本發(fā)明屬于一種定量檢測parp(聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶)活性的技術(shù)，涉及石墨烯復(fù)合材料在臨床檢測的應(yīng)用，具體涉及石墨烯復(fù)合材料定量檢測生物酶的應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

parp，也稱聚adp-核糖聚合酶，是一類存在于絕大多數(shù)真核生物中能催化多聚adp核糖基化的細(xì)胞核酶，結(jié)構(gòu)主要包括三個(gè)區(qū)域：dna結(jié)合域、自身修飾域、催化域。parp能夠結(jié)合各種dna結(jié)構(gòu)和核小體，并且具有nad⁺依賴的催化活性，可在目標(biāo)蛋白上合成聚(adp-核糖)聚合物。聚(adp-核糖)聚合物的形成顯著改變了受體蛋白的電荷特性，引發(fā)了dna損傷的控制和修補(bǔ)過程。parp在基因穩(wěn)定和腫瘤的發(fā)生發(fā)展、炎癥和應(yīng)激反應(yīng)、代謝和能量消耗、晝夜節(jié)律等方面都起重要的調(diào)節(jié)作用。而且parp在惡性腫瘤與正常組織中的表達(dá)存在有差異性，且這種差異性有可能在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。近幾年，parp在dna損傷修復(fù)和維持基因組的穩(wěn)定性的作用引起世人的關(guān)注。在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用抑制劑抑制parp參與介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞dna損傷修復(fù)，更是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。

parp活性檢測的傳統(tǒng)技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫法，使用抗-par的單克隆抗體、hrp標(biāo)記的羊抗鼠1gg二抗，建立檢測沉積在免疫組蛋白上的par的比色方法或化學(xué)發(fā)光方法；或者采用放射性nad⁺的方法來測定了parp的酶活性。但此類方法有的需要標(biāo)記，具有成本高、需要樣品量較大、靈敏性差、檢測時(shí)間長的缺點(diǎn)，而且有時(shí)候會(huì)得到假陽性結(jié)果。目前，hergenrother等采用化學(xué)定量nad⁺的方法間接測定了parp-1的酶活性，可用于小分子抑制劑的高通量篩查；并合成了adp-ribose-pnp顯色底物，發(fā)展了簡單、靈敏的比色方法來評(píng)價(jià)parp的活性。然而，這種方法需要繁瑣的合成。因此，該方法存在很多局限性。

近年來，為解決parp分析方法的弊端，研究者們已經(jīng)開發(fā)了許多簡單、可執(zhí)行的分析方法并將之應(yīng)用到parp活性的檢測中，例如比色檢測、熒光檢測、電化學(xué)檢測等。例如，湖南大學(xué)聶舟教授利用par對(duì)熒光蛋白scgfp與陽離子聚合物ccp間熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的調(diào)節(jié)作用，建立了parp活性的熒光檢測方法；南京師范大學(xué)戴志暉教授利用六氨合釕做指示劑，根據(jù)par靜電吸附六氨合釕的量建立了parp的電化學(xué)檢測新方法；南京大學(xué)李根喜教授利用parp引起修飾有輔酶nad金膠的聚集，建立了parp活性的比色檢測法。受以上方法的啟發(fā)，我們建立了一種基于hemin-石墨烯復(fù)合材料比色檢測parp活性的方法。此方法無需標(biāo)記，易操作，而且與上述的比色方法相比，具有穩(wěn)定性高、檢測線低、檢測范圍廣的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的問題，提供了一種基于hemin-石墨烯復(fù)合材料分析檢測parp活性的方法。本發(fā)明中利用parp催化合成的聚adp核糖鏈帶有大量的負(fù)電，會(huì)使在一定鹽濃度下的h-gns發(fā)生分散程度的變化。在tmb和h2o2存在下，通過得到的顯色程度不同的變化來測定parp活性。它具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、無標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種基于hemin-石墨烯復(fù)合材料分析檢測parp活性的方法，包括以下步驟：

(1)選取激活dna激活parp(聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶)；

(2)合成h-gns(hemin-石墨烯)復(fù)合材料；

(3)將激活dna、parp、nad+(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)混合反應(yīng)，合成了帶大量負(fù)電荷的par(聚adp-核糖)聚合物；

(4)將所述h-gns復(fù)合材料與所述par聚合物混合反應(yīng)，加入鹽溶液，記錄h-gns與par聚合物產(chǎn)物的團(tuán)聚變化；

(5)利用紫外-可見光譜儀對(duì)步驟(4)獲得的產(chǎn)物溶液進(jìn)行定量檢測。

作為本發(fā)明改進(jìn)的技術(shù)方案，還可以采用如下技術(shù)措施：步驟(1)中所述激活dna的序列選自上海生物工程有限公司：

單鏈dna1：5’-cccgtgcgtgcgcgagtgagttggtgtgtgtgtgtgtgtgt-3’

單鏈dna2：5’-caactcactcgcgcacgcacggg-3’

形成激活雙鏈dna的方法為：激活dna單鏈在95℃水浴反應(yīng)3-10分鐘后，冷卻至室溫，形成雜交的雙鏈dna，所述雙鏈dna與所述parp進(jìn)行反應(yīng)，以激活parp的活性。

作為本發(fā)明改進(jìn)的技術(shù)方案，還可以采用如下技術(shù)措施：所述步驟(2)具體如下：稱取10mg氧化石墨溶于10-40ml二次水中所述氧化石墨的濃度為0.2-1mg/ml，超聲分散2～4h進(jìn)行機(jī)械剝離，2000～4000rpm轉(zhuǎn)速下離心20～30min，除去未剝離的氧化石墨，取上清液在透析袋(mw：8000～12000)中透析一周除去雜質(zhì)小分子得分散均勻的氧化石墨烯；將上述氧化石墨烯溶液與10-40ml溶于0.1mnaoh溶液的hemin在燒瓶中充分混合，所述hemin的濃度為0.2-1mg/ml；之后緩慢加入150～200μl氨溶液，最后加入20～50μl水合肼，劇烈攪拌混合溶液30～60min，將燒瓶置于60℃水浴中反應(yīng)3～24h，得到穩(wěn)定分散的黑色溶液；將上述黑色溶液在12000～13000rpm轉(zhuǎn)速下離心30～60min得黑色沉淀物，水洗3～5次得到容易重新分散在水中的h-gns復(fù)合材料。

作為本發(fā)明改進(jìn)的技術(shù)方案，還可以采用如下技術(shù)措施：所述步驟(3)具體如下：用反應(yīng)緩沖溶液將所述parp配置成不同的濃度，在含有所述激活dna、所述nad⁺的反應(yīng)緩沖溶液中滴加不同濃度的parp，于30～38℃條件下反應(yīng)1～2h。

作為本發(fā)明改進(jìn)的技術(shù)方案，還可以采用如下技術(shù)措施：所述激活dna濃度為100～200nm。

作為本發(fā)明改進(jìn)的技術(shù)方案，還可以采用如下技術(shù)措施：所述nad⁺濃度為100～500μm。

作為本發(fā)明改進(jìn)的技術(shù)方案，還可以采用如下技術(shù)措施：所述反應(yīng)緩沖溶液為含有kcl、mgcl2、zn(oac)2的ph7.2～7.4的50mmtris-hcl，所述kc1初始濃度為50mm，mgcl2初始濃度為2mm，zn(oac)2初始濃度為50μm。

作為本發(fā)明改進(jìn)的技術(shù)方案，還可以采用如下技術(shù)措施：所述步驟(4)具體如下：將所述h-gns復(fù)合材料加入到所述parp催化反應(yīng)合成的所述par聚合物混合反應(yīng)溶液中，反應(yīng)20～40min，之后加入nacl溶液，在20～30℃條件下反應(yīng)30～50min，離心取上層清液加入到磷酸緩沖溶液中，在tmb和h2o2存在下，對(duì)其溶液進(jìn)行記錄和紫外-可見光譜檢測。

作為本發(fā)明改進(jìn)的技術(shù)方案，還可以采用如下技術(shù)措施：所述磷酸緩沖溶液為ph5～6的25～50mm的磷酸緩沖溶液。

作為本發(fā)明改進(jìn)的技術(shù)方案，還可以采用如下技術(shù)措施：所述nacl的濃度為0.01～1.0m，所述tmb和h2o2的最終濃度分別為0.1～1.0mm和5～30mm。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明無需標(biāo)記，簡化了檢測方法，避免了標(biāo)記dna探針而導(dǎo)致檢測成本高、操作煩瑣，重現(xiàn)性差的缺陷。

(2)本發(fā)明利用hemin-石墨烯復(fù)合材料具有內(nèi)在的類過氧化氫酶活性、在鹽溶液中具有可調(diào)控的分散性，而且通過ii-ii作用可吸附單鏈dna，是一種具有很大潛力的檢測材料。

(3)本發(fā)明有效利用了納米材料的特性，不需要借助精密儀器檢測，簡化了檢測方法，極大地降低了病毒檢測成本，本發(fā)明具有成本低、快速、簡便、敏感且特異性好的優(yōu)點(diǎn)。

(4)本方法可成功檢測加入血清中的parp的活性，具有一定的臨床意義。

附圖說明

圖1基于h-gns比色檢測parp活性的流程圖。

圖2顯示了h-gns紫外吸收光譜表征圖：a.hemin紫外吸收曲線，b.氧化石墨紫外吸收曲線，c.h-gns紫外吸收曲線。

圖3h-gns的溶解度與nacl溶液濃度(mol)的關(guān)系圖。

圖4顯示了端粒酶活性檢測實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證圖：a.h-gns與parp、nad⁺混合溶液的紫外吸收強(qiáng)度；b.h-gns與parp、dsdna混合溶液的紫外吸收強(qiáng)度；c.h-gns與dsdna、nad⁺的紫外吸收強(qiáng)度；d.parp催化合成的產(chǎn)物與h-gns混合時(shí)的紫外吸收強(qiáng)度。

圖5顯示了檢測parp活性的紫外吸收值變化圖：a.在不同的parp濃度下，得到的紫外-可見光曲線圖(parp濃度(u，1u＝45ng)：(a)0(b)0.05(c)0.1(d)0.3(e)0.5(f)0.75(g)1(h)2(i)3；b.紫外吸收強(qiáng)度與parp濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及紫外吸收強(qiáng)度與parp濃度之間的線性關(guān)系；從圖中可以看出parp在0.05u到1u呈良好的線性關(guān)系。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明。

本實(shí)驗(yàn)中用到的試劑和儀器：

parp(聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶)，nad⁺(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)，hemin(氯化血紅素)，tmb(3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺)，h2o2，水合肼，氨水，nacl，紫外-可見光光譜儀。

激活dna序列(選自上海生物工程有限公司)：

單鏈dna1：5’-cccgtgcgtgcgcgagtgagttggtgtgtgtgtgtgtgtgt-3’

單鏈dna2：5’-caactcactcgcgcacgcacggg-3’

實(shí)施例1：

基于h-gns復(fù)合材料分析檢測parp活性的分析方法，檢測步驟是：

h-gns復(fù)合材料合成步驟：稱取10mg氧化石墨溶于20ml二次水中(0.5mg/ml)，超聲分散2h進(jìn)行機(jī)械剝離，3000rpm離心30min，除去未剝離的氧化石墨，取上清液在透析袋(mw：8000-12000)中透析一周除去雜質(zhì)小分子得分散均勻的氧化石墨烯。將所得氧化石墨烯溶液與20ml溶于0.1mnaoh溶液的hemin(0.5mg/ml)在燒瓶中充分混合。完成之后，緩慢加入200μl氨溶液，最后加入30μl水合肼。劇烈攪拌混合溶液60分鐘，把燒瓶置于水浴中(60℃)反應(yīng)20h，得到穩(wěn)定分散的黑色溶液。將所得黑色溶液在13000rpm離心30分鐘得黑色沉淀物，水洗三次得到h-gns。得到的h-gns能很容易地重新分散在水中。

dna雜交步驟：在dna雜交緩沖溶液(10mmtris-hcl，ph7.4，0.1mnacl)中加入兩條激活dna單鏈，95℃水浴5分鐘慢慢冷卻至室溫，形成雜交的激活dna。

parp催化合成par的步驟：用反應(yīng)緩沖溶液將parp配置成不同的濃度，在含有激活dna、nad⁺的反應(yīng)緩沖溶液(50mmtris-hcl，ph7.4，50mmkcl，2mmmgcl2，50μmzn(oac)2)中滴加0.1uparp，37℃反應(yīng)1h。

parp活性檢測步驟：取150μl50μg/mlh-gns復(fù)合材料加入到已生成par的溶液中，加入0.4mnacl溶液，在28℃反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后，離心，取上層清液加入到磷酸緩沖溶液(25mmph5.0)中，在0.8mmtmb和25mmh2o2存在下，對(duì)其溶液進(jìn)行記錄和紫外-可見光譜檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4d顯示，parp在0.05～1u呈良好的線性關(guān)系，檢測限為0.034u。

參考例

氧化石墨紫外吸收曲線，hemin紫外吸收曲線和h-gns紫外吸收曲線分別如圖2a-c所示。

對(duì)比例

為了證明激活dna對(duì)parp活性測試的必須性，進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)測試，與實(shí)施例1不同的是，在其他條件不變的情況下，在缺少激活dna時(shí)進(jìn)行parp的紫外吸收(也就是進(jìn)行h-gns與parp、nad⁺混合溶液的紫外吸收)，測試結(jié)果如圖4a所示。

為證明nad⁺對(duì)parp活性測試的必須性，進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)測試，與實(shí)施例1不同的是，在其他條件不變的情況下，在缺少nad⁺時(shí)進(jìn)行parp的紫外吸收(也就是進(jìn)行h-gns與parp、激活dna混合溶液的紫外吸收)，測試結(jié)果如圖4b所示。

缺少反應(yīng)檢測物parp得空白實(shí)驗(yàn)測試紫外吸收測試結(jié)果如圖4c所示。

實(shí)施例2

與實(shí)施例1不同的是：選用不同濃度的parp(u，1u＝45ng)：(a)0(b)0.05(c)0.1(d)0.3(e)0.5(f)0.75(g)1(h)2(i)3，得到的紫外-可見光曲線如圖5所示，可見，在0-3u范圍內(nèi)parp在0.05u到1u呈良好的線性關(guān)系。

綜上可見，h-gns復(fù)合材料可以定量檢測parp，緣于h-gns復(fù)合材料具有內(nèi)在的類過氧化氫酶活性、在鹽溶液中具有可調(diào)控的分散性，有效利用了納米材料的特性，不需要借助精密儀器檢測，簡化了檢測方法，極大地降低了病毒檢測成本，本發(fā)明可成功檢測加入血清中的parp的活性，具有良好的臨床意義。

盡管上面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了描述，但本發(fā)明不局限于上述具體的實(shí)施方式，上述具體的實(shí)施方式僅僅是示意性的，并不是限制性的，本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨和權(quán)利要求所請(qǐng)求保護(hù)的范圍情況下，還可以作出多種衍生形式，這些構(gòu)思均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。