝像頭的nikoneclipse50i熒光顯微鏡，并調(diào)至cal的激發(fā)光發(fā)射波長（如表1所示），觀察耳石，記錄相應(yīng)的標(biāo)記清晰度即可。

上述麻醉劑成分美托咪啶中右旋美托咪啶與左旋美托咪啶的質(zhì)量比為95/5。純右旋美托咪啶可快速加深全身麻醉，使曼氏無針烏賊迅速地進(jìn)入麻醉誘導(dǎo)期，但麻醉維持時(shí)間短，鎮(zhèn)痛效果差，若加大用藥量，會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定的副作用。將右旋美托咪啶與左旋美托咪啶復(fù)配而成的麻醉劑，麻醉維持時(shí)間長，且還有一定的鎮(zhèn)痛效果，為激素的包埋提供了良好的條件。

表1用于標(biāo)記檢測的分色鏡和濾鏡光片

實(shí)施例2：

曼氏無針烏賊耳石的鈣黃綠素標(biāo)記方法，包括以下步驟：

1）將經(jīng)凈化的海水放入緩釋標(biāo)記養(yǎng)殖箱并微充氣，作為養(yǎng)殖水體，然后向養(yǎng)殖水體內(nèi)加入edta，每噸養(yǎng)殖水中edta的添加量為5g，充分溶解后備用，該步驟中的edta能與海水中游離的鈣離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成穩(wěn)定的水溶性絡(luò)合物，避免而后標(biāo)記步驟所使用的鈣黃綠素由于干擾離子而造成的損耗，確保標(biāo)記濃度穩(wěn)定及標(biāo)記效果的穩(wěn)定；

2）將鈣黃綠素加入養(yǎng)殖水中，制成濃度為350mg/l的溶液，暴曬13h，然后再加入米賽林，鈣黃綠素與米賽林的重量比為1:0.3，混合均勻，即得標(biāo)記浸泡液，該步驟中米賽林能與鈣黃綠素、曼氏無針烏賊耳石的鈣化組織形成具有高強(qiáng)度熒光的混合配合物，比單一用鈣黃綠素標(biāo)記效果更明顯，使得耳石在后續(xù)熒光檢測時(shí)能產(chǎn)生較強(qiáng)的發(fā)光信號(hào)，方便觀察結(jié)果及對(duì)比，同時(shí)混合配合物的穩(wěn)定性更強(qiáng)，使得標(biāo)記時(shí)間更持久，且鈣黃綠素與米賽林不會(huì)影響曼氏無針烏賊貝類的存活性，該步驟中暴曬是為了恢復(fù)海水的ph，使曼氏無針烏賊能更好的在標(biāo)記浸泡液中存活；

3）將待標(biāo)記的曼氏無針烏賊饑餓2d，然后置于標(biāo)記浸泡液中，浸泡密度為22尾/l，浸泡25h，浸泡結(jié)束后將曼氏無針烏賊放入新鮮海水浸泡清洗3h以除去殘余染料，繼續(xù)飼養(yǎng)，即完成對(duì)曼氏無針烏賊耳石的標(biāo)記，通過浸泡可使標(biāo)記物質(zhì)與耳石的鈣化組織形成穩(wěn)定的混合配合物，從而在耳石上生成生長標(biāo)記，這種耳石上的標(biāo)記能夠在熒光顯微鏡下被清晰地檢測觀察，該標(biāo)記方法能夠減少對(duì)魚體的操作、降低脅迫和死亡率，能達(dá)到無損標(biāo)記的目的，并且能夠一次性實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的放流標(biāo)記活動(dòng)，最大限度降低人工操作對(duì)魚苗的影響。

曼氏無針烏賊耳石的鈣黃綠素標(biāo)記方法的檢測手段：飼養(yǎng)90天后進(jìn)行樣品采集，將曼氏無針烏賊放入濃度110mg/l的麻醉劑溶液中進(jìn)行麻醉，然后用新鮮海水清洗后，再用解剖針剖取出耳石，剝離附屬組織，用蒸餾水洗滌、無水乙醇清洗、干燥，封存于載玻片上，耳石重疊的部分需要被磨制觀察，用nikonds-fi1高清數(shù)碼攝像頭的nikoneclipse50i熒光顯微鏡，并調(diào)至cal的激發(fā)光發(fā)射波長，觀察耳石，記錄相應(yīng)的標(biāo)記清晰度即可。

實(shí)施例3：

1.標(biāo)記效果：

試驗(yàn)組為實(shí)施例1；空白組未進(jìn)行標(biāo)記，其余步驟和實(shí)施例1完全相同；對(duì)照組的標(biāo)記采用濃度為300mg/l的鈣黃綠素溶液，未加米賽林，其余步驟和實(shí)施例1完全相同。熒光標(biāo)記清晰度的等級(jí)劃分為0–5級(jí)，0級(jí)：在熒光顯微鏡下看不到任何標(biāo)記；1級(jí)：在熒光顯微鏡下能看見模糊的標(biāo)記；2級(jí)：在熒光顯微鏡下容易分辨標(biāo)記；3級(jí)：在熒光顯微鏡下能看見鮮亮的標(biāo)記；4級(jí)：在自然透射光下能看見標(biāo)記；5級(jí)：在自然透射光下能看見清晰地標(biāo)記。標(biāo)記等級(jí)≥2級(jí)，則可認(rèn)為是可以檢測到的良好標(biāo)記效果。每組選擇8條曼氏無針烏賊的耳石進(jìn)行檢測，取平均值，檢測結(jié)果如表2所示。

2.死亡率：從標(biāo)記開始到采集樣品，統(tǒng)計(jì)曼氏無針烏賊的死亡率，結(jié)果如表2所示。

表2標(biāo)記檢測結(jié)果

由上表可知，本發(fā)明實(shí)施例2的標(biāo)記方法清晰度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白組和對(duì)照組，說明本發(fā)明實(shí)施例1具有良好的標(biāo)記效果，方便觀察結(jié)果；死亡率均為0，說明本發(fā)明標(biāo)記方法安全可靠，對(duì)曼氏無針烏賊的生長無不良影響。

本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進(jìn)行贅述。

以上所述的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。